专利名称：抗hiv-1外膜嵌合蛋白的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到抗HIV-1外膜蛋白的单克隆抗体及其制备。
背景技术：
艾滋病(AIDS)目前已成为威胁人类健康和社会稳定发展最重要的感染性疾病之一。自从 20世纪80年代早期首次报道该病例以来，人们对于它的发病机制已经进行了相当深入的研 究。自从AIDS发现迄今已有20年仍没有一种有效预防性疫苗，HIV对研制疫苗不利的特点 最主要是无法刺激机体产生有效的中和抗体和特异的细胞免疫，所以，HIV-1感染的预防和 控制对人类来说仍然是一个未解的难题。HIV-1为单链RNA病毒，属于逆转录病毒科 (Retroviridae)，慢病毒亚科(Lentivirus)。该病毒为圆形或椭圆形，直径约90-140nm，外 层为类脂包膜，表面有锯齿样突起，内有圆柱状核心，病毒的包膜是糖蛋白gpl60(由gpl20 和gp41组成)，为该病毒的结构蛋白，其中gpl20为外膜蛋白，gp41为跨膜蛋白 (trans-membran印rotein) 。 gpl20与CD4结合后相互作用，引起gpl20发生一系列构象变化， 进而形成高亲和力的CCR5/CXCR4结合位点，协助HIV-1进入宿主细胞。目前的许多研究表明， 针对该病毒的中和表位主要存在于gpl60。血液中存在HIV的抗体是机体被HIV感染的标志， 也是目前血清学检测HIV感染的依据。研究表明主要针对包膜蛋白前体(HIV-lgpl60)及 其后加工产物一外膜 唐蛋白(HIV-lgp120)和跨膜糖蛋白(HIV-lgp41)产生的抗体在人体感 染后不久便可以出现并可维持终生，而且几乎出现在所有感染者的血清中，Erw蛋白成为免 疫学诊断的首选抗原。由于Erw蛋白较大，在大肠杆菌中进行表达会比较困难，因此我们打 算选择几段抗原区进行嵌合表达，以提高免疫原性。另外，单克隆抗体的制备所需要抗原的 纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。
gpl20上有细胞病毒受体CD4分子的结合位点及多个免疫反应决定簇，其中V1、 V2、 V3， 尤其是V3区的顶端转角区域，含有主要的抗原决定簇，可诱导中和抗体和CTL反应。V4与 V5环之间的C4区是结合CD4分子的主要区域，这是外膜蛋白上另一个重要的中和部位，由 其诱导产生的抗体能与大多数毒株具有交叉中和作用。其它保守区(如C2、 C3、 C5甚至C1) 均含有与CD4结合作用有关的区域。从氨基酸序列比对可知469-511aa位于印12Q的C4区，
3因此我们选择了这一段保守性和抗原性都很强的区域。包膜蛋白上的C5区(538-576)，是 gpl20蛋白的C-末端区，此处氨基酸序列相对保守，577-600aa属于gp41 N-端区域，在gpl20
和gp4i的交界区含有的46个氨基酸残基不仅含有大量的e转角，而且亲水性相当好，加之
保守程度高，因而被认为是高免疫原性区，针对该区域的抗体代表了免疫印迹所能检测的几 乎所有gpl20的抗体，而且与感染者的临床症状无关，根据该区段设计合成的多肽能检测出 高达90%的HIV-1阳性血清。鉴于gp41的序列保守性比gpl20强，含有多个B细胞抗原表 位，针对gp41的基因序列可以具有更广泛的特异性，在HV检测中也作为一项指标。
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到抗HTV-1外膜蛋白的单克隆抗体，利用选定 的抗原表位，然后再根据抗原的免疫原性去诱导抗体的产生。用己经确定的抗原位点制备单 克隆抗体， 一方面是操作简便，位点分析明确；另一方面是某些小抗原的抗原性很强，单独 与抗体就会有很强的抗原抗体结合反应。本发明通过原核表达体系，选择469-511aa， 538-674aa， 700-734aa这三处抗原位点较多，免疫原性较强的区域，表达抗原，得到检测灵 敏度高、特异性好优势抗原用于制备抗HIV-1外膜蛋白的单克隆抗体。构建抗HIV-1单克隆 抗体，进一步用于HIV-l感染的诊断和治疗。
发明内容
本发明的目的是编码HIV—1外膜蛋白的二段基因和由此推断的氨基酸序列；提供含有所 表述的HIV—1外膜基因的表达载体和利用该载体转化的工程菌株；同时提供所表述的工程菌 制备重组HIV—1外膜蛋白的过程，提供制备抗HIV-1外膜蛋白的单克隆抗体的过程。
本发明的是编码HIV—1外膜蛋白的469-511aa， 538-674aa， 700_734aa这三处抗原位点 较多，免疫原性较强的区域的基因，该基因由630个碱基组成。 HIV—1外膜蛋白的三段基因的核苷酸序列为
HIV—1外膜嵌合蛋白的三段基因的核苷酸序列为
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上述HIV--l外膜嵌合蛋白的三段基因的氨基酸序列为
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(*终止密码子) HIV—1外膜蛋白的制备方法包括以下步骤 第一步HIV—l外膜基因的获得
选择Env蛋白的组成氨基酸的疏水性、潜在的抗原表位以及与其它亚型的Env蛋白在氨 基酸组成上的保守性程度，选择免疫原性较强的区域，该基因由630个碱基组成。三段基因 经PCR引入的酶切位点后连接到T-easy载体中。
第二步HIV — l外膜基因的原核表达载体的构建
T-easy经酶切后回收外源基因片段，将外源基因片段与载体pRSET B在T4 DNA连接酶 的作用下连接。获得重组质粒pRSET B-朋y。 第三步HIV—l外膜蛋白的诱导表达
5将构建好的重组质粒pRSETB —朋y转化到宿主菌BL21中，经IPTG诱导表达，获得的转 化菌株为BL21-e/ K。
第四步HIV—1外膜蛋白的纯化
pRSET B表达的融合蛋白N-端为6个连续的组氨酸(His)，利用多聚组氨酸与过渡态金 属(M + 、 Zn十+ 、 Cu +十等)的高亲和力结合，可使用金属离子配体亲和层析进行快速纯 化表达的蛋白。
第五步制备重组的单克隆抗体
选择免疫8周龄的BALB/c健康小鼠，经脾细胞和骨髓瘤细胞融合获得稳定分泌抗Env蛋 白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
通过基因工程获得的HIV-1外膜嵌和蛋白，具有良好的疫原性，在检测HIV阳性血清时， 特异性和准确性均达到100%，说明抗原在检测阳性样品时结果比较好、抗原覆盖率较高。 同目前国内外市场上的HIV检测产品比较，具有成本低，灵敏度高，检测快的特点。由此抗 原制备的抗HIV-1外膜嵌和蛋白单克隆抗体，可以进一步用于HIV-1感染的诊断和治疗，特别 是HIV-1的导向治疗，将HIV-1抗原的单克隆抗体与化疗药物，利用单克隆抗体的导向作用， 将药物携带至靶器官，直接杀伤靶细胞因此，制备HIV-1单克隆抗体是一种极具应用潜力的 抗体形式。
抗HIV-1外膜蛋白的单克隆抗体，可以用基因工程手段发酵生产，价格低，易于普及应 用，可进一步用于HIV-1感染的诊断和治疗。
附图为SDS-PAGE分析Env蛋白的蛋白的表达
1. 通过Ni-sepharose 4B金属M螯合层析柱分离纯化目的蛋白；
2. 分子量标准.
具体实施方案
本发明的实施包括以下内容
第一步HIV—1外膜嵌合基因的获得
我们用计算机分析了 Env蛋白的组成氨基酸的疏水性、潜在的抗原表位以及与其它亚型 的Env蛋白在氨基酸组成上的保守性程度，以此作为选择三段抗原的理论依据。选择HIV—1 外膜蛋白的469-511aa， 538-674aa， 700-734aa这三处抗原位点较多，免疫原性较强的区域，该基因由630个碱基组成。
第二步HIV—1外膜基因的原核表达载体的构建
连入T-easy载体上的三段抗原通过PCR引入酶切位点，以T-easy-e/7K质粒 为模板，经PCR扩增出630bp左右的目的片段。PCR产物经胶回收纯化后连入pGEM—Teasy 载体，蓝白斑筛选，挑白斑提质粒后用5"s7I/vTp/7l双酶切鉴定。质粒经作用后回 收外源基因片段，pRSET B用Sacl和7TpM双酶切，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接。得 到正确的原核表达重组质粒pRSET B —朋k,对重组质粒进行测序。
第三步HIV—1外膜蛋白的诱导表达
含有pRSETB—e/ F重组质粒的大肠杆菌BL21 (star)，经工PTG (终浓度为lmM)诱导后， 上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果发现大量的目的蛋白是以不可溶的包涵体形式存 在，只有少量的目的蛋白是以可溶的形式存在于菌体破碎离心后的上清液里,蛋白的分子量约 为33KD。为了进一步确定蛋白的特异性，以HIV-1阳性病人血清为一抗，碱性磷酸酶标记 的羊抗人抗体为二抗，对表达产物进行Western Blot分析，得到的特异性蛋白的分子量约 为33kD的蛋白，从上述实验结果发现，嵌合抗原是可以在原核表达系统中表达，表达量高且 蛋白具有特异性。
第四步HIV—1外膜蛋白的纯化
pRSET B表达的融合蛋白N-端为6个连续的组氨酸(His)，利用多聚组氨酸与过渡态金 属(Ni + 、 Zn+ + 、 Cu +十等)的高亲和力结合，可使用金属离子配体亲和层析进行快速纯 化。应用Ni-NTA s印harose金属Ni螯合层析介质，对其目的蛋白进行纯化，纯化后的蛋白 用考马斯亮蓝染色，结果表明蛋白表达量高，纯化效果好。附图见附页。
第五步制备抗人erw的单克隆抗体
纯化的重组Env蛋白30ng免疫8周龄雌性的BALB/c健康小鼠，分别在14天、35天以 等量抗原免疫，第48天用间接ELISA法检测鼠尾血，对免疫好的鼠在第56天加强免疫，三 天后取其脾细胞进行融合，首次使用弗氏完全佐剂，其余使用不完全佐剂。
将免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按5: l混合，1200rpm离心5min，弃上清，置37"水 浴中，加入lml PEG使细胞彼此融合。随后用50ml预热RPMI1640不完全培养稀释。8Q0rpm 离心5min，弃上清，加入足量的HAT培养基重新悬浮，置37。C培养，IO天换新鲜的HAT培养 基，12天改用HT培养基，15天改用完全培养基，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首 先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的 ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养、冻存。
权利要求
1、抗HIV-1外膜嵌合蛋白的单克隆抗体，其特征是在HIV—1外膜蛋白的469-511aa，538-674aa，700-734aa这三处抗原位点较多，免疫原性较强的区域的基因，该基因由630个碱基组成，HIV—1外膜嵌合蛋白的三段基因的核苷酸序列为atg agg gac aat tgg aga agt gaa tta tat aaa tat aaa gta gta aaa 48att gaa cca tta gga gta gca ccc acc aag gca aag aga aga gtg gtg 96cag aga gga aaa aga gca gtg gga ata gga tct aga caa ttg ttg tct 144ggt ata gtg cag cag cag aac aat ttg ctg agg gct att gag gcg caa 192cag cat ctg ttg caa ctc aca gtc tgg ggc atc aag cag ctc cag gca 240aga atc ctg gct gtg gaa aga tac cta aag gat caa cag ctc ctg ggg 288att tgg ggt tgc tct gga aaa ctc att tgc acc act gct gtg cct tgg 336aat gct agt tgg agt aat aaa tct ctg gaa cag att tgg aat cac acg 384acc tgg atg gag tgg gac aga gaa att aac aat tac aca agc tta ata 432cac tcc tta att gaa gaa tcg caa aac cag caa gaa aag aat gaa caa 480gaa tta ttg gaa tta gat aaa tgg gca agt ttg tgg aat tgg ttt aac 528ata aca aat tgg ctg gtg aat aga gtt agg cag gga tat tca cca tta 576tcg ttt cag acc cac ctc cca acc ccg agg gga ccc gac agg ccc gaa 624gga tag 630上述HIV—1外膜嵌合蛋白的三段基因的氨基酸序列为Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val LysIle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val ValGln Arg Gly Lys Arg Ala Val Gly Ile Gly Ser Arg Gln Leu Leu SerGly Ile Val Gln Vln Vln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala GlnGln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln AlaArg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu GlyIle Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro TrpAsn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His ThrThr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser LeuIleHis Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu GlnGlu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe AsnIle Thr Asn Trp Leu Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro LeuSer Phe Gln Thr His Leu Pro Thr Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro GluGly**终止密码子。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到抗HIV-1外膜嵌合蛋白的单克隆抗体及其制备。根据蛋白的疏水性和保守性分析选定抗原基因，再根据抗原的免疫原性去诱导产生抗体，用已经确定的抗原位点制备单克隆抗体。一是操作简便，位点分析明确；二是某些小抗原的抗原性很强，单独与抗体就会有很强的抗原抗体结合反应。本发明选择HIV-1外膜基因的三处抗原位点较多，免疫原性较强的区域，通过原核表达体系表达抗原蛋白，得到检测灵敏度高、特异性好优势抗原用于制备抗HIV-1外膜嵌合蛋白的单克隆抗体。抗HIV-1外膜蛋白的单克隆抗体，可以用基因工程手段发酵生产，价格低，易于普及应用，可进一步用于HIV-1感染的诊断和治疗。
文档编号C07K16/08GK101440129SQ200810051640
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者维 孔, 彬 王, 王会堂, 赵丽辉 申请人:长春理工大学