专利名称：：林蛙抗菌肽及制备工艺和在抗病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
：-本发明提供一种林蛙抗菌肽，同时还提供了该抗菌肽的制备工艺，本发明还进一步公开了该抗菌肽在制备抗病毒药物中的用途，属于生物化学与生物制药
技术领域：
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背景技术：
：很多两栖类动物在中国属于传统重要和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufogargarizans)、大蹼铃蜍(Bombinamaxima)、黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有光谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点。我国对两栖类药物的应用有着悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质研究不多。
发明内容-本发明的目的在于提供一种林蛙抗菌肽，具有生物活性。本发明的目的还在于提供一种林蛙抗菌肽的制备方法，适用于工业化生产。本发明最终公开了在制备抗病毒药物中的应用，特别是该多肽在治疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病药物中的应用。本发明的林蛙抗菌肽，具有以下特征是一种碱性多肽，分子量范围在2-16KDa之间，等电点为8.9-9.5;氨基酸组成为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、Val、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸。其中碱性氨基酸占总量的23.99%，酸性氨基酸占总量的19.08%。本发明的林蛙抗菌肽的制备方法是(1)将林蛙干蛙皮，用pH4.00.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液以料液比为l:8~12(m/v)的比例室温浸泡2030h;将所得浸提液5000r.p.m离心30min，弃沉淀，留上清；(2)将上清液煮沸5min，冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。根据凝胶层析法测定蛋白质的相对分子量的基本原理，选用V12(MW1.3KDa)、胰岛素P链(MW3.3KDa)、胰岛素(MW5.7KDa)和细胞色素C(MW13KDa)和胰蛋白酶抑制剂(MW2.01KDa)作为标准蛋白测定抗菌肽分子量范围。将抗菌肽酸水解，进行氨基酸组成分析，采用氨基酸测序仪进行测定。上述林蛙抗菌肽的抗病毒活性采用体外细胞实验法进行，实验结果表明本发明的林蛙抗菌肽具有显著的抑制流感病毒、乙型肝炎病毒及艾滋病病毒，可用于制备治疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病治疗的药物。本发明的积极效果在于林蛙抗病毒抗菌肽是从天然资源得到的产物，具有很好的抗病毒能力，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可用于制备抗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病的药物。利用我国两栖类动物资源，为制备抗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病药物提供了新的选择。图l:林蛙抗菌肽分子量分布范围图；图2:林蛙抗菌肽氨基酸组成分析图。Tab.1Themolecularweightofstandardprotein=41.4ml_胰g白德抑制剂细胞色素C胰岛索胰岛繁B链V12MI,20.1135.73.31.3,4.304.113.763,523.11Fe(ml)4L470165.2195.8248,6_1.000_1.8423.9904.7306.004根据公式lgl#—-"一&丄式中M—分子量，KDa;Fe—洗膜体积，ml;Fff—外水体积，ml。以K/Fo为横坐标，/gM为纵坐标制作标准曲线，并计算出各组分分子量。第一组分=59.0mlFe/Fo=1.426，/gM=4.201根据标准曲线得MW=15.9KDa第五组分Fe=218.3ml7e/Ko=5.272，/gM=3.302根据标准曲线得MW=2KDa由以上结果可知，此林蛙抗菌肽分子量范围在2-16KDa之间。Tab.2Theaminoacidofantimicrobialpeptide戮基;黢名称氨蘂薩符号氣蘂酸的含量(mg*ml")2.453543.570531.065211.890931.0144S3.253981.539783.160982.748651.498591.22552■2.12-3671.218771.36102■3-44993由上表可知，在抗菌肽氨基酸组成中，碱性氨基酸占氨基酸总量的23.99%，酸性氨基酸氨基酸总量的19.08%。具体实施方法-下面实施例用来进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。实施例l:(一)林蛙抗菌肽的制备5天冬m酸Asp谷敏酸Glu丝弒酸Ser组氣酸His精氣酸Arg甘鎩酸Gly苏银黢Thr鱸鳜酸Pro丙氣黢Ala.缬银酸锡甲硫鎩:酸Me言.异亮M酸lie亮缀騣Leu色氨酸Trp苯丙缀:黢Phe赖缀黢Lys半胱缀黢C，(1)称取20g的林蛙干蛙皮，用200mlpH4.00.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液浸泡24h。(2)将所得浸提液5000r.p.m离心30min,弃沉淀，留上清。将上清液煮沸5min，冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。于4'C条件下保存备用o(3)根据凝胶层析法测定蛋白质的相对分子量的基本原理，选用V12(MW1.3KDa)、胰岛素P链(MW3.3KDa)、胰岛素(MW5.7KDa)和细胞色素C(MW13KDa)和胰蛋白酶抑制剂(MW2.01KDa)作为标准蛋白，与纯化样品混合溶解后上SephadexG-25柱，测各组分洗脱体积。以Ve/VO为横坐标，lgM为纵坐标制作标准曲线，并计算出各组分分子量(见附图l)。(4)林蛙抗菌肽氨其酸组成分析将抗菌肽酸水解，进行氨基酸组成分析，采用氨基酸自动分析仪进行测定(见附图2)。(二)林蛙抗菌肽抗病毒实验(1)林蛙抗菌肽抗流感病毒的实验在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，流感病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3X104个C8166细胞和200TCIDs。的流感病毒，每孔的总体积为200vL。置37。C，5°/￡02培养箱内培养。感染后第二天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数流感病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC50是对50y。宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。(2)林蛙抗菌肽抗乙型肝炎病毒的实验在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl,同时设置正常细胞对照，乙型肝炎病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3X104个C8166细胞和300TCIDs。的乙肝病毒，每孔的总体积为200vL。置37'C，5%0)2培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数乙肝病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC50是对50y。宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。G)林蛙抗菌肽抗艾滋病病毒的实验在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行2倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl,同时设置正常细胞对照，艾滋病病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3X1()4个C8166细胞和200TCID5。的艾滋病病毒，每孔的总体积为200vL。置37'C，5°/。0)2培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数艾滋病病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC50是对50。/。宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。表l林蛙抗菌肽抑制流感病毒增殖的作用-<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2林蛙抗菌肽抑制乙型肝炎病毒增殖的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3林蛙抗菌肽抑制艾滋病病毒增殖的作用-<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述实验表明本发明的林蛙抗菌肽具有显著的抑制流感病毒、乙型肝炎病毒及艾滋病病毒，可用于制备治疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病治疗的药物。实施例2:(一)林蛙抗菌肽的制备-(1)称取10g的林蛙干蛙皮，用120mlpH4.00.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液浸泡30h。(2)将所得浸提液5000r.p.m离心30min,弃沉淀，留上清。将上清液煮沸5min，冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。于4。C条件下保存备用。(3)根据凝胶层析法测定蛋白质的相对分子量的基本原理，选用V12(MW1.3KDa)、胰岛素P链(MW3.3KDa)、胰岛素(MW5.7KDa)和细胞色素C(MW13KDa)和胰蛋白酶抑制剂(MW2.01KDa)作为标准蛋白，与纯化样品混合溶解后上SephadexG-25柱，测各组分洗脱体积。以Ve/V0为横坐标，lgM为纵坐标制作标准曲线，并计算出各组分分子量(见附图l)。(4)林蛙抗菌肽氨其酸组成分析将抗菌肽酸水解，进行氮基酸组成分析，采用氨基酸自动分析仪进行测定(见附图2)。(二)林蛙抗菌肽抗病毒实验(1)林蛙抗菌肽抗流感病毒的实验在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行5倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，流感病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3X1(T个C8166细胞和200TCIDs。的流感病毒，每孔的总体积为200vL。置37。C,5%0)2培养箱内培养。感染后第二天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数流感病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC50是对5(F。宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。(2)林蛙抗菌肽抗乙型肝炎病毒的实验在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行5倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，乙型肝炎病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3X104个C8166细胞和300TCIDs。的乙肝病毒，每孔的总体积为200vL。置37。C，5°/￡02培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数乙肝病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC50是对5(^宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。G)林蛙抗菌肽抗艾滋病病毒的实验在96孔细胞培养板上，将林蛙多肽用完全培养基进行5倍倍比稀释，共6个稀释度，每孔100vl，同时设置正常细胞对照，艾滋病病毒感染细胞对照。每实验孔滴加3X104个C8166细胞和200TCID5(,的艾滋病病毒，每孔的总体积为200vL。置37'C，02培养箱内培养。感染后第三天观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重叠的视野，计数艾滋病病毒诱导C8166细胞形成的合胞体数。IC50为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度。EC50是对5(^宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度，治疗指数(SI)为IC50/EC50的比值。表l林蛙抗菌肽抑制流感病毒增殖的作用:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2林蛙抗菌肽抑制乙型肝炎病毒增殖的作用-<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3林蛙抗菌肽抑制艾滋病病毒增殖的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述实验表明本发明的林蛙抗菌肽具有显著的抑制流感病毒、乙型肝炎病毒及艾滋病病毒，可用于制备治疗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病治疗的药物。权利要求1、一种林蛙抗菌肽，具有以下特征是一种碱性多肽，分子量范围在2-16KDa之间，等电点为8.9-9.5；氨基酸组成为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、Val、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、半胱氨酸；其中碱性氨基酸占总量的23.99％，酸性氨基酸占总量的19.08％。2、权利要求1所述的林蛙抗菌肽制备方法，包括以下步骤(1)将林蛙干蛙皮，用pH4.00.2mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲溶液以料液比为h812(m/v)的比例室温浸泡2030小时；(2)将所得浸提液5000r.p.m离心30min，弃沉淀，留上清；将上清液再煮沸5min，冷却，5000r.p.m离心30min，取上清过30KDa膜即得抗菌肽滤液。全文摘要本发明提供一种林蛙抗菌肽及其制备工艺，还进一步公开了该抗菌肽在制备抗病毒药物中的用途，该肽是一种碱性多肽，分子量范围在2-16KDa之间，等电点为8.9-9.5，由天冬氨酸、谷氨酸、丝氨大多数酸、组氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、Val、甲硫氨酸等组成，其中碱性氨基酸占总量的23.99％，酸性氨基酸占总量的19.08％。林蛙抗病毒抗菌肽是从天然资源得到的产物，具有很好的抗病毒能力，同时还具有无溶血活性、无血浆凝固活性等优点，可用于制备抗病毒型流感、乙型肝炎及艾滋病的药物。文档编号C07K14/435GK101456910SQ20081005142公开日2009年6月17日申请日期2008年11月14日优先权日2008年11月14日发明者杰周,孟庆繁,安金双,李青山,滕利荣,王贞佐,田晓乐,逯家辉,高朝辉申请人:吉林大学