一种ghgkhknk八肽的制备工艺及医药用途的制作方法

专利名称：：一种ghgkhknk八肽的制备工艺及医药用途的制作方法
技术领域：
：本发明提供一种GHGKHKNK八肽的制备工艺，本发明还公开了其在抗肿瘤转移方面的医药用途，属于生物化学中的多肽药物
技术领域：
。技术背景近年来，随着研究的深入，多肽对肿瘤生长和转移的抑制作用逐渐引起人们的重视。国内外学者通过从动植物中提取、噬菌体肽库筛选以及化学合成等方法，得到了一些具有抗肿瘤活性的小分子多肽，这些小肽可以针对肿瘤细胞的生长、发展的不同环节，特异性杀伤、抑制肿瘤细胞的浸润及转移。1990年Alino等发现5肽YIGSR(酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)可使肺癌转移能力下降(AlinoSF,UndaFJ，Perez-YarzaG.Lamininsurfacebindingsitesandmetastaticpotentialof3LLtumorcells,increasedbyindomethacin[J].BiochemBiophysResCommun,1990，167(2):731-738.)。抗肿瘤的小分子多肽分子量小、活性高，对多药抗性的肿瘤细胞系也具有良好的抑制活性。同时小分子多肽可以多种方式给药，不易引起免疫反应，且人工化学合成的生产成本较低，这些都预示着小分子抗肿瘤肽在临床方面有很好的应用前景。最近，研究发现人的高分子激肽原第5结构域中富含组氨酸的区域能够选择性的抑制人脐静脉和毛细血管上皮细胞的增殖并抑制小鼠角膜新血管的形成，也能够作为一个抗粘附蛋白与VN竞争,与尿激酶受体结合，进而抑制上皮细胞的侵袭与粘附。
发明内容本发明公开一种GHGKH認K八肽的制备工艺，具有工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，生产成本低的特点。本发明还公开了GHGKHKNK八肽在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明涉及的GHGKHKNK八肽具有下列一级结构Gly-His-Gly化ys-His-Lys-Asn-Lys本发明GHGKH認K八肽的具体制备工艺如下以2-氯-三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂、4-甲氧基三苯甲基树脂或三苯甲基树脂为起始原料，按固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU或HBTU及H0BT为縮合剂进行接肽反应，同歩进行脱侧链保护基团及切肽，获得该八肽化合物粗品。再经C18(或C8)柱分离纯化，冷冻干燥后，制得精品。按照本发明，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的具体歩骤包括(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂将以2-氯-三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂、4-甲氧基三苯甲基树脂或三苯甲基树脂，用DMF浸泡10-60分钟，使树脂充分溶胀，加DIPEA或DMPA和Fmoc-Lys(Boc)-OH，1015。C反应1~24小时；再加入甲醇105(TC反应1~20小时，氮气吹干，树脂用DMF洗涤，获得Fmoc-Lys(Boc)-树脂；所说的树脂取代量为0.3-1.5mmol/g;粒径为100400目；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2~5倍；DIPEA或DMPA的摩尔数为树脂的220倍；脱帽试剂的加入量以树脂的重量为基准为5-20ml/g;甲醇的摩尔系数为树脂的2~20倍；(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在歩骤(1)的Fmoc-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，1050。C反应10-60分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1050'C反应1~5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，得到Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；所说的脱帽试剂为PIP:DMF=1:25,体积比；脱帽试剂的加入量以树脂的重量为基准为5-20ml/g;混合物中Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍；TBTU/HBTU和HOBT的摩尔系数为树脂的2~5倍；所说的接肽试剂为NMM:DMF-h5~15，体积比；接肽试剂中，Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍；"TBTU/HBTU禾卩HOBT"指的是TBTU与HOBT的混合4勿，或者是HBTU与HOBT的混合物；(3)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)誦树脂在歩骤(2)的Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍。其余操作以及工艺条件同歩骤(2);(4)制备Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在步骤(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)隱树脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍。其余操作以及工艺条件同步骤(2);(5)制备Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在步骤(4)的Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍。其余操作以及工艺条件同步骤(2);(6)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)陽Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在步骤(5)的Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Fmoc-Gly-OH的摩尔系数为树脂的25倍。其余操作以及工艺条件同步骤(2);(7)制备Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)隱树脂在步骤(6)的Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU禾nHOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍。其余操作以及工艺条件同步骤(2);(8)制备Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在步骤(7)的Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Boc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Boc-Gly-His(Trt)陽Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Boc-Gly-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍。其余操作以及工艺条件同步骤(2);(9)制备Gly-His(Trt)隱Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)在歩骤(8)Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入遇冷至102(TC的切肽试剂，105(TC反应15小时，减压蒸去除溶剂，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P20s真空干燥，获得粗品；所说的切肽试剂的组分为TFA/EDT/HO/TIS=90-95/2-5/l-5，体积比；按照本发明优选的技术方案，分离纯化包括如下歩骤将粗品溶于醋酸铵中，过滤，滤液经C18(或C8)柱纯化，流动相0.1MNH4AC:乙腈(7.5:2.5);流动速为100650ml/min;检测波长为280nm;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品，总收率为3040%。本发明的工艺路线有下列积极效果采取切肽试剂(TFA/EDT/TIS)进行切肽，接肽收率高(每歩接肽收率为》99%)，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三分污染少，且提高收率，采用C18(或C8)柱分离纯化，避免使用TFA进行纯化，减少三废，每歩接肽收率均在98°/。以上；总收率为25~35%。具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，生产成本低，三废少，收率高，质量稳定，本发明以GHGKHKNK八肽作为主要活性成分制备抗肿瘤药物，具有明显抑制肿瘤转移活性，其可用于治疗多种肿瘤相关的疾病。以下实验表明GHGKHKM八肽对癌症的治疗效果一、GHGK服NK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外抑制作用按照Buttke等人([1]ButtkeTU，McCubrgyJA，Owen丁C.Useofanaqeoustetrazolium/JIm睡olMethods,1993,157:233—240.)所述的MTS比色法检测GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外抑制作用，观察GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外抑制作用。本试验取对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞B16-F10单细胞悬液，含10%FBSIMDM调整细胞浓度至2X107ml，以每孔100ul接种于96孔板，37°C、5%C02孵育24h。弃上清，每孔加入无血清IMDM配制的八肽100ul，药物终浓度分别为1CT、1(T、10_6、10-7、10—"mol/L，以无血清IMDM为对照组。每组设4个复孔。37。C、50线分别培养24h、48h。离心去上清，加入MTS/PMS液40yl，37°C、5%C02孵育4h。离心去上清，混匀于490nm处测吸光度(A)值。按下式计算细胞抑制率。细胞抑制率=(1-给药组A值/对照组A值)X10(^。本发明中的八肽药物浓度为10、ol/L1(Tmol/L在体外产生对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10不同程度的生长抑制。GHGKHKNK八肽的浓度为1(Tmol/L时，在体外作用24h和48h后可以显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的生长，具体结果如下GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)二、GHGKHKNK八肽体外对肿瘤细胞克隆形成能力及侵袭能力的影响按照LiLiu等人(Neoplasia.2006November,8(11):917-924)所述的方法完成平板克隆形成实验以及细胞侵袭实验，观察本发明的八肽体外对肿瘤细胞克隆形成能力及侵袭能力的影响。平板克隆形成实验的方法是将对数生长期的3组细胞分别以2.5g/L胰蛋白酶消化成单个细胞悬液，并作梯度倍比稀释，按每孔50个细胞接种于24孔板，每组细胞各接种6孔。静止培养2-3周，当培养板出现肉眼可见的克隆时终止培养。PBS清洗后加纯甲醇lmL固定15min，吉姆萨液染色。将培养板置于显微镜低倍数下计数大于50个细胞的克隆数，按公式计算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆数/接种数X1000/0。细胞侵袭实验的方法是将浓度为0.5g/LMatrigel人工基质胶20uL铺于Transwell侵袭小室聚碳酯微孔膜(孔径8nm)的上表面，置37°C30min使其聚成凝胶。Transwell上室中分别加入已消化重悬的各组细胞100"L(1X107U，下室中加入600uL含趋化因子无血清RPMI-1640培养基，培养24h后取出，PBS清洗，棉签去除滤膜上层细胞，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定并吉姆萨液染色，显微镜下直接观察穿过膜的细胞数。随机计数5个视野，计数每个视野内穿过8um微孔的细胞数。以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。本发明的GHGKH認K八肽体外对肿瘤细胞克隆形成能力及侵袭能力的影响结果如下所示不同剂量GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的克隆形成均有抑制作用，与对照组相比较均有显著性差异(P<0.05);其中八肽GHGKH認K化合物10—W)l/L剂量肿瘤细胞抑制率达56.81%(见表l、图l)。表lGHGK服NK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10克隆形成的抑制作用结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>10—Sol/L和10—^01/LGHGKH認K在体外作用48h后可以显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的侵袭，穿膜细胞数与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)(见表2、图2)。表2GHGKHKNK八肽小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的侵袭抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从以上数据所示可以看出，本发明中的八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的克隆形成能力及侵袭能力具有明显的抑制作用，而且这种抑制作用是剂量依赖性的，本发明的八肽显著地提高了体外抑制小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的克隆形成能力及侵袭能力的活性。三、GHGKHKNK八肽体外对肿瘤细胞黏附能力的影响按照LiLiu等人(Neoplasia.2006November,8(11):917-924)所述的免疫组化方法检测对LN-R、ICAM-1、E-cadhesion表达情况的影响，观察本发明的GHGKHKNK八肽体外对肿瘤细胞黏附能力的影响。实验使用免疫细胞化学SP试剂盒(LN-R、ICAM-1、E-cadhesion)进行。首先将处于对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞B16-F10消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1乂105,将准备好的玻片放置24孔培养板中，将细胞悬液滴至小玻片中，待细胞生长密度达到75%饱和度时，弃去培养基每孔加入含有不同药物浓度的无血清RPMI-1640培养基0.9ml，对照组加入加lml无血清RPMI-1640培养基，37°C、5%C02孵箱孵育48h，然后PBS清洗3次，用甲醇固定10min，完毕再用PBS洗片1次晾干后，用中性树胶固定在载玻片上，3%过氧化氢孵育8min,PBS清洗3次，滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15min弃去，分别滴加LN-R、ICAM-1、E-cadhesion抗体工作液，37。C放置lh，PBS清洗3次，DAB显色后水洗，Mayer苏木精复染，然后在显微镜下随机取五个视野分别记录100个细胞，记录阳性细胞数。本发明中的八肽对LN-R、ICAM-1、E-cadhesion三种因子的表达情况的影响结果如下表3:GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10LN-R、ICAM-1、E-cadhesion表达情况的影响结果_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从以上数据所示可以看出，本发明中的八肽可下调LN-R、ICAM-l、E-cadhesion在小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的表达，，这种下调作用显示出本发明的八肽显著地提高了体外抑制小鼠黑色素瘤细胞B16-F10黏附能力的活性。四、GHGK服M八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10人工肺转移模型的治疗作用按照韩锐等人主编(抗癌药物研究与实验技术.北京中国协和医科大学北京医科大学联合出版社，1997:368369.)所述的方法完成八肽对黑色素肿瘤B16-F10细胞人工肺转移模型的治疗作用实验，观察本发明的GHGK服NK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10人工肺转移模型的治疗作用。简单的说，首先取对数生长期小鼠黑色素瘤细胞B16-F10,Hanks液调整细胞浓度至1X106/ml,C57BL/6J小鼠尾静脉注射，每只0.2ml。随机分为生理盐水组(0.2ml/d)、GHGKH認K八肽剂量I组[500ug(kgd)—'],GHGKHKNK八肽剂量II组[50yg(kgd)—'],GHGK服NK八肽剂量III组[5"g(kgd)—']。肿瘤接种后次日经腹腔注射各组药物，每日一次，连续给药20天。于给药结束后次日脱颈椎处死小鼠，取肺，Bouin液固定，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶数，并将动物肺组织进行石蜡切片，按下式计算抑制率。抑制率=(1-给药组平均转移瘤灶数/生理盐水组平均转移瘤灶数)xioo呢。本发明中的GHGK服NK八肽对黑色素肿瘤B16-F10细胞人工肺转移模型的治疗作用结果如下所示表4:GHGKHKNK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10人工肺转移的治疗作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>200810050685.5说明书第9/19页50Ug/kg/d环磷酰铵30mg/kg/d空白对照组2.58±1.51*1.67±0.89*卜与对照组比较,P0.05#:与环磷酰铵组比较PO.05病理观察结果显微镜下，生理盐水组肺转移瘤组织呈巢状、片块，多分布于血管周围或胸膜处，呈多发、散在分布，面积较大,偶见血管内瘤栓。给药组肺转移瘤组织呈圆球状居多，多位于管周或胸膜处,但面积较小，甚至由几个细胞构成,面积较大者，可见中央或偏位处片状坏死。上述两组瘤细胞形态大小基本一致。见图3。五、ghgkhknk八肽对移植性腹水型肝癌H22小鼠生存时间的影响。按照韩锐等人主编(抗癌药物研究与实验技术.北京中国协和医科大学北京医科大学联合出版社，1997:368369.)所述的方法完成GHGKHKNK八肽对H22肝癌腹水瘤荷瘤鼠实体瘤生长抑制作用及存活期的影响，观察本发明的GHGKHKNK八肽对移植性腹水型肝癌H22小鼠生存时间的影响。试验在无菌条件下取6-8天的腹水型肝癌H22荷瘤小鼠，处死固定，用碘酊及酒精消毒操作部位皮肤，然后切开，用无菌注射器穿过腹壁肌层抽取腹水，用Hanks液稀释，1200rpm，10min洗涤两次后，用Hanks液调整细胞数为1X107ml的细胞悬液，除正常对照组以外，其他的各组动物每鼠腹腔注射腹水稀释液O.lml。八肽低、中、高剂量组及生理盐水组在肿瘤接种前五天开始给药，环磷酰胺(CPA)阳性对照组于肿瘤接种后次曰开始给药，各组治疗药物均溶于0.2ml的生理盐水中，腹腔注射给药，每日l次，连续60天，或者直至动物死亡时结束。于末次给药后24hr处死半数小鼠，每组动物于给药后逐日观察动物的一般情况，记录死亡时间、生存天数、计算生命延长率。按以下公式计算生命延长率生命延长率=(实验组平均生存天数-对照组平均生存天数)/对照组平均生存天数X10(m。摘瘤称重，以抑瘤率(TGI)判断抑瘤效果，抑瘤率计算公式如下tgi(%)=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重xio(m。试验重复3次，结果为3次试验的平均值。并通过流式细胞术对腹水进行检测，本发明的GHGKHKNK八肽对移植性腹水型肝癌H22小鼠生存时间的影响结果如下正常对照组小鼠至实验观察结束60天，仍全部存活。正常对照组与生理盐水对照组相比有显著性差异(P〈0.05)，环磷酰胺组能明显延长腹水型肝癌H22小鼠生存时间，与生理盐水对照组相比有显著性差异(P<0.05)，八肽各个给药组均能明显延长腹水型肝癌H22小鼠的生存时间，与生理盐水对照组相比有显著性差异(P<0.05)。八肽给药剂量是5ug/kg时H22小鼠的生命延长率为60.25%，而且生命延长率与给药剂量呈现一定的量效关系(见表)。其中给药剂量为50ug/kg时疗效最为显著，达到60.25%。给药剂量为500ug/kg时疗效反而有所下降。以60天为观察期限，生存时间大于60天认为长期存活。环磷酰胺组未见长期存活小鼠，而八肽各组均有长期存活小鼠。同时通过流式细胞术对各组小鼠的腹水检测发现在给药组可见明显的细胞凋亡现象，尤其以中低剂量组最为明显(如图4，5所示)。具体结果如下表5:GHGK服NK八肽对移植性腹水型肝癌H22小鼠生存时间的影响组别药物剂量N生存时间中位数(d)生存时间(d)生命延长(％)长期存活动动物(〉60d)高剂量500ug/kg202020.85土9.2443.521中剂量50ug/kg201920.55土11.5*60.253低剂量5ug/kg202021.90土11.7859.434环磷酰胺20mg/kg202121.60土9.46*35.63生理盐水202121.50土9.923----正常对照206060.OO土O.00*----20*与正常对照组比较，(P<0.05=表6:GHGK服NK八肽对移植性腹水型肝癌H22小鼠腹水的细胞凋亡率组别药物剂量细胞凋亡率％高剂量500ug/kg/d7.77±0.16中剂量50ug/kg/d3.08±0.06*低剂量5ug/kg/d5.35±0.07*生理盐水—26.66±0.24环磷酰胺20mg/kg/d0.68±0.05*jE常对照組.—5.26±0.10*与正常对照组比较P〈0.05按照医药工业中已知的方法，将GHGK服NK八肽与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂相混合，制成适于经胃肠道或胃肠道外途径给药的各种不同剂型的药物组合物。医药上可接受的载体包括无毒性的并且对活性成分没有干扰作用的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、胶囊包裹材料或任何类型的配方辅助剂。所制得药物组合物可以经胃肠道外、口服及局部等途径给药。胃肠道外途径包括静脉内、肌肉内、体腔(如腹腔、胸腔或脑脊髓腔)及器官腔(如鼻腔、口腔、直肠、阴道或子宫腔)内，以及皮内、皮下或眼内等给药途径。为了经胃肠道外给药，可将本发明的GHGK服NK八肽溶解在水、盐水、右旋糖溶液、乙醇或油中制成溶液或悬浮液。所使用的载体也可以包括防腐剂、混悬剂、增溶剂、缓冲剂等其他成分。当化合物(肽)以鞘内途径给药时，也可将其溶解在脑脊液中。为了口服或经粘膜给药，可以将GHGK服NK八肽制成胶囊剂、丸剂、片剂、驰剂、粉末剂、悬浮剂或乳剂形成的固体或液体制剂。可使用水、乙二醇、油、醇、香味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等载体或辅助成分制备液态口服制剂(如溶液、悬浮液和驰剂)；或使用淀粉、糖、造粒剂、固体稀释剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂等载体或辅助剂制备固态口服制剂(如粉末剂、片剂、栓剂和胶囊剂)。必要时，可使用微胶囊或脂质体包裹活性成分，制成能够通过胃肠道或血脑屏障的稳定制剂(如参见国际专利WO86/11698)。本发明的药物组合物的给药剂量一般为5至500ug/kg/天，每天可以以亚剂量形式分几次给药。但确切的用药剂量应根据待治疗疾病的性质、疾病严重程度、病人的年龄和身体一般状况，以及给药途径等因素由临床医生决定。上述体外实验初步表明，本发明的GHGK服NK八肽对肿瘤细胞的克隆形成能力，侵袭能力以及黏附能力具有明显的抑制作用。本发明的GHGKHKNK化合物或其药物组合物可用于预防或治疗原发或转移的各种实体瘤或造血系统细胞恶性增生性疾病。当用于预防肿瘤转移时，可单独或与肿瘤放疗或化疗联合使用。例如可在实体瘤放射治疗后，联合使用本发明的肽化合物和一种或几种常规肿瘤化疗药物。或者，在经过手术、放疗及化疗后，继续使用本发明的肽化合物，以清除体内可能存在的微小肿瘤转移灶，或稳定并抑制任何残存的原发肿瘤。图1、GHGK服NK八肽对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10克隆形成的抑制作用结果；图2、GHGK服NK八肽小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的侵袭抑制作用；图3、肺转移肿瘤组织病理形态(HEX40);A:Lungmetastaticlesiontreatedwith50yg/kg/dpeptidecompoundGHGK服NK;B:Lungmetastaticlesiontreatedwith500yg/kg/dpeptidecompoundGHGKHKNK;C:Lungmetastaticlesiontreatedwithnormalsaline.图4、低剂量组细胞周期分析图；图5、生理盐水组细胞周期分析图；图6、。具体实施方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例1:肽链Gly-His-Gly-Lys-His-Lys-Asn-Lys的合成1、合成肽链(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂取2-氯-三苯甲基树脂50克，用DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，加44mlDIPEA，46.9gFmoc-Lys(Boc)-0H，反应3小时，再加50ml甲醇继续反应3小时。氮气吹干，树脂用DMF洗漆三次。获得Fmoc-Lys(Boc)-树脂；(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂加入800ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25。C反应30分钟，氮气吹滤去六氢吡啶，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-0H(MV:596.7，200画1)119.9g，TBTU(MW:321，200腿o1)64.2g，HOBT(MW:153，200画1)30.6g，画44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，将混合物25。C反应1小时。氮气吹干，函F，无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。加入500ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25。C反应30分钟，氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。(3)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)_Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200画1)93.7g，TBTU(丽321,200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153，200誦o1)30.6g，蘭M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，将混合物25。C反应1小时。氮气吹干，DMF,无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。加入500ml体积浓度为20。/。的六氢吡啶的DMF溶液，25。C反应30分钟，氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。(4)制备Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-His(Trt)-0H(MV:619.7，200薩o1)123.9g，TBTU(,:321，200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmo1)30.6g，NMM44.4ml(丽101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。(5)制备Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200mmol)93.7g，TBTU(MW:321，200mniol)64.2g，HOBT(MW:153，200,ol)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。(6)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Gly-OH(MV:297.3，200國1)59.5g，TBTU(MW:321，200mmol)64.2g，HOBT(MW..153,200醒o1)30.6g，N画44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF,具体方法同歩骤(3)。(7)制备Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200mmol)123.9g，TBTU(羅321，200鹏o1)64.2g，HOBT(MW:153，200咖o1)30.6g，刚M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具体方法同歩骤(3)。(8)制备Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Boc-Gly-OH(MV:175.2，200mmol)35.4g，TBTU(MW:321,200mmol)64.2g，HOBT(丽153，200mmol)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF,具体方法同歩骤(3)。再用无水甲醇洗涤三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得八肽树脂约90g。(匿=906.2，43画1),接肽总收率约为86%。2、切肽取88.9g八肽树脂转移到茄形瓶子中，冷切下加入切肽试剂(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚^650ml/17ml/17m/34ml)，25。C搅拌2小时。过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀，过滤收集沉淀得约35g八肽粗品。3、纯化滤液分批经C18柱纯化，流动相0.1MNH4AC:乙腈(7.5:2.5);流动速为380ml/min;检测波长为280nm;样品峰合并后去盐，冻干，约得13.9g白色疏松块状物成品(匿906.2，15.3mmo1);收率30.6%。用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液实施例2:1、合成肽链(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂取4-甲基三苯甲基树脂50克，用DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，加44mlDIPEA，46.9gFmoc-Lys(Boc)-0H，反应3小时，再加50ml甲醇继续反应3小时。氮气吹干，树脂用DMF洗涤三次。获得Fmoc-Lys(Boc)-树脂；(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂加入800ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25。C反应30分钟，氮气吹滤去六氢吡啶，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MV:596.7，200,1)119.9g，TBTU(證:321，200,1)64.2g，HOBT(MW:153，200rano1)30.6g，丽M44.4ml(丽101.2)，400mlDMF，将混合物25。C反应1小时。氮气吹干，DMF，无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。加入500ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25'C反应30分钟，氮气吹干，分别用匿F、无水甲醇、隨F洗涤三次，氮气吹干。(3)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200腿o1)93.7g，TBTU(MW:321，200rnrno1)64.2g，HOBT(薩153，200咖o1)30.6g，廳M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，将混合物25。C反应1小时。氮气吹干，DMF，无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。加入500ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25'C反应30分钟，氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。(4)制备Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200隱o1)123.9g，TBTU(隨:321,200mmol)64.2g，HOBT(薩:153，200mmol)30.6g，薩44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。(5)制备Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入F獄-Lys(Boc)-0H(MV:468.5，200國o1)93.7g，TBTU(MW:321，200rano1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmo1)30.6g，刚M44.4ml(讓101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。(6)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂:在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Gly-OH(MV:297.3，200鹏o1)59.5g，TBTU(MW:321，200ramo1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmo1)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400ralDMF,具体方法同步骤(3)。(7)制备Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200mmol)123.9g,TBTU(MW:321,200mmol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF,具体方法同步骤(3)。(8)制备Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Boc-Gly-OH(MV:175.2，200mmol)35.4g，TBTU(丽321，200mmol)64.2g，HOBT(丽153，200mmol)30.6g，N画44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具体方法同歩骤(3)。再用无水甲醇洗涤三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得八肽树脂约92g。(MW=906.2，43mmol)，接肽总收率约为88%。2、切肽取92.lg八肽树脂转移到茄形瓶子中，冷切下加入切肽试剂..(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚^650ral/17ml/17m/34ml)，25'C搅拌2小时。过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀，过滤收集沉淀得约37g八肽粗品。3、纯化滤液分批经C18柱纯化，流动相0.1MNHAC:乙腈(7.5:2.5);流动速为380ml/min;检测波长为280nm;样品峰合并后去盐，冻干，约得14.5g白色疏松块状物成品(MW:906.2，15.3mmo1);收率32.0%。用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液。实施例3:1、合成肽链(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂取4-甲氧基三苯甲基树脂50克，用DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，加44mlDIPEA，46.9gFmoc-Lys(Boc)-0H,反应3小时，再加50ml甲醇继续反应3小时。氮气吹干，树脂用DMF洗涤三次。获得Fmoc-Lys(Boc)-树脂；(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂加入800ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25。C反应30分钟，氮气吹滤去六氢吡啶，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-0H(MV:596.7，200mmo1)119.9g，TBTU(MW:321，200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmo1)30.6g,NMM44.4ml(MW:101.2),400mlDMF，将混合物25。C反应1小时。氮气吹干，DMF,无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。加入500ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25"C反应30分钟，氮气吹千，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。(3)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)_Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-0H(MV:468.5，200國o1)93.7g，TBTU(MW:321，200mmo1)64.2g，HOBT(丽153，200mmo1)30.6g，画M44.4ml(匿101.2)，400mlDMF，将混合物25。C反应1小时。氮气吹干，DMF，无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。加入500ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25C反应30分钟，氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。(4)制备Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200腦o1)123.9g，TBTU(丽321,200mmol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，N鹿44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。(5)制备Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200咖o1)93.7g，TBTU(MW:321，200ramol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g,函M44.4ml(丽:101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。(6)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Gly-OH(MV:297.3，200nimol)59.5g，TBTU(MW:321，200画1)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，酬44.4ml(MW:101.2)，400ml隨F，具体方法同步骤(3)。(7)制备Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200隱o1)123.9g，TBTU(MW:321，200,ol)64,2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，固M44.4tnl(MW:101.2),400mlDMF，具体方法同歩骤(3)。(8)制备Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)—Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Boc-Gly-OH(MV:175.2，200mmol)35.4g，TBTU(丽321，200mmol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，画M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。再用无水甲醇洗涤三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得八肽树脂约88.Og。(MW=906.2，43画1)，接肽总收率约为84%。2、切肽取88.Og八肽树脂转移到茄形瓶子中，冷切下加入切肽试剂(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚二650ml/17ml/17m/34ral)，25。C搅拌2小时。过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀，过滤收集沉淀得约34.5g八肽粗品。3、纯化滤液分批经C18柱纯化，流动相0.1MNH^C:乙腈(7.5:2.5);流动速为380ml/min;检测波长为280nm;样品峰合并后去盐，冻干，约得13.2g白色疏松块状物成品(匿906.2，15.3画o1);收率29.2%。用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液。实施例4:1、合成肽链(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂取基三苯甲基树脂50克，用DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，加44mlDIPEA，46.9gFmoc-Lys(Boc)-OH，反应3小时，再加50ml甲醇继续反应3小时。氮气吹干，树脂用DMF洗涤三次。获得Fmoc-Lys(Boc)-树脂；(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂加入800ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25。C反应30分钟，氮气吹滤去六氢吡啶，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MV:596.7，200mmo1)119.9g，TBTU(MW:321,200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153,200mmo1)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，将混合物25。C反应1小时。氮气吹干，DMF，无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。加入500ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25。C反应30分钟，氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。(3)制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200mmo1)93.7g，TBTU(MW:321，200mrao1)64.2g，HOBT(丽153，200mmo1)30.6g，NMM44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，将混合物25。C反应1小时。氮气吹干，DMF，无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。加入500ml体积浓度为20%的六氢吡啶的DMF溶液，25。C反应30分钟，氮气吹干，分别用面F、无水甲醇、DMF洗涤三次，氮气吹干。(4)制备Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-His(Trt)-OH(MV:619.7，200mmo1)123.9g，TBTU(MW:321，200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153,200mmo1)30.6g，刚M44.4ml(MW:101.2)，400ml面F,具体方法同歩骤(3)。(5)制备Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(MV:468.5，200画o1)93.7g,TBTU(丽321，200m鹏l)64.2g，HOBT(MW:153，200ramo1)30.6g，NMM44.4ml(丽101.2),400mlDMF，具体方法同步骤(3)。(6)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂:在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-Gly-OH(MV:297.3，200mmol)59.5g，TBTU(丽321，200mmol)64.2g，HOBT(MW:153，200mmol)30.6g，刚M44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。(7)制备Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Fmoc-His(Trt)-0H(MV:619.7，200画o1)123.9g，TBTU(MW:321，200mmo1)64.2g，HOBT(MW:153,20Ommo1)30.6g，N画44.4ml(匿:101.2)，400mlDMF，具体方法同歩骤(3)。(8)制备Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在上述脱帽反应的树脂中，加入Boc-Gly-OH(MV:175.2，200醒o1)35.4g，TBTU(丽321,200mmo1)64.2g，HOBT(丽153，200mmo1)30.6g，N顧44.4ml(MW:101.2)，400mlDMF，具体方法同步骤(3)。再用无水甲醇洗涤三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得八肽树脂约91.5g。(丽=906.2，43咖o1)，接肽总收率约为87%。2、切肽取91.5g八肽树脂转移到茄形瓶子中，冷切下加入切肽试剂(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚二650ml/17ml/17m/34ml)，25。C搅拌2小时。过滤，抽干，滤液加无水乙醚沉淀，过滤收集沉淀得约36.6g八肽粗品。4、纯化滤液分批经C18柱纯化，流动相0.1MNH4AC:乙腈(7.5:2.5);流动速为380ml/rain;检测波长为280nm;样品峰合并后去盐，冻干，约得14.3g白色疏松块状物成品(MW:906.2，15.3mmo1);收率31.4%。用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液。权利要求1.一种GHGKHKNK八肽的制备工艺，其特征在于以2-氯-三苯甲基树脂、三苯甲基树脂作树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂为起始原料，按固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU或HBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得该八肽化合物粗品；再经C18或C8柱分离纯化，冷冻干燥后，制得精品；2.根据权利要求1所述的制备工艺，包括如下步骤(1)制备Fmoc-Lys(Boc)-树脂将以2-氯-三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂、4-甲氧基三苯甲基树脂或三苯甲基树脂，用DMF浸泡10-60分钟，使树脂充分溶胀，力口DIPEA或DMPA和Fmoc-Lys(Boc)-OH，1015。C反应124小时；再加入甲醇105(TC反应120小时，氮气吹干，树脂用DMF洗涤，获得Fmoc-Lys(Boc)-树脂；所说的树脂取代量为0.3-1.5mmol/g;粒径为100400目；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2~5倍；DIPEA或DMPA的摩尔数为树脂的220倍；脱帽试剂的加入量以树脂的重量为基准为5-20ml/g;甲醇的摩尔系数为树脂的220倍；(2)制备Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在步骤(1)的Fmoc-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，1050。C反应1060分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10~50°C反应15小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，得到Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；所说的脱帽试剂为PIP:DMF=1:25，体积比；脱帽试剂的加入量以树脂的重量为基准为5-20ml/g;混合物中Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍；TBTU/HBTU和HOBT的摩尔系数为树脂的25倍；所说的接肽试剂为NMM:DMF=1:515，体积比；接肽试剂中，Fmoc-Asn(Trt)-OH的摩尔系数为树脂的25倍；"TBTU/HBTU和HOBT"指的是TBTU与HOBT的混合物，或者是HBTU与HOBT的混合物；(3)制备Fmoc誦Lys(Boc)陽Asn(Trt)画Lys(Boc)-树脂在步骤(2)的Fmoc-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干；加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔系数为树脂的25倍；其余操作以及工艺条件同步骤(2);(4)制备Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)醒树脂在步骤(3)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干；加入用接肽试剂溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗漆，吹干，获得Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔系数为树脂的25倍；3其余操作以及工艺条件同步骤(2);(5)制备Fmoc-Lys(Boc)隱His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在步骤(4)的Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干；加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)陽树脂；混合物中Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍；其余操作以及工艺条件同步骤(2);(6)制备Fmoc-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)画Lys(Boc)隱Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在步骤(5)的Fmoc画Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)画Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干；加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Gly-Lys(Boc)画His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Fmoc-Gly-OH的摩尔系数为树脂的25倍；其余操作以及工艺条件同步骤(2);(7)制备Fmoc-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)誦His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂在步骤(6)的Fmoc画Gly画Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-LyS(BOC)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干；加入用接肽试剂溶解的Fmoc-His(Trt)-OH、TBTU/HBTU禾口HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Gly-Lys(Boc)陽His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-OH的摩尔系数为树脂的2~5倍；其余操作以及工艺条件同步骤(2);(8)制备Boc画Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)画Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树月旨在步骤(7)的Fmoc-His(Trt)画Gly-Lys(Boc)-His(Trt)画Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干；加入用接肽试剂溶解的Boc-Gly-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Boc-Gly隱His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂；混合物中Boc-Gly-OH的摩尔系数为树脂的25倍；其余操作以及工艺条件同步骤(2);(9)制备Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)在步骤(8)Boc-Gly-His(Trt)-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)隱Lys(Boc)-Asn(Trt)-Lys(Boc)-树脂中，加入遇冷至1020。C的切肽试剂，105(TC反应15小时，减压蒸去除溶剂，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P20s真空干燥，获得粗品；所说的切肽试剂的组分为TFA/EDT/HO/TIS=90-95/2-5/l-5，体积比。3、GHGK服NK八肽在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明公开一种GHGKHKNK八肽的制备工艺，以2-氯-三苯甲基树脂、三苯甲基树脂作树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂为起始原料，按固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU或HBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得该八肽化合物粗品；再经C18或C8柱分离纯化，冷冻干燥后，制得精品；本发明还提供了以GHGKHKNK八肽为主要活性成分在制备抗肿瘤药物中的用途。文档编号C07K1/06GK101270145SQ20081005068公开日2008年9月24日申请日期2008年5月7日优先权日2008年5月7日发明者刚吕,爽姜,孙静辉,安立萍,宋见喜,张成义,徐广宇,坦李,杜培革,丹田,野申,笑韩申请人:北华大学