专利名称：具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白天青蛋白及其用途和含有其的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白天青蛋白，其编码核酸序列，以及所述蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明还公开了所述蛋白质的氨基酸序列以及编码所述蛋白质的核酸序列。本发明还公开了一种含有治疗有效量的天青蛋白的药物组合物。本发明还涉及所述蛋白质的制备方法和在样品中检测所述蛋白质的方法。
背景技术：
肿瘤是一类严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，目前尚无特别有效的防治策略(Xu RZ，Gao QK，Wang SJ，et al.Natl Med JChina 78，504-507，1998)。因此，对大多数患者来说，肿瘤仍然是一种致死性疾病。其主要原因之一是目前尚无特别有效的药物彻底预防和根治肿瘤。
早在二十世纪初开始相继报道，有极少数肿瘤患者由于并发严重细菌感染而出现肿瘤自发消退现象。近十多年来，本发明人也陆续观察到多例白血病患者在并发严重细菌感染后，发生白血病自发缓解现象。此前对此现象解释是肿瘤消退是由于细菌感染后机体产生肿瘤坏死因子所致，也有人认为是由于细菌感染后机体发生高烧引起。但是，随后的更多研究表明肿瘤坏死因子和高热并不是其中的主要因素。
近年来，本发明人开始从患者体内开始分离和培养感染的细菌，并对细菌代谢产物抗肿瘤效应进行了详细研究。通过对一百多株不同细菌代谢产物分析研究，结果发现特定的细菌代谢产物能明显诱导多种人白血病细胞和其它肿瘤细胞发生快速凋亡。在对其中有效成分分离纯化和鉴定的基础上，本发明人出人意料地发现，其中一种分子量约为16KD蛋白质天青蛋白(AZURIN)是诱导肿瘤细胞凋亡的主要成分。进一步研究结果表明这种小分子蛋白质不仅在体外能快速高效诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，而且在小鼠肿瘤模型体内也能有效杀死肿瘤细胞。更值得一提的是，这种小分子蛋白无明显毒副作用，且十分稳定。
发明概述本发明的一个方面，提供了一种具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白质天青蛋白，其特征在于，所述蛋白质具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其具有等同生物学活性的片段或其保守性变体或衍生物。
本发明的又一方面，提供了一种编码本发明所述天青蛋白的核酸序列，其特征在于，其包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其简并性变体。
本发明的另一方面提供了一种制备本发明所述天青蛋白的方法。
本发明的再一方面，提供了本发明所述天青蛋白用于制备治疗抗肿瘤药物的用途。
本发明的又一方面，提供了一种抗肿瘤药物组合物，其中含有治疗有效量的本发明所述天青蛋白，和任选的药学可接受的辅剂。
本发明还公开了一种用于检测样本中是否存在本发明所述天青蛋白分子的方法，包括利用SEQ ID NO.2蛋白多肽序列制备的单克隆抗体或多克隆抗体；用所得抗体依据选自酶免疫试验、免疫组织化学技术、免疫印迹的技术检测样本中天青蛋白分子存在与否。
发明详述本发明涉及了一种具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白质天青蛋白，其特征在于，所述蛋白质具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其具有等同生物学活性的片段或其保守性变体或衍生物。
具体的，本发明所述天青蛋白是一种由148个氨基酸残基组成，分子量约为16KD小分子蛋白质。其中从N端开始1-20个氨基酸残基为该蛋白多肽分子信号肽，所述信号肽在引导该蛋白多肽分子在哺乳动物细胞胞浆和胞核内自由穿梭中起关键作用，从N端第21-148个氨基酸残基为该蛋白多肽分子核心序列。
此处所用的术语“具有等同生物学活性的片段”或其“保守性变体”是指所述片段分别不同于SEQ ID NO2所述的氨基酸序列，但保留了所述氨基酸的基本特性，如基本的生物特性、结构特性、调节特性或生化特性。通常，所述氨基酸水平上的差异是有限的，以使参考多肽之序列与其保守性变体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变体与参考多肽氨基酸序列上的差异可以是一个或多个性质相同或相似的氨基酸的保守性替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多核苷酸或多肽的变体可以自然产生(如等位基因变体)，或者它可以是非自然产生的变体。多核苷酸和多肽之非自然产生的变体可通过诱变技术或直接合成而产生。
结合本发明公开的内容，以及本领域周知的保守性氨基酸替代，本领域普通技术人员知晓，本发明所述的天青蛋白不限于SEQID NO2所述的氨基酸序列，还包括经过上述保守性替换后得到的具有基本上相同的生物学功能的等同生物学活性的片段，或其保守性变体。
在本发明的一个实施方案中，所述天青蛋白具有如SEQ IDNO2所示的氨基酸序列，其中包含有所述天青蛋白的编码蛋白以及信号肽。在本发明又一个实施方案中，所述天青蛋白具有如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
在本发明中，术语“天青蛋白基因”是指例如来自铜绿假单胞菌的细菌中含有功能性调控序列和具有编码生物学功能蛋白天青蛋白的基因。该术语还包括与SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列同源性在85％以上的所有具有生物学功能的变异体或衍生物。
具体的，本发明提供了由该天青蛋白基因编码的细菌蛋白质的氨基酸序列SEQ ID NO.2，及其核心序列SEQ ID NO.3。SEQID NO.2是由该天青蛋白基因编码的由148个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为16KDa，其中从N端开始1-20个氨基酸残基为该蛋白质分子的信号肽，其在引导该蛋白质分子在哺乳动物细胞胞浆和胞核内自由穿梭中起关键作用。而SEQ ID NO.3是该蛋白质的核心序列，由127个氨基酸残基组成。
在本发明中，术语“该天青蛋白基因编码的细菌蛋白质多肽的氨基酸序列”不仅是指如SEQ ID NO.2所述的蛋白质的氨基酸序列，该术语还包括与SEQ ID NO.2所述的序列同源性在85％以上的所有具有生物学功能的蛋白质和其保守性变体或衍生物。术语“该蛋白质的核心序列”不仅是指如SEQ ID NO.3所述的蛋白质的氨基酸序列，还包括与SEQ ID NO.3所述的序列同源性在85％以上的所有具有生物学功能的蛋白质和保守性变体或衍生物。
本发明的另一方面，涉及一种编码本发明所述天青蛋白或其具有等同生物学活性的片段或其保守性变体或衍生物的核酸序列，其特征在于，其包含如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，其简并性变体，或相应的核苷酸序列变体。
具体的，本发明提供了编码上述天青蛋白基因，如核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。该基因共有1284个核苷酸残基组成，其基因结构组成从该病毒基因5′端到3′端依次为5′端非编码区(UTR)、基因编码区和3′端非编码区。它的5′端非编码区(UTR)有488核苷酸；基因编码区有447个核苷酸；3′端非编码区349核苷酸；具体排列为从核苷酸第1-488位为5′端非编码区、第489-935位核苷酸为基因编码区、第936-1284位为3′端非编码区。
本发明所述简并性“变体”是指由于遗传密码的简并性，编码所述天青蛋白的核苷酸序列可能有多种碱基组成，其多核苷酸可以不同于参考的多核苷酸，但保留了编码所述蛋白质的基本。简并性变体核苷酸序列的变化不改变所述蛋白质的氨基酸序列。所述相应的核苷酸序列变体是指编码所述天青蛋白等同生物学活性的片段或其保守性变体或衍生物的核酸序列。
本发明的又一方面公开了一种制备本发明所述天青蛋白的方法，其包括，但不限于1)联合应用分段盐析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，直接从细菌培养物中分离和纯化天然型天青蛋白分子；2) 根据SEQ ID NO.1提供的核酸序列设计PCR引物，用PCR技术从细菌DNA中扩增出编码天青蛋白分子基因，然后连接到合适的表达型载体中，重组生产天青蛋白分子；或3)根据SEQ ID NO.2提供的氨基酸序列，通过人工合成的方法进行制备。
具体的，在本发明的一个实施方案中，提供一种用于从铜绿假单胞菌的细菌培养物中快速分离纯化天然天青蛋白分子方法，其特征在于联合应用分段盐析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳直接从铜绿假单胞菌的细菌培养物中分离和纯化天然型天青蛋白分子。
在本发明中，术语“快速分离纯化天然天青蛋白分子”是指联合应用饱和硫酸胺盐析技术和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及电洗脱方法直接从细菌培养物中获得高纯度天然天青蛋白分子。该术语中，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可以是小型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，也可以是中型或大型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在本发明的又一实施方案中，提供一种利用SEQ ID NO.1序列设计引物，应用PCR或RT-PCR技术可以直接从铜绿假单胞菌中分离和克隆该天青蛋白基因及相应的调控元件序列方法。其操作步骤如下(1)设计相应PCR或RT-PCR引物。
(2)从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA或RNA。
(3)PCR扩增该天青蛋白基因。
(4)琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增的DNA条带，用SpinColumn纯化PCR产物。
(5)用T-A克隆试剂盒克隆PCR产物。
采用全自动DNA序列测定仪测序分析。
在本发明的另一方面，还提供一种利用基因重组技术生产该天青蛋白基因编码的蛋白多肽方法，其步骤如下(1)将编码该天青蛋白基因的核苷酸序列可操作地连接于表达调控序列，形成天青蛋白表达载体；(2)将步骤(1)中表达载体转入宿主细胞，形成该天青蛋白基因编码的天青蛋白分子的重组细胞；(3)在适合表达该天青蛋白的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有生物活性的病毒蛋白。
在本发明的又一方面，本发明公开了天青蛋白具有广谱抗肿瘤作用，其可用于制备治疗抗肿瘤药物，其中所述肿瘤包括但不限于髓系白血病、淋系白血病、大肠癌、肺癌、肝癌、胃癌。
在本发明中，术语“广谱抗肿瘤作用”是指本发明所述的天青蛋白对多种人肿瘤细胞具有杀伤作用，这些肿瘤细胞包括人髓系白血病细胞，淋系白血病细胞，大肠癌细胞，肺癌细胞，肝癌细胞，肺癌细胞，胃癌细胞及其它多种肿瘤细胞。
本发明人在对特定细菌代谢产物对肿瘤细胞的作用分析基础上，首次发现天青蛋白分子具有高度选择性广谱抗肿瘤作用。通过体外细胞培养体系研究表明，所述蛋白质能诱导多种人肿瘤细胞发生快速凋亡，这些肿瘤细胞包括人髓系白血病细胞，淋系白血病细胞，大肠癌细胞，肺癌细胞，肝癌细胞，肺癌细胞，胃癌细胞及其它多种肿瘤细胞。
此外，本发明所述的天青蛋白还能有效杀死小鼠肿瘤模型体内肿瘤细胞，而且对小鼠本身无明显毒副作用。
本发明又一方面涉及一种用于肿瘤治疗的药物组合物，其中含有治疗有效量的本发明所述天青蛋白，和任选的药学可接受的辅剂。
本发明所述的“治疗有效量”是指能够对于待治疗的肿瘤产生积极效果的量。具体的，根据待治疗的肿瘤类型、患者的发病阶段、一般状况(包括年龄、体重)以及给药方式、给药途径等因素的不同，临床医生可根据其经验判断并采用具体的“治疗有效量。”一般而言，所述治疗有效量是在0.01mg-10mg蛋白/每千克公斤体重的范围内。
本发明所述组合物中辅剂为制剂领域技术人员知晓，包括但不限于赋形剂、崩解剂、粘合剂、着色剂等均可以使用，只要所述辅剂不影响本发明所述天青蛋白的作用。
在本发明的又一实施方案中，用于肿瘤治疗的药物组合物中还可以额外地含有其它已知的抗肿瘤药物，从而与本发明所述天青蛋白一起，产生协同作用，治疗肿瘤。
本发明再一方面，涉及一种用于检测生物样本中是否存在天青蛋白分子的方法，包括利用SEQ ID NO.2蛋白多肽序列制备的单克隆抗体或多克隆抗体；用所得抗体依据选自酶免疫试验、免疫组织化学技术、免疫印迹的技术检测样本中天青蛋白分子存在与否。
本发明特别的，还提供了针对所述天青蛋白的各种抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。
在本发明中，可以使用一系列已知的方法来制备针对上述该天青蛋白基因编码的蛋白质的多种特异性抗体。例如，将提纯的上述天青蛋白基因表达产物或它们的抗原片段注入动物体内(包括，但不限于如兔、羊、马、小鼠等)来产生多克隆抗体。同样，也可以应用本领域周知的杂交瘤技术制备针对所述天青蛋白的多种特异性单克隆抗体。本发明的抗体包括可以抑制所述天青蛋白生物功能的多种抗体，也可以是不影响其功能的抗体。每一种抗体都可以通过对上述天青蛋白片段或功能域致免疫而产生，而上述天青蛋白及其片段可以用重组的方法生产或多肽合成仪生产。
本发明的上述多种特异性抗体可以用来鉴定表达所述天青蛋白基因编码的蛋白质。例如，可以用本发明所述多种特异性抗体结合本领域常用的免疫荧光试验、免疫细胞化学、流式细胞术等技术，检测和分析表达相应天青蛋白的细胞。也可以用本发明的抗体结合免疫印迹技术(Western Blot)定量分析细胞表达天青蛋白。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆实验手册》中所述的实验条件，或按照试剂或试剂盒制造商提供的实验条件。
实施例实施例1天然细菌来源的天青蛋白的分离与纯化采用本领域已知的饱和硫酸胺盐析技术和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(汪家政等，主编，《蛋白质技术手册》，科学出版社)，从铜绿假单胞菌的培养物中分离纯化天然细菌蛋白天青蛋白。
a)按常规法接种铜绿假单胞菌到200ml LB培养液中，37℃振摇培养过夜(约16小时)。
b)10000rpm离心15分钟，取上清，加入固体硫酸胺至40％饱和度，冰浴1小时。
c)10000rpm离心15分钟，取上清，再加入固体硫酸胺至80％饱和度，冰浴1小时。
d)10000rpm离心15分钟，弃上清。将沉淀溶于1ml去离子水中，然后，加入2蛋白电泳上样缓冲液。
e)用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶和制备型蛋白电泳仪进行蛋白分离。
f)电泳结束后，用手术刀片切取16KD蛋白条带(即对应于本发明所述天青蛋白的条带)，然后用电洗脱法将凝胶中细菌蛋白天青蛋白洗脱。
g)最后用透析袋对蒸馏水透析过夜，紫外分光光度计定量蛋白含量。
实施例2采用PCR方法制备编码本发明所述的天青蛋白的多核苷酸序列应用领域中已知的PCR技术，分离和克隆编码所述天青蛋白的全长序列，具体操作步骤如下设计PCR引物上游引物5′-GCC CAA GCT TAC CTA GGA GGC TGCTCC ATG CTA-3′(SEQ ID NO4)，下游引物5′-TGA GCC CCT GCA GGC GCC CAT GAAAAA GCC CGG C-3′(SEQ ID NO5)。
以常规方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA并纯化，取1μg纯化基因组DNA作为模板，加入50μl PCR反应体系中，依次加入上述引物、dNTP、Taq酶、MgCl2、PCR缓冲液。
PCR循环参数94℃2′；94℃20″/62℃30″/72℃10′×35个循环；72℃7′；4℃。
1％琼脂糖凝胶电泳分离约0.5kb大小DNA带，用SpinColumn纯化PCR产物。
用T-A克隆试剂盒克隆PCR产物。
全自动DNA序列测定仪测序分析。
实施例3重组法制备广谱抗肿瘤细菌蛋白天青蛋白将如上述实施例2中所得编码天青蛋白的全长核苷酸序列构建入商品化的表达载体中，以表达和纯化重组蛋白。
为便于纯化，将天青蛋白以6XHIS融合蛋白或GST融合蛋白形式在大肠杆菌中进行原核表达。
原核表达载体的构建根据SEQ ID NO.1提供的序列，设计扩增编码完整细菌蛋白天青蛋白的核酸序列的PCR引物，经PCR扩增后将扩增的DNA片段克隆到pQE30或pGEX-T载体。然后，用氯化钙方法转入合适的大肠杆菌中，筛选和鉴定含有能表达细菌蛋白天青蛋白的重组子。
表达天青蛋白重组融合蛋白的分离和纯化取含有细菌蛋白天青蛋白的重组子的工程菌，放入含7ml LB培养液试管中，37℃振摇培养过夜。然后，按1∶100浓度比例将工程菌接种到新鲜的LB培养基中，37℃继续振摇培养3小时，然后加入IPTG(终浓度1mmol/L)，37℃继续振摇培养3小时。取IPTG诱导后的工程菌液，离心，弃上清液，用PBS悬浮细菌沉淀，然后用超声粉碎法破碎细菌。然后用柱离心法纯化重组细菌蛋白天青蛋白。
实施例4本发明所述天青蛋白的抗人髓系白血病细胞作用(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人髓系白血病细胞HL-60和K562，每孔接种0.1ml含1×105细胞完全细胞培养液1640。
(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上述制备的天青蛋白完全细胞培养液1640，与细胞混匀后，将细胞放入37℃细胞培养箱内(含5％CO2)培养48小时。
(3)终止细胞培养，用MTT法测定培养细胞活力。
(4)结果发现10-20ug/ml细菌蛋白天青蛋白对上述人髓系白血病细胞HL-60和K562生长抑制率达到80％以上作用，而对相应的正常细胞生长无明显抑制作用。
(5)用流式细胞术分析结果表明细菌蛋白天青蛋白能明显诱导上述人髓系白血病细胞HL-60和K562发生凋亡，在10-20ug/ml细菌蛋白天青蛋白作用48小时后人髓系白血病细胞HL-60和K562凋亡率大于70％。
实施例5本发明所述天青蛋白的抗人淋系白血病细胞作用(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人淋系白血病细胞Jurkat，每孔接种0.1ml含1×105细胞完全细胞培养液1640。
(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上述制备的天青蛋白完全细胞培养液1640，与细胞混匀后，将细胞放入37℃细胞培养箱内(含5％CO2)培养48小时。
(3)终止细胞培养，用MTT法测定培养细胞活力。
(4)结果发现10ug/ml细菌蛋白天青蛋白对上述人淋系白血病细胞Jurkat生长抑制率大于90％，而对相应的正常细胞生长无明显抑制作用。
(5)用流式细胞术分析结果表明10ug/ml细菌蛋白天青蛋白作用48小时后，上述人淋系白血病细胞Jurkat凋亡率大于85％。
实施例6本发明所述白天青蛋白的抗人肺癌细胞作用(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人肺癌细胞，每孔接种0.1ml含1×105细胞完全细胞培养液DMEM。
(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上述制备的天青蛋白完全细胞培养液DMEM，与细胞混匀后，将细胞放入37℃细胞培养箱内(含5％CO2)培养48小时。
(3)终止细胞培养，用MTT法测定培养细胞活力。
(4)结果发现20ug/ml细菌蛋白天青蛋白对上述人肺癌细胞生长具有明显抑制作用，抑制率大于65％，而对相应的正常细胞生长无明显抑制作用。
(5)用流式细胞术分析结果表明细菌蛋白天青蛋白能明显诱导上述人肺癌细胞发生凋亡，20ug/ml细菌蛋白天青蛋白作用48小时后，其凋亡率可达60％。
实施例7本发明所述天青蛋白的抗人乳腺癌细胞作用(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人乳腺癌细胞，每孔接种0.1ml含1×105细胞完全细胞培养液DMEM。
(2)每孔加入0.1ml含不同浓度如上述制备的天青蛋白完全细胞培养液DMEM，与细胞混匀后，将细胞放入37℃细胞培养箱内(含5％CO2)培养48小时。
(3)终止细胞培养，用MTT法测定培养细胞活力。
(4)结果发现15ug/ml细菌蛋白天青蛋白对上述人乳腺癌细胞生长具有明显抑制作用，其生长抑制率达75％，而对相应的正常细胞生长无明显抑制作用。
(5)用流式细胞术分析结果表明细菌蛋白天青蛋白能明显诱导上述人乳腺癌细胞发生凋亡，其凋亡率达70％。
实施例8本发明所述的天青蛋白的体内抗人白血病作用a)取20克左右SCID裸小鼠20只，在每只小鼠背部皮下接种1×106人白血病细胞。
b)接种一周后，将20只小鼠分成A、B两组，每组各十只。其中A组每只小鼠腹腔内每天注射100ug如上述制备的细菌蛋白天青蛋白。同时观察肿瘤生长情况和小鼠生长情况。
c)4周后处死实验小鼠，测量和记录小鼠背部肿瘤生长情况和小鼠本身的生长情况。
d)结果发现每天腹腔注射100ug细菌蛋白天青蛋白A组小鼠其背部肿瘤生长明显受到抑制，而未注射细菌蛋白天青蛋白B组小鼠其背部肿瘤生长良好。A组小鼠平均瘤重仅为对照组B组的1/4左右。
e)经病理组织切片观察分析结果表明注射细菌蛋白天青蛋白实验组瘤组织内很少见到生长活跃的瘤细胞，而对照组瘤细胞生长十分活跃。
f)注射细菌蛋白天青蛋白实验组小鼠在整个实验过程中未见明显毒副作用。
序列表<110>浙江大学医学院附属第二医院养生堂有限公司<120>具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白天青蛋白及其用途和含有其的药物组合物<130>IDC020055<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1284<212>DNA<213>Pseudomonas aeruginosa<400>1ctgcaggctc tgcgggatga tcccgatcac ttcgccgccg cggccaatgc ggcgtccgcc 60acggtgccca tcagaccgac cgcgccgcca ccgtagacca gggtcaggcc gcgctcggcc120aggtgccggc cgagggccac ggcggcttcc tggtagaccg gggaagcgcc ggggctggcg180ccacagaata cgcagacgga acgcaaggtc atgatcgact cctgtcgggg gtggaaaaag240gcgcacaggg tagcggctgg gagcgcttcg accaagccgt gcgaagcatt gccggacgtt300gcgtcgcagg cgcgaagcgg cacatctgtg ctaaaacagg agttccccgt agtaaacgcc360gggcagatcc cgctcgatgc cccgccacgt ccggttcggg tttgacctga atcagtggaa420ctcggtgccc gatcgggcag tctgctcttt caggattcat cgcccaacct gcctaggagg480ctgctccatg ctacgtaaac tcgctgcggt atccctgctg tccctgctca gtgcgccgct540gctggctgcc gagtgctcgg tggacatcca gggtaacgac cagatgcagt tcaacaccaa600tgccatcacc gtcgacaaga gctgcaagca gttcaccgtc aacctgtccc accccggcaa660cctgccgaag aacgtcatgg gccacaactg ggtactgagc accgccgccg acatgcaggg720cgtggtcacc gacggcatgg cttccggcct ggacaaggat tacctgaagc ccgacgacag780
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1.一种具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白质天青蛋白，其特征在于，所述蛋白质具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其具有等同生物学活性的片段或其保守性变体或衍生物。
2.权利要求1所述的天青蛋白，其特征在于，所述蛋白质具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的天青蛋白，其特征在于，所述蛋白质具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
4.一种编码权利要求1所述天青蛋白的核酸序列，其特征在于，其包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其简并性变体。
5.一种制备权利要求1所述天青蛋白的方法，其选自1)联合应用分段盐析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，直接从铜绿假单胞菌培养物中分离和纯化天然型天青蛋白分子；2)根据SEQ ID NO.1提供的核酸序列设计PCR引物，用PCR技术从细菌DNA中扩增出编码天青蛋白分子基因，然后连接到合适的表达型载体中，重组生产天青蛋白分子；或3)根据SEQ ID NO.2提供的氨基酸序列，通过人工合成的方法进行制备。
6.权利要求1所述天青蛋白用于制备治疗抗肿瘤药物的用途，其中所述肿瘤包括髓系白血病、淋系白血病、大肠癌、肺癌、肝癌、胃癌。
7.一种抗肿瘤药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述天青蛋白，和任选的药学可接受的辅剂。
8.权利要求7所述的抗肿瘤药物组合物，其中还任选的含有一种或多种治疗有效量的其它已知抗肿瘤药物。
9.一种用于检测样本中是否存在天青蛋白分子的方法，包括利用SEQ ID NO.2蛋白多肽序列制备的单克隆抗体或多克隆抗体；用所得抗体依据选自酶免疫试验、免疫组织化学技术、免疫印迹的技术检测样本中天青蛋白分子存在与否。
全文摘要
本发明涉及一种具有广谱抗肿瘤作用的细菌蛋白天青蛋白，其编码核酸序列，以及所述蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明还公开了所述蛋白质的氨基酸序列以及编码所述蛋白质的核酸序列。本发明还公开了一种含有治疗有效量的天青蛋白的药物组合物。本发明还涉及所述蛋白质的制备方法和在样品中检测所述蛋白质的方法。
文档编号G01N33/577GK1506375SQ0215710
公开日2004年6月23日 申请日期2002年12月12日 优先权日2002年12月12日
发明者徐荣臻, 郑树, 钟睒睒 申请人:浙江养生堂天然药物研究所有限公司, 浙江大学医学院附属第二医院