一种治疗肿瘤的包载紫杉醇的聚合物胶束及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物医药技术领域，涉及包载紫杉醇的聚合物胶束，尤其涉及一种治疗 肿瘤的包载紫杉醇的聚合物胶束及其制备方法，本发明的聚合物胶束能提高紫杉醇载药量 并提高耐药性肿瘤治疗作用。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了紫杉醇（Paclitaxel，PTX)，是从红豆杉属植物紫杉的树干和树皮 中提取得到的紫杉烯环的二萜类化合物，分子式为C 47H51NO14，分子量853. 91Da，结构式如下 式所示：
紫杉醇是目前一线广谱抗肿瘤药物，其疗效显著，研究显示，紫杉醇通过促进纺锤体微 管蛋白的聚合，抑制解聚，保持微管蛋白稳定，从而抑制肿瘤细胞有丝分裂过程，进而起到 抗肿瘤作用。紫杉醇在水中的溶解度小于1 μ g/ml,目前临床使用的紫杉醇上市制剂主要由 聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇组成。尽管在一定程度上增加了紫杉醇的溶解度，解决了给药 的问题，但却仍存在如下诸多问题，主要包括：1、较强的血液毒性；2、过敏反应发生率高； 3、骨髓抑制。
[0003] 为了解决紫杉醇的给药问题，目前已经有很多以水为溶媒的紫杉醇制剂研究，其 中聚合物胶束用于递释紫杉醇治疗肿瘤得到了越来越多的关注，如两亲性嵌段聚合物在水 溶液中可自发形成具有核壳结构的胶束，其外壳亲水，疏水内核可作为紫杉醇的储库。但目 前已报道的胶束多存在载药量低，稳定性差的问题，理想的混合胶束甚至可以弥补单一胶 束载药量低、不耐稀释等缺点。
[0004] 研究还显示，紫杉醇为典型的P-gp外排底物，多次给药后存在明显的肿瘤多药耐 药性MDR (Multidrug resistance, MDR)现象。多药耐药性（Multidrug resistance, MDR) 是指肿瘤细胞对一种化疗药物耐药的同时，也对与其结构无关、作用机制不同的其他药物 产生交叉耐药，是临床上肿瘤化疗失败的主要原因之一。研究发现由膜蛋白介导的药物外 排是产生MDR最重要的机制，由于P-糖蛋白（P-gp)的过度表达，肿瘤细胞外排化疗药物的 能力增强，药物在细胞内的蓄积减少，从而产生耐药性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种紫杉醇的新剂型，具体涉及 一种治疗肿瘤的包载紫杉醇的聚合物胶束及其制备方法，更具体的，本发明的聚合物胶束 是紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束，该混合胶束能有效地增加紫杉醇的溶解度， 提高胶束系统的载药量，达到35%(w/w)，同时载体中Vitamin E-TPGS可以发挥逆转肿瘤 MDR的作用，增强了对耐药性肿瘤的治疗能力。
[0006] 本发明提供了一种治疗肿瘤的包载紫杉醇的聚合物胶束，其特征是，所述聚合物 胶束紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束，通过下述方法制备，采用薄膜分散法，包括 步骤： (I) PEG2000-PLA、Vitamin E-TPGS、紫杉醇充分溶解于有机溶剂中，使材料和紫杉醇形 成均匀的溶液I; ⑵将溶液I旋转蒸发除去有机溶剂，制得以PEG2000-PLA和Vitamin E-TPGS为载体的 紫杉醇薄膜； ⑶将上述薄膜水化，制得以PEG2000-PLA和Vitamin E-TPGS为载体的紫杉醇胶束溶液 II ； ⑷向上述紫杉醇胶束溶液II中加入冻干保护剂，过滤除菌； (5)冷冻干燥除去水分，制得干燥的紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束冻干剂。
[0007] 本发明中，所述的PEG2000-PLA，PEG的分子量为2000,与PLA的嵌段比为（40:60) ~ (60:40)，即PLA的分子量为1333~3000,总分子量在3333~5000。
[0008] 本发明中，所述的如下式所示Vitamin E-TPGS，是D-a-Vitamin E和PEG的酯化产 物，其中PEG的分子量为500~5000，
该Vitamin E-TPGS，是较好的乳化剂，增溶剂，在水中可以较低的CMC形成稳定的胶 束，Vitamin E-TPGS主要是通过对P-gp ATP酶的变构调节从而阻断肿瘤细胞P-gp外排泵 的能量来源，进而抑制其外排作用； 本发明中，所述的聚合物材料为：且仅可为PEG2000-PLA和Vitamin E-TPGS两种； 所述 PEG2000-PLA 与 Vitamin E-TPGS 的质量比在（5:95) ~ (95:5); 本发明中，所述载体材料与紫杉醇的质量比为（2:1) ~ (1000:1); 本发明中，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙醚、丙酮、甲醇的任 意一种； 本发明中，将PEG2000-PLA、Vitamin E-TPGS、紫杉醇充分溶解于有机溶剂中，采用搅 拌，超声或者加热的方法促进溶解。
[0009] 本发明中，所述步骤⑵中旋转蒸发温度为25~60°C ; 所述步骤⑶中水化体积为2~20ml ; 所述步骤⑶中水化介质为去离子水、生理盐水、PBS的任意一种； 所述步骤⑷中冻干保护剂为甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、葡聚糖、氨基 酸或聚乙二醇中的任一种，或者它们的混合物，所述过滤除菌是指经过0. 22 μ m的微孔滤 膜过滤除菌。
[0010] 本发明利用生物相容性良好的PEG-PLA与Vitamin E-TPGS构建混合胶束，包载 紫杉醇于形成的疏水性内核中，进一步制备逆转MDR的紫杉醇胶束递释系统：取稀释后的 PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束溶液适量，滴加在覆盖碳膜的铜网上，2. 0%磷钨酸负染， 室温干燥后置于透射电镜下观察，粒径在16nm左右，分别如图1、图2所示。
[0011] 本发明所采用的方法为薄膜分散法，但并不局限于该方法，也可以采用透析法、乳 化法或冻干法。
[0012] 将本发明得到的混合胶束冻干品于4°C放置6个月，并于0、10、20天、1、2、4和6 月定期取样测定复溶后紫杉醇含量和胶束粒径，结果显示所述的胶束以动态光散射法测定 的粒径范围为IOnm-IOOnm (如图3所示)。
[0013] 本发明以香豆素6为探针考察PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束对细胞摄取药 物的影响，结果显示，摄取Ih后混合胶束的荧光强度显著强于普通胶束，证明细胞对混合 胶束的摄取量显著多于普通胶束，本混合胶束给药系统具有较好的逆转MDR效果，如图4所 /Jn 〇
[0014] 本发明采用MTT法考察空白载体材料对A549肿瘤细胞的毒性，空白混合胶束对 A549的IC5。值大于lmg/ml，说明PEG-PLA和Vitamin E-TPGS均为生物相容性较好的载体 材料(如图5所示);本发明采用MTT法分别考察载紫杉醇的PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合 胶束对KB肿瘤细胞和耐药株KBv肿瘤细胞的细胞毒作用，结果显示对A549和KBv耐药肿 瘤细胞株的IC 5。值分别为0. 05Pg/ml和0. 82Pg/ml ;对于KB敏感细胞（a)，混合胶束组与 普通胶束组并无显著性差异；对于KBv耐药细胞（b)，3种紫杉醇制剂的IC5。值排序为混合 胶束 < 普通胶束< 游离紫杉醇，两两之间均具有显著性差异（P〈 0.05)(如图6所示)，结 果证实混合胶束确实可以逆转肿瘤MDR从而提高紫杉醇的细胞毒性。
[0015] 本发明进一步以荷有A549皮下瘤的裸鼠为动物模型，通过静脉给予普通胶束和 混合胶束，进行体内药效学评价实验，给药16天后常规处理裸鼠并分离皮下瘤，结果显示， 本混合胶束对A549耐药肿瘤的药效明显优于普通胶束(如图7显示)。
[0016] 本发明进一步以健康比格犬为模型，通过60分钟静脉滴注对其进行药动学评价 实验，结果如图8所示，所得胶束对比格犬60分钟滴注的药动学过程符合二室模型，其中 t1/2 ( α )为 6-10min，t1/2 ( β )为 300-400min，CL 的范围在 0· 01-0. 02L/min/kg 之间，具有向 全身组织快速分布的特点，能降低紫杉醇的血浆暴露率，从而降低了血液毒性。
[0017] 本发明的一种载有紫杉醇的PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束及其冻干制剂，与 市售的普通紫杉醇胶束相比，具有如下优点：该制剂不仅可以提高载药量，减少药物的不良 反应，还同时具有逆转肿瘤MDR的效果以及提高抗肿瘤的治疗效果。
【附图说明】
[0018] 图1为紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束的粒径分布图。
[0019] 图2为紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束的透射电镜照片，制备的混合胶 束分散均匀，且无团聚现象。
[0020] 图3为紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束冻干品的长期稳定性结果。考 察指标为紫杉醇含量（PTX amount)和胶束粒径（size)。
[0021 ] 图4为A549肿瘤细胞对PEG-PLA胶束15min的摄取量㈧和60min的摄取量（B); 对混合胶束15min的摄取量（C)和60min的摄取量（D)。
[0022] 图5为空白胶束材料对A549肿瘤细胞的细胞毒评价。
[0023] 图6为游离紫杉醇（Free PTX)、普通胶束（PEG-PLA micelles)和混合胶束（PV mixed micelles)分别对敏感肿瘤细胞KB (a)和耐药肿瘤细胞KBv (b)的细胞毒作用。
[0024] 图7为荷皮下瘤裸鼠静脉注射普通胶束和混合胶束16天后的离体瘤比较。
[0025] 图8为健康比格犬60min静脉滴注混合胶束（PV-PTX micelle)的药动学曲线 (n=4) 〇
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明做详细说明，但本发明的保护范围不局限于下述实施 例。
[0027] 实施例1 : 称取 217. 5mg PEG-PLA、32.5mg Vitamin E-TPGS、100mg紫杉醇，加入 4ml 乙腈，超声使 载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40°C下旋蒸30min将有机溶剂彻底 蒸干，室温下置于真空干燥箱中过夜，除去残留少量溶剂得干燥透明的药膜骨架。然后加入 15ml去离子水在500rpm转速下恒速搅拌30min。将水化液过0. 22 μ m醋酸纤维素酯滤膜， 即得到紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束制剂。
[0028] 实施例2 : 称取 217.5mg PEG-PLA、32.5mg Vitamin E-TPGS、100mg紫杉醇，加入4ml二氯甲烷，超 声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪30°C下旋蒸30min将有机溶剂彻 底蒸干，室温下置于真空干燥箱中过夜，除去残留少量溶剂得干燥透明的药膜骨架。然后加 入IOml去离子水在500rpm转速下恒速搅拌30min。将水化液过0. 22 μ m醋酸纤维素酯滤 膜，即得到紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束制剂。
[0029] 实施例3 : 称取 217.5mg PEG-PLA、32.5mg Vitamin E-TPGS、120mg 紫杉醇，加入 4ml 二氯甲烷，超 声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪30°C下旋蒸30min将有机溶剂彻 底蒸干，室温下置于真空干燥箱中过夜，除去残留少量溶剂得干燥透明的药膜骨架。然后加 入IOml生理盐水在500rpm转速下恒速搅拌30min。将水化液过0. 22 μ m醋酸纤维素酯滤 膜，即得到紫杉醇PEG-PLA/Vitamin E-TPGS混合胶束制剂。
[0030] 实施例4 : 称取 12. 5mg PEG-PLA、237.5mg Vitamin E-TPGS、120mg紫杉醇，加入 4