专利名称：一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于医学生物学领域，尤其涉及一种广谱抗人Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-Rl及单克隆抗体。
背景技术：
Ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat sarcoma。Ras基因家族包括三个主要成员，S卩H-Ras, K-Ras和N-Ras，分别定位于第12、11和I号染色体，编码由188-189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，即p21Ras蛋白，三种p21Ras蛋白的氨基酸序列约有85%的同源性。p21Ras蛋白作为极其重要的信号转导传递蛋白调节细胞的正常分化和增殖。p21Ras蛋白定位于细胞膜的内侧面发挥其生物学功能。p21Ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分别与GTP和GDP结合形成一种分子开关机制。p21Ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的p21Ras-GTP形式，从而激活Ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂、增生，抑制细胞凋亡，使细胞间接触抑制减弱；而其在GTP酶激活蛋白水解下变成与GDP结合的非活性状态。当Ras基因发生突变、p21Ras蛋白过表达或Ras上游生长因子受体活化时均可导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润和转移。研究表明，大约30%的人类肿瘤中存在Ras基因突变或Ras蛋白过表达，部分学者认为Ras蛋白主要在肿瘤形成的早期阶段充当重要角色。目前国内尚未有国产化的Ras蛋白抗体，而国外的商品化抗体多是针对三种Ras蛋白的共同区域合成多肽为免疫原制备的，这样筛选出来抗体是针对多肽序列的，且国外抗体价格通常较贵，也限制了该蛋白在临床检测中的推广应用。另外，蛋白质发挥其生物学功能是要通过折叠形成一定空间构象的，那么针对多肽序列所产生的抗体就会发生由于 Ras蛋白在折叠过程中形成空间位阻，导致抗体与抗原决定簇的结合能力下降；抗体所拮抗的抗原决定簇在蛋白质折叠过程中折叠进蛋白内部不能暴露于蛋白质表面，从而不能与活性状态的Ras蛋白结合的情况。
发明内容
本发明目的是提供一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-Rl及其抗体，该抗体能用于ELISA、Western、免疫组织化学检测Ras蛋白，同时可为后续的Ras细胞内抗体的制备奠定基础。本发明的一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-Rl，于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国武汉武汉大学)，保藏号CCTCCNO C201197o所述的广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体，其特征在于该抗体是将分泌广谱抗p21Ras蛋白的交瘤细胞株KGH-R1，IX IO6个注射入预先经灭菌液体石蜡处理过的Balb/c小鼠腹腔内，然后待腹水足够多而小鼠处于濒死前抽取腹水，并将腹水离心收集上清获得的。本发明中，用基因合成和RT-PCR方法得到Ras基因的⑶S区全长序列，通过构建重组质粒，原核表达重组Ras蛋白，Ras蛋白复性后作为免疫原免疫小鼠，并取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0进行细胞融合，通过三种Ras蛋白的ELISA鉴定得到的。该杂交瘤细胞分泌的抗p21Ras抗体类型为IgG2b、κ。本发明中所参考的人H-Ras、K-Ras、N-Ras基因序列在GeneBank的登记号分别为NM_005343、M54968 和 BC005219。本发明中K-Ras、N-Ras基因的全蛋白表达序列(⑶S)通过人工合成方式获得。H-Ras的CDS区全长序列是从肝癌细胞株7703 (来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)中由RT-PCR方法获得，扩增基因引物序列为，正义链5’ -GGATCCAGAGGAGCGATGACGGAATATA-3’，上游引入 BamH I 酶切位点，反义链5’-AAGCTT GGTGGCATTTGGGATGTTC-3’，下游 引入Hindm酶切位点，原核表达载体为PET-28a ( + )。所述杂交瘤细胞株KGH-Rl的制备方法是将原核表达的p21Ras_H、p21Ras_N、p2IRas-K三种Ras蛋白经亲和纯化、复性后，用p21Ras_H为免疫原免疫小鼠，取血清效价大于I: IO6的Balb/c小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG_4000进行融合，经次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶脱氧核苷培养液(HAT)选择性培养(含20%的胎牛血清和RPMI-1640培养基)，用分别包被有复性后的H-Ras、K-Ras、N-Ras蛋白的ELISA板进行ELISA筛选，经过多次有限稀释，筛选出稳定分泌高效价的同时拮抗人p21Ras-H、p21Ras-N、p21Ras-K的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为KGH-Rl。KGH-Rl单克隆抗体的制备方法是以IX IO6个/只的细胞数将杂交瘤细胞KGH-Rl注入BALB/c小鼠腹腔，饲养10-14天，每日观察小鼠状况，等小鼠腹部膨胀时抽取腹水，以分别包被有三种Ras蛋白的ELISA板进行抗体效价及特异性鉴定；染色体计数确认融合成功；免疫层析实验鉴定抗体亚型；进一步用纯化的三种Ras蛋白行SDS-PAGE，以上述杂交瘤细胞株KGH-Rl的培养液上清(含所分泌的抗体)为一抗进行Western blot鉴定；并以该上清为一抗对19株肿瘤细胞株，分别是人胃癌细胞株BGC-853、MKN28，人肝癌细胞株QGY-7703、SMMC-7721、H印G2，人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCT-7，人白血病细胞株 THP-I、K562、MT4 CD4+、Daud I、C8166 CD4+、HL60，人宫颈癌细胞株 HeLa，人喉鳞癌细胞株H印-2，人卵巢癌细胞株SK0V3，人结直肠癌细胞株HCTl 16，人膀胱癌细胞株T-24 (以上细胞株均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)进行免疫细胞化学检测；对人体各系统常见的癌肿及正常组织进行免疫组织化学检测。结果显示该单克隆抗体的敏感性及特异性均较高，可特异性识别天然构象的p21Ras-H、p21Ras-N、p21Ras_K,可用于临床诊断性实验。本发明利用大肠杆菌原核表达H-Ras、K-Ras, N-Ras基因CDS区(蛋白编码区)的全长序列，通过蛋白质复性后恢复Ras蛋白的活性空间构象，用复性后的p21Ras-H作为免疫原免疫小鼠，并分别用p21Ras-H、p21Ras_N、p21Ras_K蛋白进行ELISA筛选，由于三种p21Ras蛋白的氨基酸序列约有85%的同源性，最终获得同时拮抗三种活性状态Ras蛋白的广谱单克隆抗体，该针对p21Ras蛋白的单克隆抗体可用于Ras蛋白的临床检测,还可进一步构建细胞内抗体，通过拮抗过表达的Ras蛋白，抑制组织的恶性转化而起到积极的预防肿瘤发生作用，对过表达Ras蛋白的肿瘤则起到积极的靶向治疗作用。
图I 为 PET_28a(+)图谱。图2为H-Ras- PET_28a(+)测序 部分序列。图3为K-Ras- PET_28a(+)测序部分序列。图4为N-Ras- PET_28a(+)测序部分序列。图5 为 p21Ras 的 Western blot 分析；
M :低分子量蛋白标准(Marker),
泳道1-3 :分别为纯化后的H，K，N-p21Ras蛋白，
泳道4 :阴性对照为不含重组质粒的空白细菌诱导后的上清。图6腹水抗p21Ras单克隆抗体效价测定；
检测杂交瘤细胞KGH-Rl腹腔注射小鼠后诱导产生腹水中抗体的效价，稀释倍数依次为 I :300,1 :600,1 :1200、1:2400、1 :4800,1 :9600,1 :19200,1 :38400,1 :76800,1 153600。图7为杂交瘤细胞染色体检测瑞士染色400 X，染色体数目约为97条。图8为抗p21Ras单克隆抗体免疫蛋白的类型及亚型检测，类型为IgG2b、κ。图9为抗p21Ras单克隆抗体的Western blot检测；
其中，泳道1-3 :分别为原核表达的H-Ras, K-Ras, N-Ras蛋白，
泳道4-10 :分别为肿瘤细胞株QGY7703，T24, H印2，SK0V3, HCTl 16，SMMC7721, BGC853 提取的蛋白。图10为抗H-Ras，K-Ras, N-Ras单克隆抗体对肿瘤细胞株免疫组化染色结果； 其中，图 A、B、C、D 分别为 HCT116、QGY7703、BGC853、SK0V3 细胞株 ICC 染色 SP 法 400 X
(胞质和胞膜阳性，细颗粒状)。图11为抗p21Ras_H、N、K单克隆抗体对乳腺癌组织免疫组化结果；
SP法200X 400X (胞质和胞膜阳性，细颗粒状)。图12为抗p21Ras_H、N、K单克隆抗体对膀胱癌组织免疫组化结果；
SP法200X 400X (胞质和胞膜阳性，细颗粒状及环胞膜深染状)。图13为抗p21Ras_H、N、K单克隆抗体对结肠癌组织免疫组化结果；
SP法200X 400X (胞质和胞膜阳性，细颗粒状及点彩状)。
具体实施例方式实施例I :
(I)免疫原的制备
从肝癌细胞株7703 (中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)中提取细胞总RNA，逆转录、PCR扩增H-Ras基因⑶S区。采取全基因合成技术，按照Genebank中编号为M54968和BC005219的序列分别人工合成K，N-Ras mRNA对应的⑶S区，构建原核表达载体H-Ras-PET-28a (+)、K-Ras-PET_28a (+)和 N-Ras-PET_28a (+)，在大肠杆菌 BL21 (DE3)中表达，利用Ni2+-NTA亲和层析纯化，梯度透析复性获得纯度在95%以上的复性重组人H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白，分别命名为 p21Ras_H、p21Ras_K、p21Ras_N。(2)分泌广谱抗p21Ras蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株KGH-Rl的建立 ①BALB/c小鼠的免疫
以纯化的p21Ras-H为免疫原，免疫4-6周龄的BALB/c小鼠。第一次免疫时将p21Ras_H与等量的完全福氏佐剂混合以每只100μ g/500ul的量多点注射到小鼠皮下；隔两周后将p21Ras-H与等量的不完全福氏佐剂混合，以每只100 μ g/500ul的量皮下多点注射；再隔两周分别进行第三、四次免疫用PBS稀释p21Ras-H，以每只100 μ g/500 μ I的量改由腹腔注射。于第四次注射5天后尾静脉取血进行ELISA检测效价，取效价大于I: IO6的Balb/c小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法进行融合。②杂交瘤细胞的制备
在无菌操作台内，取第四次加强免疫后3天的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞与处于对数生 长期的SP2/0细胞按二者数量比5 :1放于50ml无菌圆底玻璃刻度离心管内，用20ml预温至370C的无血清RPMI 1640培养液洗涤细胞，IOOOrpm离心10分钟，弃上清，用手指轻弹离心管底使细胞沉淀呈糊状，然后在37°C水浴中缓慢、逐滴、沿离心管内壁加入预温的I ml浓度为50%的聚乙二醇，边加边轻轻转动离心管，确保在一分钟内加完，加完后静置一分钟。立即滴加预温至37°C的无血清RPMI1640培养液15 ml以终止聚乙二醇的作用，第一分钟内逐滴、缓慢滴加完I ml ;第二分钟内滴加3 ml ;第三分钟加完剩余的11 ml，最后补加预温至37°C的无血清RPMI1640培养液至40ml，轻柔混匀，IOOOrpm离心10分钟，弃上清，缓慢加入30ml预温至37°C的含20% (V/V)新生小牛血清的HAT选择性细胞培养液重悬细胞沉淀，混匀，铺预先制备好的加有小鼠腹腔饲养细胞的96孔细胞培养板3块，放37°C、5%C02恒温细胞培养箱内培养。③杂交瘤细胞的筛选和单克隆化
融合成功的杂交瘤细胞进行间接ELISA法筛选出分泌广谱拮抗p21Ras-H、p21Ras_K、p21Ras-N抗体的细胞株。用PH 9. 6的O. 05M碳酸盐缓冲液将p21Ras_H、p21Ras_K、p21Ras-N分别稀释至5μ g/ml，在每个酶标板孔内加入100 μ I稀释后蛋白液，4°C冰箱内过夜包被。第二天弃孔内液体，吸水纸上拍干，每孔加入O. 15M PBS-Tweenz洗漆缓冲液300 μ 1，置震荡摇床上，200rpm，振摇3分钟，弃孔内液体，吸水纸拍干，重复洗涤3次。每孔加入1%BSA-PBS封闭液100 μ 1，置37°C恒温恒湿细菌培养箱内孵育I小时，洗板三次。每孔加入100 μ I适当稀释的杂交瘤细胞培养上清为一抗，置湿盒内37°C恒温孵育I小时后洗板三次，同时设置空白、阴性、阳性对照。每孔加入I :2000稀释的酶标二抗(HRP标记的山羊抗鼠IgG) 100 μ 1，置湿盒内37°C孵育40分钟后洗板三次。用重蒸馏水重复洗涤2次后每孔加入100 μ I新鲜配制的TMB (四甲基联苯胺)底物液，避光作用5-10分钟，当阳性对照明显呈蓝色而空白、阴性对照呈无色时即可每孔加入2Μ H2SO4 50 μ1终止反应。放酶标仪内读取OD45tl值，凡待测孔值/阴性对照孔值> 2即为阳性。将准备克隆化的杂交瘤细胞群落从细胞培养瓶或培养板孔内轻轻吹下，显微镜下细胞计数，用含20% (V/V)新生小牛血清的HT (次黄嘌呤胸腺嘧啶脱氧核苷)细胞培养液稀释为5-10个细胞/ml。在加有饲养细胞，如小鼠腹腔巨噬细胞的96孔酶标板内每孔加入100μ I稀释后的杂交瘤细胞悬液，置37°C、5%C02恒温细胞培养箱内培养。大约第三天可见细胞培养孔内杂交瘤细胞克隆形成并记录克隆个数，第5天小心半量换取含20%(V/V)新生小牛血清HT细胞培养液，第7天补加HT细胞培养液100 μ I,继续培养直至再次间接ELISA检测上清中的特异性抗p21Ras单克隆抗体。选择再次ELISA法检测时效价高、呈单个克隆生长、形态良好的杂交瘤细胞据需按照上述方法重复进行3次亚克隆和扩大培养，第2-4次克隆化时换用含20% (V/V)新生小牛血清RPMI1640细胞培养液代替20% (V/V)新生小牛血清的HT选择性细胞培养液。将第四次克隆化后，上清抗三种Ras蛋白的杂交瘤细胞命名为KGH-Rl，送中国典型培养物保藏中心保藏。(3)广谱抗p21Ras蛋白单克隆抗体的大量制备及效价测定
将杂交瘤细胞KGH-Rl注射入预先经灭菌液体石蜡处理过的Balb/c小鼠腹腔内(I X IO6个/只)，每天密切观察小鼠情况，待腹水足够多而小鼠处于濒死前抽取腹水，离心收集上清，加入终浓度为O. 2g/L叠氮钠备用。将制备的腹水倍比稀释后进行间接ELISA法
测定其效价，结果示5株单抗的效价均在I :100000以上。(4)单克隆抗体的特征性鉴定
①分泌广谱抗p21Ras蛋白的杂交瘤细胞株染色体检测
将杂交瘤细胞株KGH-Rl传代培养48小时后加入O. 1%秋水仙素应用液，使其终浓度为O. 05-0. I μ g/ml，继续培养2. 5小时。用IOml移液管轻轻吹下半贴壁生长的杂交瘤细胞，移入15毫升无菌刻度离心管内，IOOOrpm,离心10分钟，弃上清，加入5毫升预温至37摄氏度的O. 075mol/L氯化钾溶液，用滴管轻轻吹打混匀，放37摄氏度水浴内15-20分钟，加入I毫升新鲜配制的固定液并混匀，IOOOrpm,离心10分钟，弃上清，细胞沉淀加入5毫升固定液，室温下静置30分钟，IOOOrpm,离心10分钟，弃上清，细胞沉淀加入2_5毫升固定液后轻轻吹散细胞。吸取2-3滴细胞悬液滴于预冷的洁净载玻片上，立即轻轻吹散细胞，在酒精灯火焰上通过几次使细胞平铺于载玻片上，自然干燥后用瑞士染液染色10分钟，用蒸馏水洗去染色液，自然干燥后用中性树胶封片，显微镜下计数100个完整的分裂中期的杂交瘤细胞核，记录染色体数目。杂交瘤细胞株的染色体数目大约为97条，提示融合成功。②广谱抗p21Ras单克隆抗体的免疫球蛋白亚型的鉴定
根据试剂盒说明书用O. OlM pH7. 3的PBS应用液将待测的杂交瘤细胞KGH-Rl培养上清稀释到终浓度为I. O μ g/mlo从小鼠单克隆抗体分型检测试剂盒内(英国AbD Serotec公司datasheet:MMTl;Batch NO: 19118; 10 tests)取出检测试纸条和密封的含有耦联上呈色微颗粒的羊抗鼠免疫球蛋白冻干粉的试管，置室温下片刻，吸取150 μ I上述新鲜稀释的杂交瘤细胞培养上清加入试管内，室温下静置30秒后轻轻混匀，将试纸条的红色一端插入试管底部，当阳性对照显色明显时，及时将试纸条从试管内取出以终止反应，风干试纸条，判断结果。结果显示5株杂交瘤细胞分泌的抗p21Ras抗体类型均为IgG2b、κ轻链,为单克隆性。③Western blot法鉴定抗p21Ras单克隆抗体的肿瘤特异性
将原核表达的三种p21Ras蛋白、原核表达空载体BL21细菌裂解液的阴性对照及19种肿瘤细胞株，分别是人肝癌细胞株QGY-7703，人胃癌细胞株BGC-853，人白血病细胞株THP-1，人白血病细胞株K562，人白血病细胞株MT4⑶4+，人白血病细胞株Daud I,人结肠直肠癌细胞株HCT116，人膀胱移行细胞癌细胞株T-24，人肝癌细胞株SMMC-7721，人喉鳞癌细胞株H印2，人胃癌细胞株MKN-28，人肝癌细胞株H印G2，人卵巢癌细胞株SK0V3，人白血病细胞株C8166 CD4+，人白血病细胞株HL60，人宫颈癌细胞株HeLa，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人乳腺癌细胞株MDA-MB-435，人乳腺癌细胞株MCF7 (上述肿瘤细胞株均来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)的蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳，目的条带在电转仪内转移到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，封闭后加入从杂交瘤细胞的培养上清，37°C恒温恒湿孵育I小时进行免疫杂交。加入适当稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG (从Lengton生物公司获得，Cat No:LTE007), 37°C恒温恒湿孵育I小时进行DAB(3, 3’ - 二氨基联苯胺)显色或化学发光法显色。结果显示KGH-Rl杂交瘤细胞生产的抗p21Ras单克隆抗体能与原核表达的三种p21Ras蛋白结合，同时也能与肿瘤细胞所提取的p21Ras蛋白结合且表观分子量大小正确。④免疫组织化学鉴定抗p21Ras单克隆抗体的肿瘤特异性
将呈对数生长期的上述19种肿瘤细胞株收集于刻度离心管内，离心弃上清，细胞沉淀用生理盐水洗一遍，离心弃上清，用95%乙醇重悬细胞沉淀，离心后让细胞沉淀在95%乙醇·中固定3小时，小心取出肿瘤细胞沉淀块按常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入本申请人制备的广谱抗Ras蛋白的杂交瘤细胞上清作为一抗，免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测肿瘤细胞表达p21Ras蛋白的情况，所用免疫组化标记试剂盒为美国Thermo公司产品(UltraVision Plus Detection System,REF:TP-125-HLX，L0T:HLX-90609)。结果显示本室制备的单克隆抗体与其中的15种肿瘤细胞株呈阳性反应。选取人体各系统常见的肿瘤病例及正常组织进行免疫组化检测。SP法试剂盒为美国 Thermo 公司产品(UltraVision Plus Detection System,REF:TP-125-HLX，L0T:HLX-90609)。首先镜下重新审阅各病例的苏木素伊红(HE)染色切片，选取病变完整且无明显的出血、坏死的肿瘤蜡块进行厚度为4um切片。用防脱片载玻片捞取组织后，按常规脱蜡、水化及高压抗原修复后，加入过氧化氢(H2O2)阻断内源性过氧化物酶，用Ultra V Block (TA-125-UB)封闭玻片后加入本室制备的广谱抗Ras蛋白的杂交瘤细胞上清作为一抗过夜孵育，加入生物素化羊抗鼠IgG(BiotinylatedGoat Anti-polyvalent plus, TS-125-BNS)作为二抗，加链霉亲和素过氧化物酶复合物(TS-125-HRS)后用DAB (3，3’ - 二氨基联苯胺)进行显色，显色时间控制在目的标记细胞或组织着色而背景不着色为准。切片经苏木素复染，常规中性树胶封片后进行镜下观察。每次实验均设立阳性及阴性对照。实验结果判定按染色强度及染色细胞百分数进行记分及统计分析。结果显示本申请人制备的抗p21Ras单克隆抗体与肺鳞状细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、皮肤基底细胞癌、皮脂腺癌、B细胞淋巴瘤等中的绝大多数病例呈明显阳性反应，阳性表达部位为细胞膜及细胞质，可以呈细颗粒、环胞膜深染状及胞质内点彩状染色，见附图12、13、14。正常组织表达阳性细胞数一般均少于5%，染色强度亦为弱阳性。所有病变中的纤维间质、血管等均呈阴性。结果证实本申请构建的单克隆抗体具有良好的肿瘤特异性。
权利要求
1.一种广谱抗人p21RaS蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1，于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO :C201197。
2.一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体，其特征在于该抗体是将分泌广谱抗p21Ras蛋白的交瘤细胞株KGH-Rl，I X IO6个注射入预先经灭菌液体石蜡处理过的Balb/c小鼠腹腔内，然后待腹水足够多而小鼠处于濒死前抽取腹水，并将腹水离心收集上清获得。
全文摘要
一种广谱抗人p21Ras蛋白的单克隆抗体交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体，属于医学生物学领域，尤其涉及一种广谱抗人Ras蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株KGH-R1及单克隆抗体。该杂交瘤于2011年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNOC201197。本发明最终获得同时拮抗三种活性状态Ras蛋白的鼠单克隆抗体，该针对p21Ras蛋白靶点的单克隆抗体可用于该蛋白的临床检测，还可进一步构建细胞内抗体，通过拮抗过表达的Ras蛋白，抑制组织的恶性转化而起到积极的预防肿瘤发生作用，对相应过表达Ras蛋白的肿瘤则起到积极的靶向抗癌作用。
文档编号C12N5/20GK102796707SQ201210321970
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者杨举伦, 陈玥, 甄时建, 周云刚, 赵稳兴 申请人:杨举伦