专利名称：检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法。
背景技术：
错配识别蛋白(mismatch binding protein,MutS)是错配修复系统行使修复功能的第一个蛋白，能够识别并结合全部八种碱基错配 ，还能识别结合I至4个核苷酸插入或缺失形成的loop环结构引起的错配。 利用MutS的上述特殊功能，近年来己有一些研究探索MutS在检测和富集突变以及检测SNP方面的应用。其中，Rober Wanger等提出了一种利用固定化的MutS检测突变的方法，大致包括以下步骤1)将含有MutS溶于反应缓冲液中，所述反应缓冲液为pH7. 6，含有5mM氯化镁，O. ImM 二硫苏糖醇，O. OlmMEDTA的Tris-HCl溶液；2)将预湿的硝酸纤维膜置于48孔板中，加入含有MutS的反应缓冲液，每孔含有的MutS 500ng，室温反应20min ；3)然后加入3% BSA, 200 μ L/孔，封闭lh，洗去封闭液；4)将待测DNA溶于含有3% BSA的反应缓冲液中，并加至经步骤3)处理后的48孔板中，O. 05 μ g/ μ L-0. 5 μ g/ μ L，20 μ L，室温反应30min ;5)用100 μ L反应缓冲液冲洗5次；6)加入含O. 05 μ g/mL的链霉亲和素_辣根过氧化物酶(Str印tavidin-HRP)，含BSA的反应缓冲液，100 μ L/孔，室温反应20min ；7)用100 μ L反应缓冲液冲洗5次；8)将硝酸纤维膜从48孔板中移出，用反应缓冲液冲洗,吸干，然后浸入化学发光试剂(ECL development solution, Amersham)中反应lmin,吸干后用X射线拍图。上述基于MutS检测突变的方法中检测步骤繁琐，检测效率不高，且无法直接排除检测结果中的假阴性结果，准确率不高。如果要排除检测结果中的假阴性实验结果，需要对同一样品进行重复检测，这就必然进一步降低检测效率，需要更多的待测样品，而且这种重复检测也仅仅能排除假阴性中因检测步骤中的失误引起的假阴性结果，而对于实验材料，如固定有MutS的固相载体上固定的MutS单位密度过低而引起的假阴性结果无能为力。上述方法中披露了一种固定有MutS的固相载体，在具体的检测应用中，该固定有MutS的固相载体检测步骤繁琐，检测效率不高，且至少需要两个固定有MutS的固相载体才能排除检测结果中的部分假阴性结果。基于上述方法披露的固定有MutS的固相载体形成的试剂盒同样存在上述问题。因此需要一种新的检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法，该固相载体、试剂盒在实际应用中能够减少检测步骤，提高检测效率，排除检测结果中的假阴性结果，提高检测结果的准确率；该检测核酸突变的方法能够减少检测步骤，提高检测效率，排除检测结果中的假阴性结果，提高检测结果的准确率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法，旨在解决现有技术检测步骤繁琐、检测效率不高、检测结果准确率低的问题。一种检测核酸突变的固相载体，所述固相载体表面固定有MutS ;所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。其中，所述报告基团可为荧光标记基团或无荧光标记基团。其中，所述无荧光标记基团优选为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、亲和素或链霉亲和素。上述任一种方案中，所述固相载体表面为适于包被蛋白的材料。优选的，所述材料包括天然纤维素、被修饰的纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龙、聚丙烯酰胺、琼脂糖、橡胶、金属、金属氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一种。
一种检测核酸突变的试剂盒，包括检测核酸突变的固相载体；所述固相载体表面固定有MutS ;所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。其中，所述固相载体可采用本发明的检测核酸突变的固相载体中的任一种。其中，所述试剂盒还可包括标准品；所述标准品包括阳性标准品和阴性标准品；所述阳性标准品为含有碱基错配或由I至4个核苷酸缺失或插入引起的错配的双链核苷酸分子；所述阴性标准品为完全互补的双链核苷酸分子。其中，所述试剂盒还可包括用于扩增特定区域的特异性引物。上述任一种方案中，所述报告基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、亲和素或链霉亲和素；所述试剂盒还包括显色试剂；所述显色试剂，用于与所述报告基团反应进而指示固相载体上MutS的数量。一种基于本发明的检测核酸突变的固相载体检测核酸突变的方法，所述MutS所含有的报告基团为荧光标记基团或无荧光标记基团；所述荧光标记基团的荧光标记与待测样品携带的荧光标记不同；所述包括以下步骤
A.将带有荧光标记的待测样品和阴性对照品混合，变性，退火，得带荧光标记的退火产物；所述阴性对照品为完全互补的双链核酸分子，该核酸分子含有与待测样品的待检测区域的野生型序列完全相同的核酸序列；
B.将带荧光标记的退火产物加至检测核酸突变的固相载体上，使带荧光标记的退火产物中的存在错配的退火产物与固相载体上的MutS结合，洗涤除去未结合至固相载体上的退火产物；
C.检测与固相载体结合的退火产物的荧光标记和固相载体上的MutS的报告基团，以确定待测样品中是否存在突变。其中，所述步骤C可包括
Cl.荧光扫描步骤B的产物，初步确定待测样品中是否含有突变；
C2.对MutS上的报告基团进行检测，以确定固相载体上MutS的数量；
C3.根据步骤Cl和C2的结果确定待测样品中是否存在突变。其中，步骤A之前可包括步骤A0.利用带荧光标记的特异性引物对源核酸进行扩增，得带荧光标记的待测样品；或利用带荧光标记的核苷酸对源核酸进行末端标记，得带荧光标记的待测样品。上述任一种方案中，所述报告基团可为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、亲和素或链霉亲和素。上述任一种方案中，所述固相载体表面的材料包括硝酸纤维素膜、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯和尼龙中的至少一种。其中，所述步骤C可包括
Cl.荧光扫描步骤B的产物，初步确定待测样品中是否含有突变；
C2.利用显色试剂对MutS上的报告基团进行检测，以确定固相载体上MutS的数量；所述显色试剂，用于与所述报告基团反应并指示固相载体上MutS的数量；
C3.根据步骤Cl和C2的结果确定待测样品中是否存在突变。由上可知，本发明的检测核酸突变的固相载体、试剂盒,通过对固相载体上固定的MutS的特殊设计，在应用于检测核酸突变的过程中，能够减少检测步骤，提高检测效率， 排除检测结果中的假阴性结果，提高检测结果的准确率；本发明的检测核酸突变的方法能够减少检测步骤，提高检测效率，排除检测结果中的假阴性结果，提高检测结果的准确率。
图I是本发明一个实施例中克隆菌菌落PCR鉴定图。图2是本发明一个实施例中表达菌菌落PCR鉴定图。图3是本发明一个实施例中所得融合蛋白His-TthMutS PAGE电泳图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明提供了一种检测核酸突变的固相载体，所述固相载体表面固定有MutS;所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。需要说明的是所述报告基团指示固相载体上MutS的数量的方式可以是直接指示也可以间接指示；所述直接指示是指直接对报告基团进行检测，进而得出固相载体上MutS的数量，或者直接利用报告基团的数量来指示固相载体上MutS的数量；所述间接指示是指使报告基团与某些特定物质反应，然后对反应产物进行检测，进而得出固相载体上MutS的数量；在得出固相载体上MutS的数量后，可根据固相载体上用于固定MutS的表面积来计算出MutS的单位密度。所述特定物质包括但不限于辣根过氧化物酶显色剂、碱性磷酸酶显色剂、偶联有链霉亲和素的检测基团或带生物素标记的检测基团；所述特定物质与报告基团的反应将在后文中进一步阐述。本方案的检测核酸突变的固相载体，利用MutS能够结合含有错配的双链核苷酸分子的特性，能够实现对含有突变的核酸的检测，且因为MutS被固定在固相载体表面，使得整个检测步骤更为简单、方便。此外，因为MutS上含有报告基团，可以通过报告基团来检测固相载体上的MutS的数量，进而计算出MutS的单位密度，从而排除因固相载体上固定的MutS的密度过低而导致的假阴性的结果，使检测结果更为准确。上述MutS的单位密度可以是绝对密度也可以是相对密度；所述绝对密度是指利用得到的固相载体上的MuS数量除以固相载体上用于固定MutS的表面积得到的密度值；所述相对密度是指固相载体上的MutS数量或报告基团的数量，当然采用这种计算方式的前提是，各固相载体上用于固定MutS的表面积相同。此外，因为报告基团的存在，可利用报告基团对检测核酸突变的固相载体的质量进行检测和评价。其中，所述报告基团可为荧光标记基团或无荧光标记基团。对于荧光标记基团和无荧光标记基团，有以下几点需要说明。所述荧光标记基团为在吸收特定波长的光子后能够被活化并发生波长更长的光子的物质，包括但不限于异硫氰酸突光素(FITC)、罗丹明(Rhodamine)、罗丹明B (Rhodamine B)、四甲基罗丹明(TAMRA)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、罗丹明红X(RhodamineRed-X)、AmcA、4’, 6- 二脉基-2-苯基卩引噪(DAPI)、得克萨斯红(Texas Red)、藻红蛋白(R-Phycoerythrin)、Cy3、Cy5 或 5-羧基突光素(5-FAM)。当所述报告基团为荧光标记基团时，可直接通过对报告基团的检测来确定固相载体表面固定的MutS的数量(即该报告基团可通过直接指示的方式指示固相载体上MutS的数量)，进而根据固相载体的表面积计算出固相载体表面固定的MutS的单位密度。本方案 与含不能直接指示固相上MutS的数量的报告基团的方案相比，本方案的检测核酸突变的固相载体在具体使用过程中能够减少实验步骤，提高实验效率。所述无荧光标记基团为不含荧光标记、能够被直接或间接检测的物质，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、链霉亲和素或亲和素。当所述报告基团为不含荧光标记能够被直接检测的物质时，本方案与报告基团为荧光标记基团的方案一样，本方案的检测核酸突变的固相载体在具体使用过程中能够减少实验步骤，提闻实验效率。当所述报告基团为不含荧光标记能被间接检测的物质时，可通过对报告基团的间接检测来确定固相载体表面固定的MutS的数量(即该报告基团可通过间接指示的方式指示固相载体上MutS的数量)，进而根据固相载体的表面积计算出固相载体表面固定的MutS的单位密度。本方案与报告基团为能够被直接检测的方案相比，本方案的检测核酸突变的固相载体，在对报告基团的间接检测过程中，可通过信号放大的步骤，提高对固相载体上MutS数量检测的准确性。例如，当报告基团为辣根过氧化物酶时，可利用辣根过氧化物酶显色剂实现对报告基团的间接指示，进而确定固相载体表面固定的MutS的数量，进而根据固相载体的表面积计算出固相载体表面固定的MutS的单位密度。当报告基团为碱性磷酸酶时，可利用碱性磷酸酶显色剂实现对报告基团的间接指示，进而确定固相载体表面固定的MutS的数量，进而根据固相载体的表面积计算出固相载体表面固定的MutS的单位密度。当报告基团为生物素时，可基于生物素能够特异性的与链霉亲和素结合的特性，利用偶联有链霉亲和素的检测基团实现对报告基团的间接指示，进而确定固相载体表面固定的MutS的数量，进而根据固相载体的表面积计算出固相载体表面固定的MutS的单位密度，所述检测基团可为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光标记基团。同样的，当报告基团为链霉亲和素时，可利用带生物素标记的检测基团实现对报告基团的间接指示，进而确定固相载体表面固定的MutS的数量，进而根据固相载体的表面积计算出固相载体表面固定的MutS的单位密度，所述检测基团可为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光标记基团。优选的，所述报告基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、亲和素或链霉亲和素。本方案的检测核酸突变的固相载体，在对报告基团的间接检测过程中，可通过信号放大的步骤，提高对固相载体上MutS数量检测的准确性。上述任一种方案中，所述固相载体表面为适于包被蛋白的材料。优选的，所述材料包括天然纤维素、被修饰的纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龙、聚丙烯酰胺、琼脂糖、橡胶、金属、金属氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一种。以下将通过第一具体实施例来进一步说明本发明的检测核酸突变的固相载体是如何获得的。一、生物素标记的His-TthMutS蛋白的获得。I.克隆构建。I)PCR 扩增以 TthMutS-F (SEQ ID NO: I),TthMutS-R (SEQ ID NO: 2)为引物，Thermus thermophilus HB8 基因组(TaKaRa，3071)为模板，PCR 扩增 TthMutS 的编码基因， 然后将PCR产物点在O. 8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，切胶回收PCR产物，回收的TthMutS片段于-20°C保存备用。2)双酶切利用 Nde I (NEB, #R0111S)和 Not I -HF (NEB, #R3189S)分别双酶切pET-Avi质粒(江苏普罗赛生物技术有限公司，ΑΖ-Γ026)和步骤I)切胶回收的TthMutS片段，然后分别将双酶切产物在O. 8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，切胶回收，回收产物分别于-20°C保存备用。3)连接按I :5的摩尔比将步骤2)中回收产物中的双酶切回收质粒和双酶切TthMutS片段回收产物，在T4 DNA Ligase (NEB，#M0202S)的作用下16°C连接过夜。4)转化将步骤3)的连接产物转化至DH5 α感受态细胞，然后涂于含50ng/ μ LKanr的LB平板中，37°C恒温培养12tT24h。5)鉴定利用上游引物Fl (SEQ ID NO: 3)和下游引物Rl (SEQ ID NO: 4)，对步骤4)中LB平板上的单克隆进行菌落PCR鉴定，结果如图I所示。结果显示，泳道1、2、3均含有与预期产物大小相同的条带出现，初步判定泳道1、2、3对应的单克隆菌落均为阳性菌落。然后将图I中泳道I对应的阳性菌落进行扩大培养，并提取质粒，送英俊公司测序，测序结果见SEQ ID NO: 5，结果显示成功构建了 pET-His-TthMutS-Avi重组质粒。保存泳道I对应的阳性菌落。2.融合蛋白His-TthMutS的表达。I)表达菌转化将成功构建的pET-His-TthMutS-Avi重组质粒转化BL21 ( DE3 )PLysS感受态细胞，涂于含50ng/ μ L Kanr的LB平板，37°C恒温培养12tT24h。2)表达菌鉴定利用上游引物Fl (SEQ ID NO: 3)和下游引物Rl (SEQ ID NO:4)，对上述步骤I)中LB平板上的单克隆进行菌落PCR鉴定，结果如图2所示。结果显示，泳道1、2、3均含有与预期产物大小相同的条带出现，判定泳道1、2、3对应的单克隆菌落为阳性表达菌菌落。分别保存泳道1、2、3对应阳性菌落，并分别命名为1、2、3号表达菌菌株。3)表达菌培养将I号表达菌菌株接种至20mL含50ng/ μ L Kanr的液体LB培养基中，37°C，180rpm摇床培养过夜；然后取IOmL过夜培养菌液，转接至IL新鲜的含50ng/μ L Kanr的液体LB培养基中，37°C，180rpm摇床培养至OD600在O. 6至O. 7 (约3h)之间；加入IM的IPTG使其终浓度为O. 5mM,然后在37°C，200rpm摇床诱导表达6h。4)菌体回收4°C,5000rpm离心收集菌体。
3.菌体破碎。I)菌体重悬将收集的菌体在 20mL 的 Binding Buffer (IOOmM Tris-HCl, 300mMNaCl, 10% glycerol, IOmM imidazole, 5mM β-ME, 100 μ M PMSF)中重悬。2)菌体破碎将步骤I)中重悬的菌体于冰浴上超声破碎，功率500W，超声4s，间歇4s，超声裂解100次。3)将步骤2)的破碎产物在4°C，IOOOOrpm离心4min，去除菌体残骸，留上清，准备上Ni-NTA亲和柱。4.融合蛋白 His-TthMutS 的 Ni-NTA 纯化。使用再生完毕的Ni-NTA柱非变性亲和纯化融合蛋白His-TthMutS，以下操作在4°C层析柜中操作。·
I)使用 20mL Binding BufferC IOOmM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10% glycerol, IOmMimidazole, 5mM β-ME)平衡柱子。2)将步骤3中所得的上清按8mL/h的流速过柱。3)使用 Washing Solution I (IOOmM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10% glycerol, 20mMimidazole, 5mM β -ME),按 20mL/h 的流速洗至流出液 OD280 < 0. 01。4)使用 30mL Washing Solution II (IOOmM Tris-HCl,300mM NaCl,10%glycerol, 50mM imidazole, 5mM β-ME),按20mL/h的流速洗柱,监测流出液蛋白分布。5)使用 Elution Solution (IOOmM Tris-HCl, 300mM NaCl, 10% glycerol, 250mMimidazole, 5mM β -ME),按6mL/h的流速洗脱目标蛋白，监测目标蛋白分布,并收集洗脱液。5.透析除盐。I)将步骤4所得洗脱液装入透析带，使用IL 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl,1.0mMEDTA, 10%甘油，5mM β -ME的透析液，4°C透析过夜，使用磁力搅拌器对透析液进行搅拌，以加速透析过程。2)以 300mL 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl, I. OmM EDTA，50% 甘油，5mM β-ME 的储
存液对步骤I)的透析产物进行第二次透析，4°C透析3h，同样使用磁力搅拌器对透析液进行搅拌，以加速透析过程，得融合蛋白His-TthMutS纯品。然后取步骤5所得的融合蛋白His-TthMutS纯品10 μ L，加入5 μ L 3Χ蛋白上样缓冲液，煮沸5min ;取5 μ L进行点样，在5%、15%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，恒流30mA，电泳45min，考马斯亮蓝染色，结果如图3所示。如图3所示，经上述步骤纯化所得的融合蛋白His-TthMutS电泳所在泳道仅有单一条带，大小约为96kDa,说明经上述步骤纯化所得的融合蛋白His-TthMutS的纯度极高。6.融合蛋白His-TthMutS浓度的测定。使用Bradford法检测融合蛋白浓度，以商品BSA作标准曲线，具体操作方法为本领域的常规技术，在此不再赘述。所得标准曲线回归方程为y=l. 4717x-0. 1067,R2=O. 9956。取5 μ L步骤5所得的融合蛋白His-TthMutS纯品测得OD595=O. 436，代入上述方程，可算出步骤5所得的融合蛋白His-TthMutS纯品浓度为0. 535mg/mL。超滤浓缩后，以50mM Tris-HCl, 300mM NaCl，I. OmM EDTA, 50%甘油，5mM β -ME 的储存液稀释浓缩液，使其终浓度为lmg/mL，分装至洁净的EP管中，于_20°C保存。二、生物素标记的His-TthMutS的包被。
以(λ 05Μ ρΗ9. 6的碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3)为包被缓冲液将生物素标记的His-TthMutS稀释至蛋白质含量为5ng/ μ L，在96孔酶标板(生工生物工程(上海)有限公司，PEL10196)的每个的反应孔中加100 μ L 5ng/ μ L的生物素标记的His-TthMutS，4°C过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液I (ρΗ7· 4的PBST，8mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4,IOmM KC1，0. 14M NaCl，0. 1% (v/v) Tween-20)洗 3 次，200 μ L/ 孔，每次 3 分钟。洗涤后每孔加入200 μ L O. 5%的BSA，于37°C封闭2h，弃去孔内溶液，存于_20°C。经上述步骤，生物素标记的His-TthMutS被包被至96孔酶标板上,得检测核酸突变的固相载体。需要说明的是，TthMutS是MutS中的一种，发现于嗜热微生物Thermusthermophilus中,其能有效识别并结合I至3个核苷酸的插入或缺失以及所有8种类型的碱基错配产生的异源双链DNA分子，并能在低于80°C的温度下保持稳定。上述具体实施例中的Tth-MutS可用E. coli MutS> S. typhimurium MutS或其他的野生型MutS或具有错配核酸结合活性的重组MutS代替，当然相应的克隆构建过程中所使用的扩增引物和鉴定引物需进行相应的调整。不过因为TthMutS在识别和结合存在错配的异源双链DNA分子时能够耐受更高的温度，所以利用TthMutS进行核酸突变检测时，可通过提高反应温度来减 少非特异性结合，进而提高检测的准确率。另外，TthMutS对不同类型的错配突变的识别能力差异不大，而大肠杆菌MutS对不同类型的错配突变的识别能力差异则稍大，所以利用TthMutS进行核酸突变检测得到的结果更易分析，能够在定性检测突变的基础上进一步进行核酸突变的定量分析。上述具体实施例中，因为细菌中含有生物素连接酶，所以步骤一中6所纯化出的融合蛋白His-TthMutS上的Avi tag是已经被生物素化了的。当然，为了保证所有的融合蛋白His-TthMutS上的Avi tag均被生物素化，可在本具体实施例中步骤6之后增加一个步骤7，即利用生物素连接酶(例如GeneCopoeia，B0101A)的酶催化反应保证融合蛋白His-TthMutS上的所有Avi tag都被标记上生物素,相关反应条件可参考GeneCopoeia的生物素连接酶说明书。当然也可通过其他方式来实现对TthMutS或大肠杆菌MutS的生物素标记，例如化学标记法。优选通过在细菌中表达含有Avi tag的TthMutS或大肠杆菌MutS来实现对TthMutS或大肠杆菌MutS的生物素标记。因为与通过化学标记法相比,这种方式更加方便，重复性更好，且反应条件更加温和，标记的专一性更高；且生物素标记的位置不是随机分布的，与构建的融合蛋白的克隆序列中Avi tag的表达框所在位置对应，这些优点对于保持TthMutS或大肠杆菌MutS的生物活性是非常有帮助，能防止因TthMutS或大肠杆菌MutS的生物活性位点被生物素标记而导致的活性丧失。上述具体实施例中的克隆构建、融合蛋白表达、融合蛋白纯化、透析除盐等步骤所采用的方法均是本领域的常规技术手段，其中各步骤中所使用的实验材料、实验条件均可进行相应的调整。例如融合蛋白纯化过程中的Ni-NTA柱可用Ni-IMAC Sepharose FF替换；透析除盐步骤可用Q-Sepharose FF柱层析步骤替换。96孔酶标板的孔表面的材质主要为聚苯乙烯，96孔酶标板可用其他材料例如尼龙、PVDF膜、或表面为天然纤维素、被修饰的纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖、橡胶、金属、金属氧化物、玻片、硅片和陶瓷的其他材料替换。可按上述具体实施例所体现的原理，使用多种方法制备的检测核酸突变的固相载体。
此外，将生物素标记的His-TthMutS包被至固相载体表面的方法也有多种，上述具体实施例中只是选择了一种较为常见的方法，现有技术中可将蛋白包被至固相载体表面的方法均适用于本方法。再有，上述具体实施中MutS上的生物素标记也可用其他报告基团替代，可用于替代的报告基团在上面已经进行了详细的说明，在此不再赘述。当然随着报告基团的不同，使MutS带上报告基团的方法会有些不同，但是这些方法均是现有技术，在此就不再赘述，只进行简单的说明。当报告基团为荧光标记基团时，现有技术中使蛋白带上荧光标记基团的方法均适用于本发明。现有技术中有很多使蛋白带上荧光标记的试剂盒，例如生工生物工程(上海)有限公司生产的蛋白FITC标记试剂盒(货号786-059)、蛋白罗丹明标记试剂盒(货号786-058)，对于如何使用这些试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司提供了相应的说明书进行详细的说明。当报告基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、链霉亲和素或亲和素等时，现有技术中，使一种蛋白与另一种蛋白偶联的方法同样适用于本发明，现有技术中同样有很多使一种蛋白与另一种蛋白偶联的试剂盒，例如生工生物工程(上海)有限公司生产的蛋白HRP标记试剂盒(货号786-313)、蛋白AP标记试剂盒(货号786-315)等，对于如何使用这些试剂盒，生工生物工程(上海)有限公司提供了相应的说明书进行详细的说明。
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在本发明的一个具体实施例中，制备含Cy5标记的MutS的方法大致如下，配置IOmL 的反应体系，该体系pH为 7. 9，含有 IOmM HEPES,50mM KCl, 5mM MgCl2，ImM DTT,0. 2mM甲基横酸氟液，10% (v/v)甘油，12. 5 μ M Cy5 monofuctional dye (Amersham PharmaciaBiotech, Amersham, UK), lmg/mL 大肠杆菌 MutS (Genecheck Fort Collins, CO),然后在20°C反应 30min，然后用 Buffer AClOmM HEPES,50mM KCl,5mM MgCl2，ImM DTT,0. 2mM 甲基磺酰氟液，10% (v/v)甘油)透析得含Cy5标记的MutS。本发明还提供了一种检测核酸突变的试剂盒，包括检测核酸突变的固相载体；所述固相载体表面固定有MutS ;所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。需要说明的是，本方案的检测核酸突变的试剂盒所包括的检测核酸突变的固相载体可采用上述的检测核酸突变的固相载体中的任一种。本方案的检测核酸突变的试剂盒，以检测核酸突变的固相载体为基础，利用MutS能够结合含有错配的双链核苷酸分子的特性，能够实现对含有突变的核酸的检测，且因为MutS被固定在固相载体表面，使得整个检测步骤更为简单、方便；此外，因为MutS上含有报告基团，可以通过报告基团来检测固相载体上的MutS的数量，进而根据固相载体上用于固定MutS的表面积计算出MutS的单位密度，从而排除因固相载体上固定的MutS的单位密度过低而导致的假阴性的结果，使检测结果更为准确。其中，所述试剂盒还可包括标准品；所述标准品包括阳性标准品和阴性标准品；所述阳性标准品为含有碱基错配或由I至4个核苷酸缺失或插入引起的错配的双链核苷酸分子；所述阴性标准品为完全互补的双链核苷酸分子。利用上述标准品，可加强本发明的检测核酸突变的试剂盒的易用性以及检测结果准确性。其中，所述试剂盒还可包括用于扩增特定区域的特异性引物。本方案中的试剂盒因为包含用于扩增特定区域的特异性引物，可使其尤其适用于该特定区域的核酸突变检测，使得用户在利用该试剂盒检测该特定区域的核酸突变时，无需再自行设计引物，减轻了用户的工作量，提高了试剂盒的易用性。上述任一种方案中，所述试剂盒中的检测核酸突变的固相载体上的MutS所包含的报告基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、亲和素、链霉亲和素或生物素；所述试剂盒还包括显色试剂；所述显色试剂，用于与所述报告基团反应进而指示固相载体上MutS的数量。所述报告基团为过氧化物酶时，所述显色试剂可采用市场上常见的辣根过氧化物酶显色试剂，包括但不限于天根生化科技(北京)有限公司的可溶型单组分TMB底物溶液(PA107-01)。所述报告基团为碱性磷酸酶显色试剂时，所述显色试剂可采用市场上常见的碱性磷酸酶显色试剂，包括但不限于天根生化科技(北京)有限公司的BCIP/NBT底物显色试剂盒(PA111)。
所述报告基团为生物素时，所述显色试剂包括与链霉亲和素偶联的过氧化物酶或与生物素偶联的碱性磷酸酶，以及相应的辣根过氧化物酶显色试剂或碱性磷酸酶显色试剂。本发明还提供了一种基于上述任一种检测核酸突变的固相载体检测核酸突变的方法，所述MutS所含有的报告基团为荧光标记基团或无荧光标记基团；所述荧光标记基团的荧光标记与待测样品携带的荧光标记不同；所述方法包括以下步骤
A.将带有荧光标记的待测样品和阴性对照品混合，变性，退火，得带荧光标记的退火产物；所述阴性对照品为完全互补的双链核酸分子，该核酸分子含有与待测样品的待检测区域的野生型序列完全相同的核酸序列；
B.将带荧光标记的退火产物加至检测核酸突变的固相载体上，使带荧光标记的退火产物中的存在错配的退火产物与固相载体上的MutS结合，洗涤除去未结合至固相载体上的退火产物；
C.检测与固相载体结合的退火产物的荧光标记和固相载体上的MutS的报告基团，以确定待测样品中是否存在突变。需要说明的是，上述方案基于上述的任一种检测核酸突变的固相载体，利用MutS能够结合含有错配的双链核苷酸分子的特性，实现了对含有突变的核酸的检测，且因为MutS被固定在固相载体表面，使得整个检测步骤更为简单、方便；此外，本方案利用MutS上含有的报告基团来检测固相载体上的MutS的数量，进而根据固相载体上用于固定MutS的表面积计算出MutS的单位密度,从而排除因固相载体上固定的MutS的单位密度过低而导致的假阴性的结果，使检测结果更为准确；而对与固相载体结合的退火产物的荧光标记的检测，以及对固相载体上的MutS的报告基团的检测是在同一固相载体上进行的，因此在提高准确率的同时，避免了为了排除假阴性结果而重复实验的操作，提高了实验效率，降低了成本；另外，对与固相载体结合的退火产物的荧光标记的检测，以及对固相载体上的MutS的报告基团的检测可同时进行，也可相继进行，且相互之间无顺序关系。当固相载体上的MutS的报告基团也是荧光标记基团时，其荧光标记与待测样品携带的荧光标记不同。所述待测样品为带荧光标记的单链或双链核酸分子，其序列中可能含有与野生型序列不一致的地方，即该待测样品中可能含有突变。所述待测样品可以是针对从生物体、组织或细胞中提取获得的核酸分子进行处理后获得的带荧光标记的单链或双链核酸分子。
其中，所述步骤C可包括
Cl.荧光扫描步骤B的产物，初步确定待测样品中是否含有突变；
C2.对MutS上的报告基团进行检测，以确定固相载体上MutS的数量；
C3.根据步骤Cl和C2的结果确定待测样品中是否存在突变。需要说明的是，本方案中，若步骤Cl中检测到荧光，则可初步判定待测样品中含有突变，若未检测到荧光，则可初步判定待测样品中不含有突变。若经步骤Cl初步判定待测样品中不含有突变，然后经步骤C2检测出固相载体上MutS的数量，并根据该固相载体上用于固定MutS的表面积计算出该固相载体上MutS的单位密度,若该固相载体上MutS的单位密度过低，则可判定步骤Cl的结果可能为假阴性，该待测样品是否含有突变不确定，需重新检测。若经步骤Cl初步判定待测样品中不含有突变，经步骤C2检测出的固相载体上MutS的数量计算出的MutS的单位密度不过低，则可判定该样品中不含有突变。若经步骤Cl 初步判定待测样品中含有突变，经步骤C2检测出的固相载体上MutS的数量计算出的MutS的单位密度不过低，则可判定该样品中含有突变。至于固相载体上MutS的单位密度是否过低，与用于检测荧光标记的荧光检测装置相关。可根据用于检测荧光标记的荧光检测装置的最低检测限来计算单位面积上至少需要有多少个荧光标记分子才能使得其被检测到，然后根据每个MutS能够结合一个带错配的双链核酸分子，计算出单位面积上至少需要固定多少个MutS分子才能保证该固相载体能够用于检测核酸突变。计算出的最低MutS分子的单位密度即为该荧光检测装置对应的临界值，若固相载体上的MutS分子的单位密度小于该临界值，则过低；若大于等于该临界值，则说明该固相载体的检测结果是可信的。相关可采用的荧光检测装置在市场上有很多种，包括但不限于美国宝特(BioTek)的 FLx800 系列的 FLx800T、FLx800TB、FLx800TBP、FLx800TBI、FLx800TBID,Synergy MxF 系列的 SMT、SMTB, SMTBD, SMTD,或瑞士帝肯(Tecan)的 Infinite F500、Infinite MlOOO或Infinite 200系列的F200和M200等。优选的，可采用具有荧光、化学发光和光吸收等三种检测模式的检测装置进行步骤C的检测，例如Infinite F500、InfiniteM1000、Infinite 200 系列的 F200 和 M200 等。当然，判定固相载体上MutS的单位密度是否过低，除了上述的绝对值判定法外，还可以采用相对值判定法，即基于多个相同的固相载体(它们具有相同的用于固定MutS的表面积)，制备一系列的固定有不同量的含报告基团的MutS的固相载体(即一系列不同表面密度的固相载体)，然后基于上述固相载体分别对阳性标准品进行检测，能检测出突变的最低表面密度的固相载体上的MutS单位密度为临界值；若固相载体上的固定的MutS的单位密度小于该临界值，则过低；若大于等于该临界值，则说明该固相载体的检测结果是可信的。这种相对值判定法与绝对值判定法相比，其临界值是通过实际实验计算得出的，更贴近实际情况，结果更为准确；在实际实验过程中设计的密度梯度越多，得到的临界值越准确。其中，步骤A中的带荧光标记的待测样品的获得可通过多种方式进行。包括但不限于利用特异性引物，通过PCR技术对源核酸进行扩增，得带荧光标记的待测样品；或通过对源核酸进行修饰，得带荧光标记的待测样品。需要说明的是，所述源核酸为单链或双链核酸分子，其序列中可能含有与野生型序列不一致的地方，即该源核酸中可能含有突变。所述源核酸可以是直接从生物体、组织或细胞中提取获得的核酸分子，也可以是对直接从生物体、组织或细胞中提取获得的核酸分子进行特定区域特异性扩增的产物。通过PCR技术获得带荧光标记的待测样品的方法中，荧光标记的来源可以是特异性引物本身带有的荧光标记，也可以通过在扩增过程中掺入带荧光标记的核苷酸来实现的。通过修饰方式使源核酸获得荧光标记从而得到带荧光标记的待测样品的方法中，可以利用末端转移酶(TdT)、Klenow Fragment (3’一5’ exo_)的特性，以带荧光标记的核苷酸为底物，使源核酸的3’端带上荧光标记。优选的，步骤AO为利用特异性引物，通过PCR技术对源核酸进行扩增，得带荧光标记的待测样品。本方案中，在PCR扩增过程中既实现了对源核酸的荧光标记，又对源核酸中的可能存在突变的区域进行了特异性扩增，增加了可能存在突变的区域的分子数，使得检测结果更为灵敏和准确。更优选的，步骤AO中的特异性引物为5’端带荧光标记的特异性引物。本方案中，所得待测样品中的荧光标记来源于特异性引物本身带有的荧光标记，本方案是通过使用带荧光标记的特异性引物和普通的核苷酸来进行扩增的，与使用普通的特异性引物和带荧光标记的核苷酸相比，成本更低，且获得的待测样品中的各个核酸分子所携带的荧光标记的 数量和位置非常一致，各核酸分子的荧光信号强度均一，有利于后续的检测反应。上述任一方案中，所述检测核酸突变的固相载体上的MutS所包含的报告基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、亲和素、链霉亲和素或生物素。上述任一方案中，所述固相载体表面的材料包括硝酸纤维素膜、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯和尼龙中的至少一种。优选的，所述固相载体表面的材料包括硝酸纤维素膜、聚苯乙烯和尼龙中的至少一种。上述任一方案中，优选的，所述步骤C包括
Cl.荧光扫描步骤B的产物，初步确定待测样品中是否含有突变；
C2.利用显色试剂对MutS上的报告基团进行检测，以确定固相载体上MutS的数量；所述显色试剂，用于与所述报告基团反应并指示固相载体上MutS的数量；
C3.根据步骤Cl和C2的结果确定待测样品中是否存在突变。需要说明的是，本方案先是通过对与固相载体结合的退火产物的荧光标记的检测来初步判定待测样品中是否含有突变，然后进一步通过显色试剂与报告基团的反应来确定固相载体上MutS的数量，并根据该固相载体上用于固定MutS的表面积计算出该固相载体上MutS的单位密度,若该固相载体上MutS的单位密度过低，则可判定步骤Cl的结果可能为假阴性，该待测样品是否含有突变不确定，需重新检测。若经步骤Cl初步判定待测样品中不含有突变，经步骤C2检测出的固相载体上MutS的数量计算出的MutS的单位密度不过低，则可判定该样品中不含有突变。若经步骤Cl初步判定待测样品中含有突变，经步骤C2检测出的固相载体上MutS的数量计算出的MutS的单位密度不过低，则可判定该样品中含有突变。本方案中所述的报告基团为无荧光标记基团，且所述无荧光标记基团不能直接指示固相载体上MutS的量。本方案中对固相载体上MutS的数量的检测是通过化学显色试剂来实现的，与通过荧光标记基团来实现相比，通过化学显色试剂实现固相载体上MutS的数量的检测时所检测的波长与步骤Cl检测的荧光标记的波长相差较大，相互之间不易发生干扰，且可通过化学显示试剂与报告基团的反应，将报告基团的信号放大，从而实现对固相载体上MutS数量的微量检测，检测结果更准确。另外本方案所需的固相载体与报告基团为荧光标记基团的固相载体相比，制备成本更低，因而间接降低了检测成本。所述报告基团为过氧化物酶时，所述显色试剂可采用市场上常见的辣根过氧化物酶显色试剂，包括但不限于天根生化科技(北京)有限公司的可溶型单组分TMB底物溶液(PA107-01)。所述报告基团为碱性磷酸酶显色试剂时，所述显色试剂可采用市场上常见的碱性磷酸酶显色试剂，包括但不限于天根生化科技(北京)有限公司的BCIP/NBT底物显色试剂盒(PA111)。所述报告基团为生物素时，所述显色试剂包括与链霉亲和素偶联的过氧化物酶或与生物素偶联的碱性磷酸酶，以及相应的辣根过氧化物酶显色试剂或碱性磷酸酶显色试剂。以下将通过第二具体实施例来进一步说明本发明的检测核酸突变的固相载体是如何实现对核酸突变的检测的。 一、突变检测前准备。I.检测核酸突变的固相载体的制备。按第一具体实施例的方案制备96孔酶标板，在包被生物素标记的His-TthMutS时，将96孔板按行分成4个区域，分别为I、II、III、IV区。其中I区为第I至2行，加入的带生物素标记的His-TthMutS的量为IOOOng ;其中II区为第3至4行加入的带生物素标记的His-TthMutS的量为500ng ;其中III区为第5至6行加入的带生物素标记的His-TthMutS的量为250ng ;其中IV区为第7至8行加入的带生物素标记的His-TthMutS的量为lOOng。2.阴性对照品的制备。以正常人基因组为模板，利用BRCA2-F1 (SEQ ID NO: 6)、BRCA2_R1 (SEQ ID NO:7)对BRCA2基因进行扩增，所述引物BRCA2-F1、BRCA2-R1的5’端含有Cy3标记。扩增体系如下BRCA2-F1(10 μ M)，I μ L ;BRCA2_R1 (10 μ M)，I μ L ;基因组模板，40ng ; 10 X Ex Taq Buffer,2y L ；Ex Taq (5U/μ L), 0. 2 μ L ；dNTP (各 2. 5mM),2y L ；ddH20,up to 20 μ L0PCR反应条件如下
95 °C 3min ；
94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ;重复 29 个循环；
72 °C 7min。利用E.Z.N.A.
Cycle-Pure Kit (OMEGA BIO-TEK, D6492-01)回收 BRCA2-F1 和 BRCA2-R1 的扩增产物，对回收产物进行测序，显示其序列为(SEQ ID N0:8)，说明该正常人的BRCA2基因为野生型，上述步骤所得回收产物可作为BRCA2基因突变检测的阴性对照品，也可作为检测BRCA2基因突变的试剂盒中的阴性标准品。3.各阳性标准品的制备。参考步骤2中的PCR扩增体系和扩增方法，以步骤2的回收产物为模板，按表I中的引物组合分别对BRCA2基因进行扩增，然后用E.Z.N.A. 8 Cycle-Pure Kit对扩增产物分别进行回收。
权利要求
1.一种检测核酸突变的固相载体，其特征在于，所述固相载体表面固定有Muts ;所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。
2.根据权利要求I所述的检测核酸突变的固相载体，其特征在于，所述报告基团为荧光标记基团或无突光标记基团。
3.根据权利要求2所述的检测核酸突变的固相载体，其特征在于，所述无荧光标记基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素或链霉亲和素。
4.根据权利要求I至3中任一项所述的检测核酸突变的固相载体，其特征在于，所述固相载体表面为适于包被蛋白的材料。
5.根据权利要求3所述的检测核酸突变的固相载体，其特征在于，所述材料包括天然纤维素、被修饰的纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龙、聚丙烯酰胺、琼脂糖、橡胶、金属、金属氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一种。
6.一种检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，包括检测核酸突变的固相载体；所述固相载体表面固定有MutS;所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。
7.根据权利要求6所述的检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，还包括标准品；所述标准品包括阳性标准品和阴性标准品；所述阳性标准品为含有碱基错配或由I至4个核苷酸缺失或插入引起的错配的双链核苷酸分子；所述阴性标准品为完全互补的双链核苷酸分子。
8.根据权利要求6所述的检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，还包括用于扩增特定区域的特异性引物。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的检测核酸突变的试剂盒，其特征在于，所述报告基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素或链霉亲和素；所述试剂盒还包括显色试剂；所述显色试剂，用于与所述报告基团反应进而指示固相载体上MutS的数量。
10.一种基于权利要求I所述的检测核酸突变的固相载体检测核酸突变的方法，其特征在于，所述MutS所含有的报告基团为荧光标记基团或无荧光标记基团；所述荧光标记基团的荧光标记与待测样品携带的荧光标记不同；所述方法包括以下步骤 A.将带有荧光标记的待测样品和阴性对照品混合，变性，退火，得带荧光标记的退火产物；所述阴性对照品为完全互补的双链核酸分子，该核酸分子含有与待测样品的待检测区域的野生型序列完全相同的核酸序列； B.将带荧光标记的退火产物加至检测核酸突变的固相载体上，使带荧光标记的退火产物中的存在错配的退火产物与固相载体上的MutS结合，洗涤除去未结合至固相载体上的退火产物； C.检测与固相载体结合的退火产物的荧光标记和固相载体上的MutS的报告基团，以确定待测样品中是否存在突变。
11.根据权利要求10所述的检测核酸突变的方法，其特征在于，所述步骤C包括 Cl.荧光扫描步骤B的产物，初步确定待测样品中是否含有突变； C2.对MutS上的报告基团进行检测，以确定固相载体上MutS的数量； C3.根据步骤Cl和C2的结果确定待测样品中是否存在突变。
12.根据权利要求10所述的检测核酸突变的方法，其特征在于，步骤A之前包括步骤AO.利用带荧光标记的特异性引物对源核酸进行扩增，得带荧光标记的待测样品；或利用带荧光标记的核苷酸对源核酸进行末端标记，得带荧光标记的待测样品。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的检测核酸突变的方法，其特征在于，所述报告基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素或链霉亲和素，所述固相载体表面的材料包括硝酸纤维素膜、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯和尼龙中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的检测核酸突变的方法，其特征在于，所述步骤C包括 Cl.荧光扫描步骤B的产物，初步确定待测样品中是否含有突变； C2.利用显色试剂对MutS上的报告基团进行检测，以确定固相载体上MutS的数量；所述显色试剂，用于与所述报告基团反应并指示固相载体上MutS的数量； C3.根据步骤Cl和C2的结果确定待测样品中是否存在突变。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，提供了一种检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法。所述检测核酸突变的固相载体表面固定有MutS；所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。本发明还提供了包括上述检测核酸突变的固相载体的试剂盒，以及基于上述检测核酸突变的固相载体进行核酸突变检测的方法。本发明的检测核酸突变的固相载体、试剂盒在实际应用中能够减少检测步骤，提高检测效率，排除检测结果中的假阴性结果，提高检测结果的准确率。本发明的检测核酸突变的方法能够减少检测步骤，提高检测效率，排除检测结果中的假阴性结果，提高检测结果的准确率。
文档编号C12Q1/68GK102899399SQ20121032046
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者盛司潼 申请人:深圳市华因康高通量生物技术研究院