专利名称：柯萨奇病毒a10核酸检测用引物、探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及柯萨奇病毒AlO核酸检测用引物、探针及试剂盒。
背景技术：
柯萨奇病毒AlO (coxsackievirusAlO,简称CVA10)为单股正链RNA病毒，属小RNA病毒科(Picoranviridae),根据其分子遗传特征，CVAlO属于人类肠道病毒A类(humanenterovirus A,简称HEV-A)。CVAlO作为人类感染性疾病的一种病原，能引起多种疾病，如手足口病、疱疹性咽峡炎及脱甲病等。手足口病的一种主要病原体人类肠道病毒71 (humanenterovirus 71,简称HEV71)已在亚太地区流行了十多年,在中国大陆自1998年以来一直以C4基因型循环传播。然而，在近几年爆发的几起手足口病中，除了主要病原体HEV71外，还有多种人类肠道病毒参与感染，其中CVAlO就是常见的一种。并且，近几年CVAlO开始在 欧洲流行，且有在全球流行并引起流行病爆发的可能。如2008芬兰爆发的手足口病，2010法国爆发的疱疹性咽峡炎和手足口病都以CVAlO和CVA6为主，CVAlO还引起了 2008年西班牙的手足口病的流行，并引发了脱甲病。另外，健康人群人类肠道病毒隐性感染的调查结果显示HEV-A表现出高度的流行，其中CVAlO是其中之一。我国深圳地区近几年手足口病的病原学调查结果显示，CVAlO的感染比例表现出上升的趋势。CVAlO的感染一年四季均可发生，其主要通过粪-口途径在人群中传播,带毒的粪便可通过污染的手、餐具、食物经口进入人体，咳嗽、打喷嚏形成的飞沫可直接或间接进行传播，另外，接触病人破溃的疱疹液等也受到感染。CVAlO作为一种潜在的威胁，为了更好地应对CVAlO的感染所引发的疾病流行，提供一种快速、准确的检测技术显的尤为重要。本发明选择柯萨奇病毒AlO的VPl基因设计用于荧光RT-PCR检测的引物及探针序列，建立了柯萨奇病毒AlO荧光RT-PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲线判定是否感染柯萨奇病毒A10。
发明内容
本发明目的在于提供用于柯萨奇病毒AlO实时荧光RT-PCR检测的引物、探针及试剂盒。本发明在分析已报道的柯萨奇病毒AlOVPl基因序列基础上，分别设计引物及荧光探针，所述的引物由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID No: I和SEQID No:2 所示。本发明设计的探针的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。其中，报告荧光染料可以采用下列荧光基团中的任意一种FAM、HEX、TET, JOE、ROX和CY5，淬灭荧光染料可采用下列荧光基团中的任意一种TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2 和 BHQ3。根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭突光染料的抑制作用消失，报告突光染料信号增强，从而实现对柯萨奇病毒AlO核酸的实时检测。本发明提供的试剂盒，包括上述正向弓丨物和反向引物。优选地,试剂盒还包括上述探针。优选地，试剂盒还包括实时荧光RT-PCR反应液，与所述正向引物、反向引物和探针共同构成实时荧光RT-PCR检测体系，25 μ I所述实时荧光RT-PCR检测体系的配置为2XOneStep RT-PCR Buffer 12. 5 μ 1，10 μ M 所述正向引物 I. 5 μ 1，10 μ M 所述反向引物 1·5μ 1，10μΜ 所述探针 0·5μ 1，Rox Reference Dye II (50 X) 0· 5 μ 1，5U/μ I Ex TaqHS O. 5 μ 1,40U/ μ IPrimeScript RT enzyme Mix O. 5 μ I, RNA 5 μ I, RNase Free dH202· 5 μ I。优选地，试剂盒的检测反应条件为50°C反转录20min，95 V变性3min，以950C 15s，60°C 40s (收集荧光信号FAM)扩增45个循环。当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。本发明根据柯萨奇病毒AlOVPl基因序列设计引物及荧光探针，该引物特异性强，用于荧光PCR检测的灵敏度高。用本发明引物及探针，通过RT-PCR检测，能够快速简单地判断样品是否有柯萨奇病毒A10,而且检测准确性高、灵敏度高，因此能够为柯萨奇病毒AlO感染的相关疾病诊断提供科学依据。
图I是实时荧光RT-PCR技术柯萨奇病毒AlO核酸检测的特异性实验的检测结果图；图2是本发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例I :引物及探针的设计和合成比对并分析GenBank中分离自全球的柯萨奇病毒AlO的同源VPl基因序列，利用生物软件01igo7. O分别在其保守位点设计引物和Taqman探针,利用在线的OligoAnalyzer
3.I分析其Hairpin, Self-Dimer和AG值,并通过NCBI数据库的Blast程序进行特异性验证。所设计的引物及探针序列为CVA10-F457 (正向引物)5，-ATGTACGTGCCCCCTGGTGCC-3，；即 SEQ ID No: ICVA10-R705 (反向引物)5’ -TCGCACTGCAAAGGTGCCCATCAT-3’ ；即 SEQ ID No:2CVA10-P493 (探针)FAM-AGGGATGCCTTTCAATGGCAAACAGCAAC-TAMRA ；即 SEQ IDNo :3 ;该探针的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料TAMRA。实施例2 =RNA的提取病毒样品RNA的抽提使用High Pure Viral RNA KU，步骤按其操作说明书进行，具体的操作步骤如下I)向200 μ I的上清液中加入400 μ I的Binging Buffer,混匀后将混合液转入装有过滤管的收集管，8000 Xg离心15s ；2)将过滤管置于新的收集管中，向滤管中加500 μ I Inhibitor Removal Buffer,8000 X g 离心 Imin ；3)将过滤管置于新的收集管中，向滤管中加450 μ I Wash Buffer，8000X g离心Imin ；4)将过滤管置于新的收集管中，再一次向滤管中加450 μ I Wash Buffer, 8000X g离心Imin ； 5)将过滤管置于新的收集管中，9300 Xg离心15s ；6)将过滤管置于新的离心管中，向离心管中加入50μ I的Elution Buffer,8000 X g离心Imin从而得到纯净的病毒RNA。病毒细胞培养物和疱疹液按上述方法直接提取；粪便样品、肛拭子和咽喉拭子需经过预处理，在抽提前需加O. OlM PBS, PH7. 5，其中，O. 5g粪便样品(O. 5ml液态粪便)加5mLPBS，然后将悬液12000 Xg离心lOmin，取上清液进行RNA抽提，用50 μ I DEPC水洗脱，于-80°C保存。实施例3 :Real-timeRT-PCR扩增方法的建立I、实时荧光RT-PCR反应体系以RNA为模板，进行实时RT-PCR反应(反应用试剂购自TaKaRa)。荧光定量RT-PCR反应体系如下表
_Μ_25μ1体积终浓度
2xOne Step RT-PCR Buffer12.5,Li!Ix
正向引物和反向引物(10 μΜ)各1.5μ1各0.6μΜ
探计(ΙΟμΜ)0.5μ 0.2 μΜRox Reference Dye !I (50χ)0.5μ1Ix
Ex Taq HS{5 U/μΙ)0.5μ 2.5U
PrimeScript RT enzyme Μ χ(40 /μ!)0.5μ120 U
_RNA_5μΙ_
RNase FreedH2O Ιμ\2、实时荧光RT-PCR反应条件将样品管放入ABI公司7500荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应50°C反转录20min，95°C变性3min,以95°C 15s，60。。40s (收集荧光信号FAM)扩增45个循环。每个循环结束采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。实施例4 :柯萨奇病毒AlO核酸Real-time RT-PCR方法的特异性确定选取4株已确定型别的CVA10毒株和8株其他肠道病毒血清型(HEV71、coxsackievirusA6> coxsackievirus A 16、 coxsackievirus A5、 coxsackievirus A4、coxsackievirus A2> coxsackievirus BI 和 echoviurs 16),利用建立起的突光 RT-PCR 反应体系对这12株毒株进行检测，检测结果如图I所示，4株CVAlO病毒(编号为CVA10-SZ73，CVA10-SZ75, CVA10-SZ89，CVA10-SZ94)均出现相应的特异性荧光扩增曲线，呈阳性反应，而其他8株人类肠道病毒则均没有荧光信号产生，在图I中显示为一平直的线，判为阴性。结果表明，所设计的引物探针只对目的病毒(即，CVA10)特异，与其它检测对象无交叉反应。试验结果以柯萨奇病毒AlO的RNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而其他病毒的荧光强度没有变化。实施例5 :灵敏度实验将柯萨奇病毒AlO体外转录RNA用DEPC处理的水分别稀释，进行相对灵敏度检测，在25 μ I反应体系中，RNA分别被稀释成I. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. OX IO2、 I.OX IO1拷贝数，检测结果如图2所示，可以看出，检测限度低至为10个模板拷贝数。
权利要求
1.一种柯萨奇病毒AlO核酸检测用引物，由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列分别如 SEQ ID No: I 和 SEQ ID No:2 所示。
2.一种与权利要求I所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，该探针一端标记有报告突光染料，另一端标记有淬灭突光染料。
3.如权利要求2所述的探针，其特征在于该探针5’端标记有FAM荧光染料，3’端标记有TAMRA荧光染料。
4.含有权利要求I所述正向引物和反向引物的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于还包括权利要求2或3所述的探针。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括实时荧光RT-PCR反应液，与所述正向引物、反向引物和探针共同构成实时荧光RT-PCR检测体系，25 μ I所述实时荧光RT-PCR检测体系的配置为2XOne Step RT-PCR Buffer 12. 5 μ 1，10 μ M所述正向引物I. 5 μ 1，10 μ M所述反向引物 I. 5 μ 1，10 μ M所述探针O. 5 μ I, Rox Reference Dye II (50X)0. 5 μ 1，5U/μ I Ex Taq HS 0. 5 μ 1,40U/μ I PrimeScript RT enzyme Mix O. 5 μ I,RNA 5 μ I,RNaseFree dH20 2· 5 μ I。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测反应条件为50°C反转录 20min，95°C变性 3min,以 95V 15s，60。。40s 扩增 45 个循环。
全文摘要
本发明提供了一种柯萨奇病毒A10核酸检测用引物、探针及试剂盒，所述引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。所述试剂盒包括所述正向引物和反向引物。本发明所设计的引物特异性好，灵敏度高，用本发明引物及探针，通过RT-PCR检测，能够快速简单地判断样品是否有柯萨奇病毒A10，而且检测准确性高、灵敏度高。
文档编号C12Q1/70GK102827952SQ20121031971
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者何雅青, 陈龙 申请人:何雅青, 陈龙