专利名称：一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗、相关表达载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗技术领域，更具体地，涉及多效价活疫苗技术领域，特别是指一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗、相关表达载体及应用。
背景技术：
中国是水产养殖业大国，但随着高密度大规模养殖技术的发展，病害问题日益突出，对水产养殖业造成了巨大的威胁。据初步统计，目前危害我国水产养殖生物的疾病已达 400 500种，全国每年水产养殖发病率达50%以上，损失率为20%左右。鱼类疾病达200 多种。其中，弧菌病和爱德华氏菌病是在水产养殖中经常爆发的两大类疾病，致死率极高。弧菌病是最早发现的鱼类细菌性疾病之一。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是水产养殖中常见的一类弧菌。它多在高盐度的水体中流行，分布区域几乎为世界性的，其发生没有宿主的种属选择性差异，也无具体的季节和时间上的区分，其流行适宜温度为25 320C，超过时流行极为迅速，几日之内即可造成养殖动物的大量死亡，严重威胁经济鱼类的养殖。迟钝爱德华氏菌通常被分离于冷血动物肠道及其他环境尤其是淡水中，在温血动物和人中也可被分离到。迟钝爱德华氏菌主要对鳗鲡、鲇鱼和其他动物致病，并且能感染人类，引起疾病多表现为腹部膨胀，体表皮肤有不同程度的出血性溃烂。在世界不少国家和地区均有由该菌引起水产养殖动物的病害发生及流行，并且造成得损失严重。长期以来，人们使用药物治疗的方法来对抗水产病害。但是药物在鱼体内的残留， 产生耐药性病原体；导致水体污染并破坏正常的生态环境等不良后果使人们意识到药物治疗的不足之处。而疫苗具有针对性强，抗病周期长，可终身免疫，防治主动等特点，因此成为了世界水产养殖行业中研究和开发的主要前沿和应用领域。其中减毒活疫苗更以其给药方便，免疫保护力高，成本低廉为人们所广泛关注。微生物表面展示技术是利用基因重组方法把靶蛋白(外源肽段或蛋白质结构域)基因序列与特定的载体蛋白基因序列(又叫定位序列)融合后导人微生物宿主细胞，从而使靶蛋白表达并定位于微生物细胞表面。用这一技术设计疫苗可使表达的抗原充分展示在微生物的表面，其在免疫递呈方面可能更为有效，为发展高效安全的活疫苗开拓了更大的空间。利用这一技术在大肠杆菌等细菌的疫苗开发中已得到了成功应用(Stathopoulos C, et al. Characterization of Escherichia coli expressing anLpp-OmpA(46-159)-PhoA fusion protein localized in the outer membrane. App1. Microbiol. Biotechnol. 1996(45)，112-119)。在病原菌中展示外源抗原蛋白更可能起到多效价的作用。在水产养殖的环境中，鱼类易同时受到多种病原菌的侵害。因此，研究能同时抵抗多种病原菌的疫苗十分经济实用。目前，尚未见以鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌为主要防治对象的商品化多效价减毒活菌疫苗。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗、相关表达载体及应用，该多效价活疫苗设计独特巧妙，能同时抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌，与传统疫苗比具有免疫保护效果更好的特点，使用简便，安全， 费用低廉，为预防养殖鱼类的疾病提供一种安全，有效，经济的方式，有实际的商业开发应用价值，适于大规模推广应用。在本发明的第一方面，提供了一种重组表达载体，其特点是，包括表达载体和整合在所述表达载体上的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列编码丁香假单胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和迟钝爱德华氏菌的3-磷酸甘油脱氢酶的融合蛋白，其中所述冰核蛋白外膜定位元件用于介导所述3-磷酸甘油脱氢酶的外膜定位。所述迟钝爱德华氏菌可以选择任意的迟钝爱德华氏菌。较佳地，所述迟钝爱德华氏菌是迟钝爱德华氏菌EIB202，保藏编号为CCTCC NO =M 208068。所述丁香假单胞菌可以选择任意的丁香假单胞菌。较佳地，所述丁香假单胞菌是丁香假单胞菌丁香致病变种ICMP3023。所述表达载体可以选择任何合适的表达载体。较佳地，所述表达载体为PUC18质粒。所述冰核蛋白外膜定位元件可以是任何丁香假单胞菌的冰核蛋白外膜定位元件， 所述3-磷酸甘油脱氢酶可以是任何迟钝爱德华氏菌的3-磷酸甘油脱氢酶。较佳地，所述冰核蛋白外膜定位元件的氨基酸序列如SEQ ID NO :9所示；所述3-磷酸甘油脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。因为密码子的非唯一性，所述外源核苷酸序列中编码所述冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列可以是任意合适的序列。较佳地，所述外源核苷酸序列中编码所述冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示；所述外源核苷酸序列中编码所述3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本领域技术人员根据其掌握的技术应该知晓如何构建上述重组表达载体，其中一种构建方法可以是A)分别克隆编码冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列和编码3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列；B)酶切编码冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列和表达载体；C)连接酶切的编码冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列和表达载体，构成中间质粒；D)酶切编码3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列和中间质粒；E)将酶切的编码3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列和中间质粒进行连接。也就是说，可以先将编码冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列构建入表达载体， 再将编码3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列构建入表达载体。可理解，上述顺序也可以倒过来，即先把编码3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列构建入表达载体，再将编码冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列构建入表达载体。还可以先将编码冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列和编码3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列连接，然后一起构建入表达载体。这些过程本
4领域技术人员可以根据其掌握的技术选择合适的酶切位点即可完成。在本发明的第二方面，提供了一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗， 其特点是，由上述的重组表达载体转化鳗弧菌减毒株获得，其中所述表达载体是鳗弧菌表达载体。所谓“鳗弧菌表达载体”是指适于在鳗弧菌内表达的载体。较佳地，所述鳗弧菌减毒株为鳗弧菌减毒株MVAV6203，保藏编号为CCTCC NO =M 204066。在本发明的第三方面，提供了上述的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗在预防鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌导致的鱼类疾病中的应用。本发明的有益效果如下本发明的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗通过构建的重组表达载体转化鳗弧菌减毒株获得，其中重组表达载体表达的丁香假单胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和迟钝爱德华氏菌的3-磷酸甘油脱氢酶的融合蛋白通过冰核蛋白外膜定位元件将3-磷酸甘油脱氢酶展示在鳗弧菌减毒株细胞表面，设计独特巧妙，能同时抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌，与传统疫苗比具有免疫保护效果更好的特点，使用简便，安全，费用低廉，为预防养殖鱼类的疾病提供一种安全，有效，经济的方式，有实际的商业开发应用价值，适于大规模推广应用。本发明的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价减毒活疫苗与传统的疫苗相比具有如下优点a.本发明开发的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗具有能同时预防鳗弧菌病和迟钝爱德华氏菌病的多效价功能。b.本发明的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗与传统疫苗比具有免疫保护效果更好的特点；使用简便、安全，费用低廉。c.本发明的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗采用了表面展示外源抗原的技术，更容易激发鱼体的免疫反应，产生更好的免疫保护效果。所有这些技术安全特征都为本发明的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应用前景。
图1是本发明构建的pGapA40的质粒图谱。图2是本发明构建的pNgapA40的质粒图谱。图3是本发明构建的各疫苗候选株GAPDH总蛋白表达量的ELISA检测结果柱状图。图4是本发明构建的疫苗株VA(pNG40)外膜展示GAPDH蛋白和胞内表达GAPDH蛋白的ELISA检测结果柱状图，其中OM表示外膜部分，CP表示胞内部分，1-6为相应的蛋白样 图5是本发明构建的疫苗株VA(pNG40)外膜展示GAPDH蛋白和胞内表达GAPDH蛋白的Wfestern blot检测图，其中M是蛋白分子量marker，其中OM表示外膜部分，CP表示胞内部分。
具体实施例方式本发明通过构建重组表达载体，并将其转化进鳗弧菌减毒株，从而表达编码丁香假单胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和迟钝爱德华氏菌的3-磷酸甘油脱氢酶的融合蛋白， 并通过冰核蛋白外膜定位元件将3-磷酸甘油脱氢酶定位到鳗弧菌减毒株的细胞表面，从而形成抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗。为更好的理解本发明的内容，下面以所述丁香假单胞菌是丁香假单胞菌丁香致病变种(来源于中国农业微生物菌种保藏中心，保藏编号为ICMP3023)的冰核蛋白外膜定位元件和迟钝爱德华氏菌EIB202(来源于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0 =M 208068，保藏日期为2008年5月1日，具体参见中国发明专利申请CN200910052707. 6)的 3-磷酸甘油脱氢酶为例，作进一步说明。实施例1重组表达载体的构建1. 1引物设计根据SEQ ID NO :1 所示序列(gapA40)设计引物 gapA-Lo-F(SEQ ID NO :3 所示序列)，gapA-Lo-R(SEQ ID NO :4 所示序列)；gapA-N-F (SEQ ID NO :5 所示序列)， gapA-N-R(SEQ ID NO :4所示序列)；gapA_F(SEQ ID NO :6所示序列)，gapA_R(SEQ ID NO :7 所示序列)；根据SEQ ID NO 8所示序列设计N-F (SEQ ID NO :10所示序列)和N_R(SEQID NO 11所示序列)，上述引物的序列和其中的酶切位点如下所示 gapA-Lo-F CCGGAATTCATGACTATCAAAGTA (EcoRI 酶切位点)gapA-Lo-R CCACTGCAGTTACTTAGAGATGTGTGCGA (PstI 酶切位点)gapA-N-F CGCGGATCCATGACTATCAAAGTAGGTAT (BamHI 酶切位点)gapA-N-R 同 gapA-Lo-RgapA-F TAGGAGAATTCGATGACTATCAAAGTAGG (EcoRI 酶切位点)gapA-R CCACTGCAGTTACTTAGAGATGTGTGCGA (PstI 酶切位点)N-F TAGGAGAATTCGGAGGATGCTGTAATGAATCTCG (EcoRI 酶切位点)N-R CGCGGATCCAATCAGATCACTGTGGTTGCCAG (BamHI 酶切位点)1.2常规PCR扩增使用上述引物进行PCR扩增，以制备目的片段，其中具体使用的模板和引物对及制备的目标片段如下所示以丁香假单胞菌丁香致病变种ICMP3023基因组为模板，以N-F和N-R为引物对， 扩增冰核蛋白外膜定位元件的编码序列InaVN(简称N)。以迟钝爱德华氏菌EIB202基因组为模板，以gapA-F和gapA_R为引物对，扩增 3-磷酸甘油脱氢酶的编码序列gapA401 (构建PG40质粒所用)。以迟钝爱德华氏菌EIB202基因组为模板，以gapA_N_F和gapA-N-R为引物对，扩增3-磷酸甘油脱氢酶的编码序列gapA402 (构建PNG40质粒所用)。以迟钝爱德华氏菌EIB202基因组为模板，以gapA40-Lo_F和gapA-Lo-R为引物对，扩增3-磷酸甘油脱氢酶的编码序列gapA403(构建Plorf 1G40，PluG40, Pworf 1G40, PwuG40质粒所用)。其中，菌株的基因组采用天根生化公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒进行制备。 具体操作步骤参考产品说明书。
将扩增获得的上述序列片段分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下含有目的片段的凝胶后，采用天根生化公司(TIANGEN)的凝胶回收试剂盒回收DNA，具体操作步骤参考产品说明书，其中，扩增获得的各序列片段的大小分别如下N为621bp，gapA40U gapA402、 gapA403大小均为996bp，均根据同一模板gapA40扩增得到的序列，因为构建不同菌株时在两端添加的酶切位点不同，所以分开命名，其中gapA 401为EcoRI、I^stI酶切位点，gapA 402为BamHI.PstI酶切位点，gapA 403同样为EcoRI、PstI酶切位点。1. 3常规质粒酶切IfIigilK (Yang Ζ,Liu Q,ffang Q, Zhang Y. Novel bacterial surface display systems based on outer membrane anchoring elements from the marine bacterium Vibrio anguillarum. Appl Environ Microbiol.)构建的 pUC18-lpp-omporfl-gfp 质粒， pUC18-lpp-ompU-gfp 质粒、pUC18-wza-omporf 1-gfp 质粒、pUC18-wza-ompU-gfp 质粒均米用双酶EcoRI和I^stI酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可见酶切切除gfp部分的质粒，将其分别纯化回收。将PUC18质粒用双酶EcoRI和I^stI酶切，酶切后的质粒回收纯化，获得酶切质粒。1. 4重组质粒构建使用双酶EcoRI和PstI酶切gapA401、gapA403片段，使用双酶BamHI和PstI酶切gapA402片段。将酶切的gapA401片段与pUC18酶切质粒用T4 DNA连接酶16°C连接过夜，得到重组质粒PG40，即如图1所示的pGapA40，其中ori-为复制起始区，Plac为Iac启动子，LacZ alpha-为半乳糖苷酶基因，Ampicillin-为氨苄青霉素抗性基因，EcoRI, BamHI, PstI为相应的酶切位点。将gapA403片段分别与pUC18-lpp-omporfl-酶切质粒、pUC18-lpp-ompU-酶切质粒、pUC18-wza-omporfl-酶切质粒、pUC18-wza-ompU-酶切质粒用T4DNA连接酶16°C 连接过夜，分别得到重组质粒Plorf 1G40，PluG40, Pworf 1G40, PwuG40。使用双酶EcoRI和BamHI酶切N片段，将酶切片段回收纯化。将酶切片段N与pUC18 酶切质粒用jM DNA连接酶16°C连接过夜，得到中间质粒。将中间质粒使用双酶BamHI和 PstI酶切后，回收酶切中间质粒，将其与gapA402酶切片段用用T4 DNA连接酶16°C连接过夜，得到重组质粒PNG40，即如图2所示的pNGapA40。将上述重组质粒分别用CaC12转化法转化大肠杆菌ToplO，得到大肠杆菌重组菌株 ToplO(pG40)， ToplO(pNG40)， ToplO(Plorf1G40)， ToplO(PluG40)， ToplO(Pworf1G40)， ToplO (PwuG40)。实施例2鳗弧菌重组菌株构建将鳗弧菌MVAV6203(来源于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 204066，保藏日期为2004年9月7日，具体请参见中国专利ZL200410089496. 0，申请日为 2004年12月14日)接种于30ml高盐LB培养液(为在LB培养基补加NaCl至终浓度为 2.5% )中，于30°C振摇培养过夜后，再以1 100 (ν/ν)转接于IOOml新鲜高盐LB培养液中，在30°C下以200rpm振荡培养至0D600值为0. 4 0. 6时，离心收集菌体，将菌体在冰浴中放置20-30min后，用272mM的蔗糖缓冲液洗涤菌体3次，再用蔗糖缓冲液悬浮菌体，使菌体终浓度达到l*109cfu/ml以上，得到鳗弧菌MVAV6203的电转化感受态细胞。分别将重组菌株ToplO (pG40)、ToplO (pNG40)、ToplO (PlorflG40)、ToplO (PluG40)、ToplO (Pworf 1G40)、ToplO (PwuG40)进行扩增培养，收集菌体，采用天根生化(TIANGEN)公司的细菌质粒小提试剂盒进行制备，具体操作步骤参考产品说明书，获得相应的重组质粒 pG40、pNG40、PlorflG40、PluG40、Pworf 1G40, PwuG40。利用鳗弧菌MVAV6203的电转化感受态细胞和重组质粒pG40、pNG40、Plorf 1G40、 PluG40、PworflG40、PwuG40分别制备相应的重组菌株，具体过程如下分别取100 μ 1感受态菌悬液于一个事先预冷的0. 2cm的电转化杯(Bio-Rad， USA)中，分别加入重组质粒DNA 10μ 1，混勻后在冰浴上放置lOmin，用电脉冲仪 (Bio-RadMicroPluser,USA)进行电脉冲，其中，脉冲场强V = 2kV/cm，脉冲时间t = 3ms。电脉冲完毕后，菌悬液转入1. 5ml的离心馆，并加入Iml高盐LB培养液，在30°C， 200rpm恢复培养池后，涂布于高盐LB抗性平板(氨苄青霉素浓度200 μ g/ml), 30 °C 静置培养20-24h,筛选阳性克隆，得到重组菌株VA(pG40)、VA(pNG40)、VA(Plorf 1G40)、 VA (PluG40)、VA (PworflG40)及 VA (PwuG40)。实施例3多效价减毒活疫苗筛选分别将实施例2的步骤中获得的重组菌株VA(pG40)、VA(pNG40)、VA (Plorf 1G40)、 VA(PluG40)、VA (Pworf 1G40)及 VA(PwuG40)接种于含 200 μ g/ml 氨苄青霉素的 LB 高盐液体培养基中，200rpm，30°C培养过夜，次日按1 100 (ν/ν)接种于IOOml LB高盐(Amp)培养基，30°C，200rpm培养20h，收获培养液。将菌体沉淀经PBS (PH = 7. 4)洗涤3次以后，用Iml PBS重悬，使用Nano Drop核酸定量仪定至OD6tltl = 1，在冰浴中超声5min至菌体完全破碎，将所得裂解液在4°C，8000g 离心2min，所得为全菌组分。将全菌组分进行ELISA检测，结果如图3所示。图3显示，在所有疫苗候选株中，VA (pNG40)的全菌GAPDH蛋白表达量为最大。由于全菌表达量是外膜展示蛋白表达量的前提，因此选取VA(pNG40)作为后续疫苗候选株。采用SLS法抽提VA(pNG40)的外膜组分，将所得外膜组分(OM)与胞内组分(CP) 进行ELISA检测和Wfestern blot检测，结果如图4和图5所示。候选株VA(pNG40)能成功将GAPDH蛋白展示到鳗弧菌表面，因此，具有多效价疫苗的应用前景。实施例4多效价活疫苗对大菱鲆(Turbot)的免疫保护实验为确定候选株AV(pNG40)能否作为多效价减毒活疫苗应用，发明人随后又使用 VA(pNG40)对大菱鲆(Turbot)进行了免疫保护实验，具体过程如下4. 1疫苗制备取AV (pNG40)接种于30ml高盐LB液体培养基(Amp)中，于30°C，200rpm培养12h。 随后将其按(ν/ν)接种于30ml高盐LB液体培养基(Amp)中，30°C，200rpm培养20h。 离心收集菌体(4000g，lOmin，室温)，以无菌人工海水(人工海水的配方为NaCl 28. 13g/ L, KCl 0. 77g/L, MgCl2 · 6H20, NaHC03 0. llg/L, MgS04 · 7H20 3. 50g/L，溶液配制好后，高压灭菌，获得无菌人工海水)洗涤3次，菌体用人工海水稀释成l*106CFU/ml的菌悬液，每尾注射100 μ 1。4. 2免疫保护实验实验用鱼为体重7_14g，体长8-lOcm的大菱鲆，实验前先置于水槽内适应养殖2 周，以剔除不正常个体。实验水槽每天使用海水水体替换2/3体积养殖水，水温约为18°C。 将实验用鱼免疫疫苗候选株VA(pNG40)。另设一平行对照组免疫PBS。免疫4周后，将免疫组分为 2 大组，分别用鳗弧菌野生株 MVM425 (Lingyun Zhou et al. , Secretory delivery of heterologous proteins in attenuated Vibrio anguillarum for potential use in vaccine design. Appl Microbiol Biotechnol Q008) 79 :1027-1034)和迟钝爱德华氏菌野生株EI202进行腹腔注射攻毒。感染试验分组与攻毒剂量如表1所示。
权利要求
1.一种重组表达载体，其特征在于，包括表达载体和整合在所述表达载体上的外源核苷酸序列，所述外源核苷酸序列编码丁香假单胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和迟钝爱德华氏菌的3-磷酸甘油脱氢酶的融合蛋白，其中所述冰核蛋白外膜定位元件介导用于所述 3-磷酸甘油脱氢酶的外膜定位。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述迟钝爱德华氏菌是迟钝爱德华氏菌EIB202，保藏编号为CCTCC NO =M 208068。
3.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述丁香假单胞菌是丁香假单胞菌丁香致病变种ICMP3023。
4.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为PUC18质粒。
5.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述冰核蛋白外膜定位元件的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示；所述3-磷酸甘油脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所7J\ ο
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述外源核苷酸序列中编码所述冰核蛋白外膜定位元件的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示；所述外源核苷酸序列中编码所述3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
7.一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗，其特征在于，由根据权利要求 1 6中任一项所述的重组表达载体转化鳗弧菌减毒株获得，其中所述表达载体是鳗弧菌表达载体。
8.根据权利要求7所述的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗，其特征在于， 所述鳗弧菌减毒株为鳗弧菌减毒株MVAV6203，保藏编号为CCTCC NO =M 204066。
9.根据权利要求7所述的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗在预防鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌导致的鱼类疾病中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗，通过构建的重组表达载体转化鳗弧菌减毒株获得，其中重组表达载体表达的丁香假单胞菌的冰核蛋白外膜定位元件和迟钝爱德华氏菌的3-磷酸甘油脱氢酶的融合蛋白通过冰核蛋白外膜定位元件将3-磷酸甘油脱氢酶展示在鳗弧菌减毒株细胞表面，还提供了一种相关表达载体及应用，本发明的抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌的多效价活疫苗设计独特巧妙，能同时抗鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌，免疫保护效果好，使用简便，安全，费用低廉，为预防养殖鱼类的疾病提供一种安全，有效，经济的方式，有实际的商业开发应用价值，适于大规模推广应用。
文档编号A61P31/12GK102154348SQ20101060052
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者刘琴, 张元兴, 王启要, 郑雁 申请人:华东理工大学