牙鲆模式识别受体TLR8的cDNA全长序列及其应用
【专利说明】
[0001] 本发明得到天津市自然科学基金重点项目（14JCZDJC34200) "迟钝爱德华氏菌诱 导的牙鲆TLRs家族免疫应答机制研究"的资助。
技术领域
[0002] 本发明涉及生物技术领域，具体是牙鲆模式识别受体TLR8基因全长表达序列和 所编码的一种蛋白，以及该基因的克隆和检测方法。
【背景技术】
[0003] 随着世界范围水产养殖规模的扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流日 益频繁，大大增加了水产养殖动物病原传播的机会。同时，由于现代水产养殖的集约化、高 密度生产方式及渔业水域环境的恶化，又常会引发养殖动物的应激反应，导致机体的免疫 系统受到抑制。正是这些因素相互影响，出现了全球性的水产养殖动物发病率趋于频繁、流 行程度日益广泛、经济损失极为巨大的局面。运用现代生物技术作为水产养殖的技术支撑， 掌握病害的免疫防御技术是水产科技急需解决的首要问题，因此，近年来国际上鱼类免疫 学的研究逐渐受到重视。
[0004] 在人类免疫学研究的历史舞台上，细胞免疫和体液免疫一直是两个主角。相比之 下，固有免疫的研究由于缺乏对其相应受体的系统认识，明显滞后于获得性免疫研究的 进程。20世纪90年代，Janeway等有关"病原体相关分子模式"以及"模式识别受体"概 念的提出，标志着固有免疫研究进入了一个崭新的阶段。鱼类虽是低等脊椎动物，但已具 备免疫的基本特性，与哺乳动物一样，其体内也存在两种免疫应答类型：固有免疫应答和获 得性免疫应答。而相对于哺乳动物来说，鱼类的固有免疫研究才刚刚起步。
[0005] Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs)家族是动物识别入侵病原体的主要 "模式识别受体"，可识别几乎所有病原生物的一些通用结构，是启动固有免疫应答的关键。 一般认为TLR 1、2、4、5和6主要参与细菌成分的识别，而TLR3、TLR7和TLR8主要特异地针 对病毒成分，TLR9对这二者均能够识别。TLR14、21~23在某些鱼类中存在，在哺乳动物中 还未发现，有研究报道TLR21即可识别细菌成分，也可识别病毒成分。
[0006] 牙鲜及在我国俗称牙片、偏口、比目鱼，是我国北方海水 工厂化养殖的主要名贵鱼类品种，同时也是重要的海水增养殖鱼类之一。牙鲆属于鲽形目， 鲆科，牙鲆属。牙鲆属的鱼类在南、北美洲东西岸较多，而亚洲沿岸只有牙鲆一种，主要分布 于渤海、黄海、东海、南海以及朝鲜、日本、俄罗斯沿岸海区。近年来，腹水病、病毒性神经坏 死症等各种病害的爆发和流行给生产企业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了牙鲆养殖产 业的发展。腹水病在牙鲆疾病中危害最为严重，该病从苗种到成鱼均有发生，死亡率可达 50%-80%。由于目前对牙鲆免疫机理和机制的了解较少，尚无有效的免疫防治技术和治疗方 法。
[0007] TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通过感知病原微生物体，识别病原相关分子 模式，激活天然免疫系统。TLR8作为TLRs家族的成员，参与鱼类免疫调节，在一定程度上 反映了鱼类的免疫能力，因此可以作为鱼类疾病防治中免疫监测的指标。牙鲆模式识别受 体TLR8基因结构的阐明，有助于人们更加深入地了解TLR8的功能及其与鱼类免疫应答的 关系，加深人们对鱼类精细而复杂免疫应答过程的全面认识，从而为寻找诊断、预防和治疗 相关鱼病的新策略以及抗病育种设计、抗病性转基因鱼设计、基因疫苗的设计和疫苗的安 全使用等提供重要的理论基础，并在鱼类疾病防治，环境监测以及生态系统保护等方面发 挥作用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种牙鲆模式识别受体TLR8的cDNA序列及克隆方法。
[0009] 本发明采用的技术方案是通过以近源物种TLR8基因的CDS序列保守区设计兼并 引物，通过RT-PCR反转录及扩增，结合RACE技术获得牙鲆TLR8基因的全长表达序列。
[0010] TLR8基因cDNA全长3614 bp，含有3078 bp的开放阅读框，编码1024个氨基酸，其 中前21个氨基酸序列为信号肽序列。TLR8基因的起始密码子上游有一个终止密码子TAA， 距poly (A)尾38个碱基位置存在加尾信号AATAA。结合这两方面可以说明所得的cDNA为 TLR8基因的全长cDNA序列。TLR8基因编码的蛋白质，分子量为117.8 KDa，等电点为8. 68。
[0011] 本发明进一步公开了牙鲆模式识别受体TLR8基因序列在用于实时荧光RT-PCR检 测实现牙鲆疾病监测与防治方面的应用。实验结果显示：P〇ly(I:C)模拟病毒在腹腔注射 牙鲆后3小时内，牙鲆脾脏TLR8基因的表达量增高，而后，TLR8表达量降低至0时的水平 之下。牙鲆TLR8基因表达量的改变，提示我们TLR8参与了牙鲆对Poly(I:C)模拟病毒的 免疫应答，有潜力成为牙鲆病毒感染的早期监测指标。
[0012] 本发明更进一步公开了牙鲆模式识别受体TLR8的基因序列的克隆方法，其特征 是包括如下主要步骤： (1)健康牙鲆经免疫原免疫刺激后解剖分离脾脏组织： 由于TLR8基因为免疫相关基因，在病原感染后其表达量通常会有提高，因此在提取总 RNA之前对健康牙鲆首先进行免疫刺激。选择人工合成的Poly (I:C)为免疫原物，腹腔注射 牙鲆体内，免疫2 h后处死解剖分离脾脏组织。
[0013] (2)总RNA的提取和纯化： 采用Trizol法从牙鲆脾脏中提取得到牙鲆脾脏总RNA。总RNA纯化采用DNA酶消化 法。
[0014](3)中间片段的克隆测序： (3. 1) cDNA第一链的合成 以纯化的牙鲆脾脏总RNA作为模板，以01 igo (dT) 16为反转录引物，进行cDNA第一链合 成，得到的cDNA第一链，作为下述PCR扩增的cDNA模板。
[0015] (3.2)PCR 扩增 由于该基因较长，所以本发明选择将中间片段分为三段区域进行扩增。以前述所得的 cDNA第一链作为模板，利用下述三对引物进行TLR8基因中间片段1-3的扩增： 正向引物 1 :TLR8-F1 :5' -CCTTCCAGHCCRGACCDG-3'（H = A/C/T，R = A/G, D = A/G / T) 反向引物 1 :TLR8-R1 :5' -GTCTTGCGRCTGTATYGG-3' (R = A/G, Y = C/T) 正向引物 2 :TLR8-F2 :5' -CACCTSGCRGAAAACAG-3' (S = C/G, R = A/G) 反向引物 2 :TLR8-R2 :5' -GATTGCTCATTACCCACT-3' 正向引物 3 :TLR8-F3 :5' -CACATGITGGAYGCACCT-3' (Y = C / T) 反向引物 3 :TLR8-R3 :5' -GGTATGTCAGATTAGGTAGCG-3' 扩增得到牙鲆TLR8基因cDNA的三个中间片段，通过克隆测序，得到三个中间片段序 列。
[0016] 本步骤中，扩增体系可优选如下：
使用BIO-RAD C1000 Touch Thermal Cycler仪器进行梯度PCR扩增，程序参数可优选 为： 94°C 4 min ； 94°C 50 s;50~62°C 40 s;72°C 1 min (35 个循环）； 72°C 7 min ;12°C保温。
[0017] (4)3'端的克隆测序： 根据上述步骤（3)得到的中间片段序列，设计并合成用于3'端巢式PCR的两个正向引 物以及通用性反向引物，分别为： 通用反转录引物： 3-Ap ：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18-3' 巢式PCR正向特异性引物： TLR8. 3-F1 :5'-ATCCTCACTACCTCCTTCATTATTG -3' TLR8. 3-F2 :5'-GTCTCTGAGTGGGTAATGAGCAATC-3' 巢式PCR反向接头引物 TLR8. 3-R1 : 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC-3' TLR8. 3-R2 : 5'-GCTACGTAACGGCATGACAGTG-3' 以前述步骤（3)纯化的牙鲆脾脏总RNA作为模板，以3-Ap为反转录引物，进行cDNA 第一链合成，得到的cDNA第一链，作为3'端巢