一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因及其医用用图
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因，此外，本发明还涉及利用该 诊断基因蛋白制备单克隆抗体和多克隆抗体，可用于建立犬细粒棘球绦虫粪抗原的检测方 法，进一步讲是提供了用于犬的细粒棘球绦虫ELISA检测的蛋白基因，并应用于犬细粒棘 球绦虫双抗夹心ELISA方法的建立中，属于犬科动物疾病检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 犬细粒棘球绦虫病是细粒棘球绦虫成虫寄生于犬的 小肠内，使患犬食欲减退、消化紊乱，导致消化系统遭受严重损伤的一种寄生虫病。其虫卵 或者节片可随犬粪排出体外，感染牛、羊、猪等动物以及人。至今，犬细粒棘球绦虫病已在世 界范围内流行，尤其是牧业国家。已严重威胁人类健康和畜牧业的快速发展，给世界经济造 成了严重的损失。犬是细粒棘球绦虫的主要终末宿主，也是细粒棘球蝴病的重要传染源。因 此对犬感染该虫情况的动态监测、诊断并及时治疗对预防和彻底根除细粒棘球绦虫病具有 重大的意义。目前，细粒棘球绦虫成虫诊断抗原包括成虫虫体粗提抗原、囊液抗原、原头节 虫体抗原及其分泌物抗原等许多种类。用于诊断的成虫粗抗原虽然敏感性较高，但是特异 性很低。纯化后的抗原虽然特异性较粗提抗原高，但是敏感性同时也降低了。有些抗原又 具有时限性，有些抗原处理与制备操作复杂。对于重组抗原，应用于诊断领域的主要为Ag5 和AgB，但其常与其他寄生虫发生交叉反应。因此目前还有针对犬细粒棘球绦虫诊断的金 标准抗原。粪抗原的检测方法主要有槟榔碱导泻法、ELISA方法、PCR方法等，但是槟榔碱 导泻法的反应率具有一定的局限性；ELISA方法常出现敏感性低，并伴有一定的交叉反应； PCR方法常出现假阳性，并对仪器要求较高。至今也没有检测犬细粒棘球绦虫的金标准方 法。因此，选择高特异性的抗原，建立具有高敏感性、高特异性的犬细粒棘球绦虫粪抗原的 诊断方法十分必要。
[0003]
【发明内容】
： 本发明公开了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因，采用细粒棘球绦虫兔高免血清对 本实验室保存的细粒棘球绦虫CDNA文库进行相关抗原筛选，筛选出具有价值开放性阅读 框的基因。
[0004] 本发明所述的一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因，如SEQ ID NO 1所示。
[0005] 该序列具有864bp的开放性阅读框，编码288个氨基酸，基因序列经NCBI BLAST 氨基酸同源性分析与多房棘球绦虫诊断抗原gp50 (Echinococcus multilocularis diagnostic antigen gp50)的氨基酸序列（O3J06164. 1)有92%同源性，是一个未知的新基 因，命名为：EdiagA864。
[0006] 对本发明基因的编码蛋白经Sopma在线分析预测二级结构，其a -螺旋占10. 07%， 延伸链占33. 33%，无规则卷曲占56. 60%。延伸链和无规则卷曲共占89. 93% ;CBS在线预测 TMHMM跨膜结构分析，该基因编码蛋白为胞外蛋白；该蛋白具有含有B细胞表位的结构基 础。经 CBS Prediction Servers Linear B-cell epitopes 预测分析及 DNAMAN 亲水性及 疏水性分析，为构建有效的疫苗或诊断方法奠定基础，也为制备单克隆抗体与多克隆抗体 提供高特异性的抗原，建立了快速、特异性的检出犬细粒棘球绦虫粪抗原的双抗夹心ELISA 检测方法，对犬细粒棘球绦虫的防治提供新的依据或工具。
[0007] 本发明还提供了该基因蛋白的原核表达载体，其特征在于： 通过PCR方法扩增编号为EdiagA864的目的基因，其大小为864bp，回收该DNA后 连接PMD-18T克隆载体，载体构建完成后经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆 载体构建成功后，再将该基因与pET-32a载体连接，成功构建表达载体。表达载体转入 Transetta(DE3)大肠杆菌感受态后，诱导其表达可得到51kDa左右的蛋白条带，经Western Blot检测分析其具有良好的反应原性，为研制犬细粒棘球绦虫成虫的诊断抗原或疫苗奠定 了基础。
[0008] 本发明所述的一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因的制备方法，包括以下步骤： 首先采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选。对文库A噬菌 体进行平板培养，去除交叉抗体反应后用IPTG诱导其表达，用兔抗细粒棘球绦虫成虫高免 血清、HRP标记的羊抗兔IgG对所表达的蛋白进行阳性筛选。对其筛选出的阳性噬菌斑进 行插入基因的克隆及分析，获得基因并命名。然后对其进行开放性阅读框PCR扩增，连接 PMD-18T构建克隆载体，经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后，再 将该基因与pET-32a载体连接，成功构建表达载体。表达载体转入Transetta(DE3)大肠杆 菌感受态后，诱导其表达。最后对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳及Western Blot检测分析 其反应原性。
[0009] 本发明进一步提供了基于该基因蛋白的犬细粒棘球绦虫双抗夹心ELISA检测方 法，用于检测犬科动物是否感染犬细粒棘球绦虫，解决了槟榔碱导泻法的反应局限性及危 险性，检测血清特异性检测循环抗原及抗体等方法的不足，快速、特异性地检出犬细粒棘球 绦虫的感染，适用于工业化生产。
[0010] 所用捕获抗体为利用在大肠杆菌方.cWi (DE3)表达的EdiagA864蛋白作为抗原， 经免疫、细胞融合获得了杂交瘤细胞株，经腹水收集纯化而得的单克隆抗体；所用抗体稀释 液为pH值7. 4的磷酸盐缓冲液；包被液为pH值9. 6的碳酸盐缓冲液；封闭液为5%的脱脂 奶粉PBST液；洗涤液为Tween-20含量为0? 5%的0? Olmol/L的pH值7. 4的PBST溶液；终 止液为2mol/L H2S04溶液；酶标抗体为以重组蛋白EdiagA864为抗原，辣根过氧化物酶标记 免疫后的兔多克隆抗体；底物溶液为pH值5. 0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液和H202配置的邻苯 二胺（0PD);样品稀释液为Tween-20含量为0? 3%的0? Olmol/L的pH值7. 4的PBST溶液。
[0011] 本发明的积极效果在于：提供了一种细粒棘球绦虫成虫诊断蛋白基因的编码蛋 白，经Sopma分析其二级结构，具有含有B细胞表位的结构基础。经CBS在线预测TMHMM跨 膜结构分析，该基因编码蛋白为胞外蛋白。大部分抗原决定簇都位于亲水区。以在大肠杆菌 A cWi (DE3)表达的EdiagA864蛋白作为抗原，经免疫、细胞融合获得了杂交瘤细胞株，经 腹水收集纯化而得了单克隆抗体；以EdiagA864重组蛋白为抗原，经辣根过氧化物酶标记， 获得了酶标兔抗EdiagA864多克隆抗体，建立了检测犬细粒棘球绦虫的双抗体夹心ELISA 方法。
[0012] 本发明采用单克隆抗体与多克隆抗体，增加了双单克隆抗体夹心ELISA的敏感 性，减少了双多克隆抗体夹心ELISA反应的假阳性率。以该蛋白为基础建立的犬细粒棘球 绦虫检测方法特异性高、敏感性强、重复性好。具有操作简单、检测快速，易于判断等优点， 适合于临床的快速诊断和牧区、村镇等流行病学调查大规模应用。
[0013] 利用本发明的基因蛋白建立的双抗夹心ELISA可用于制备试剂盒，且所有试剂均 为已配制好的工作液，可以直接操作无需处理，减少了操作步骤，可以快速，灵敏检测待检 样品中的细粒棘球绦虫抗原，避免了复杂的操作，对设备要求低，可以适应多种检测环境； 且样本用量小，采集方便，试剂保存时间长，对操作者无毒性，对环境无污染等；因此本发明 筛选出的基因蛋白与应用制备的单克隆抗体及多克隆抗体建立的双抗夹心ELISA检测方 法均具有重大的社会意义和广阔的市场前景。且该犬细粒棘球绦虫基因蛋白不仅可用于建 立诊断方法，还应用与疫苗等领域，具有很大应用前景。
[0014]
【附图说明】： 图1筛选结果； 图2阳性噬菌斑的插入片段PCR扩增； 图3为二级结构预测； 图4为跨膜结构分析； 图5为抗原决定簇预测分析； 图6为疏水性分析； 图7为亲水性分析； 图8为ORF EdiagA864基因PCR扩增； 图9为EdiagA864-pMD-18T克隆载体双酶切鉴定结果； 图10为EdiagA864-pET-32a表达载体双酶切鉴定结果； 图11为EdiagA864-pET-32a重组蛋白SDS-PAGE电泳结果； 图 12 为 EdiagA864-pET_32a 重组蛋白 Western blot 鉴定结果； 图 13 为 EdiagA864 蛋白纯化 SDS-PAGE 结果，l:Marker ;2-5 :1-4 号收集管； 图14为SDS-PAGE验证腹水抗体的纯化效果； 图15为多克隆抗体的纯化，1-2 :纯化后；M :Marker ;3 :未纯化； 图16为多克隆抗体Western blot鉴定结果，1-2:上样量为10 yL;3-4:上样量为 2 y L ;M :Marke〇
[0015]
【具体实施方式】： 下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在 不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的 待批权利要求范围内。
[0016] 实施例1: 免疫相关抗原基因的筛选鉴定及原核表达 1. A噬菌体平板培养 取30 y L XLl-Blue菌种接于含四环素LB液体的试管中，37°C摇床过夜；取4mL菌液 5000g离心5min，弃上清，加入200 y L高压灭菌的10mM硫酸镁重悬细菌；加入重悬菌液 200 y L，1 X A Buffer 100 y L和细粒棘球绦虫cDNA文库100 y L混合均匀，于37°C水浴 20min ;加入48°C的LB/MgSOjM层琼脂3mL，混匀倒入提前预热的LB平板上并铺平，凝固后 倒放于37°C培养箱，直至平板上长出针尖样大小的噬菌斑。
[0017] 2 ?去除交叉抗体反应 将XLl-Blue接种于含四环素抗性的LB液体培养基里，放于37°C摇床培养过夜；离心 弃去上清后，用PBS重悬沉淀，超声破碎；对XLl-Blue A cWi裂解液12000g离心10min ; 取lmL上清加入20 y L的兔高免血清于4°C过夜反应。
[0018] 3. B策菌斑的蛋白诱导表达 向90mm培养皿中加入19mL TNT溶液，加入lmL IPTG ;取硝酸纤维素膜（NC膜)浸泡入 培养皿lOmin ;滤纸吸取膜上面残留的液体，平板倒放于37°C培养箱培养8h ;将取出的NC 膜放入含2mL灭菌胎牛血清的20mL TNT缓冲液中，振荡片刻后，放入4°C冰箱中，过夜封闭。
[0019] 4.检测噬菌斑中表达的融合蛋白 取出封闭后的NC膜，弃去封闭液后，TNT缓冲液洗涤3次/5min ;将NC膜放入含有 50 y L去处交叉抗体(兔高免血清终含量为1 y L)的20mL TNT缓冲液中，孵育5h ;TNT缓冲 液洗涤3次/5min ;将NC膜放入含有6 y L羊抗兔IgG的20mL TNT缓冲液中，孵育2h ;加入 各一滴DAB显色液显色，再用蒸馏水终止反应；将NC膜上的呈阳性的斑点与平板上的阳性 噬菌斑对应，吸取出噬菌体，加入200 y L含氯仿的SM缓冲液，放于4°C进行过夜反应(见图 1)〇
[0020] 5?插入基因的克隆及分析 使用该噬菌体的插入片段扩增引物进行PCR，以含有噬菌体的SM