一种与三聚氰胺特异结合的核酸适配体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与三聚氰胺特异结合的核酸适配体及应用，属于生物医学技术领 域。
【背景技术】
[0002] 三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，动物及人长期摄入三聚氰胺 会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。而一些非法商家仍 将三聚氰胺加入婴幼儿奶粉中，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症。因此，如 何快速、准确、灵敏地检测出三聚氰胺防患于未然已成为亟待解决的问题。
[0003] 核酸适配体是通过SELEX技术，从特定的寡核苷酸库中筛选得到的，能与靶分子 特异性、高亲和力地结合的一类寡核苷酸分子（DNA或RNA)。由于其具有靶分子范围广、分 子质量小、免疫原性低、易于化学合成、改造和标记等优点，核酸适配体在临床诊断鉴定和 疾病治疗领域中显示出了重要的应用价值。
[0004] 发明人将本发明的三聚氰胺特异性核酸适配体的核苷酸序列和基因数据库进行 了比对搜索，未发现有任何相同序列信息。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种与三聚氰胺特异性结合的核酸适配体，其核苷酸序列如 SEQ ID N0 :1所示；该核酸适配体为单链DNA，由84个核苷酸组成，拓扑学结构为直链状； 预测的二级结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-11. 62。
[0006] 本发明另一目的是将与三聚氰胺特异性结合的核酸适配体应用在识别三聚氰胺 或在制备检测三聚氰胺的试剂盒中。
[0007] 本发明的技术方案如下： 1、 三聚氰胺特异性核酸适配体（C04)的筛选、克隆、分离和测序 采用SELEX技术筛选出能够与三聚氰胺特异性结合的核酸适配体群体，设计引物 进行PCR扩增、克隆、分离和测序。利用酶联寡核苷酸吸附试验（EL0NA)进行验证，得到 适配体C04,它能够高亲和力高特异性的结合三聚氰胺。配体接头引物序列为：Aptamer Fw: GACATAITCAGTCTGACAGC;反向互补序列：CGCTGTCAGACTGAATATGTC;Aptamer Rv: GCTAGACGATAITCGTCCATC，反向互补序列：GATGGACGAATATCGTCTAGC。所获阳性单克隆进行核 苷酸序列测定，测序结果表明与三聚氰胺特异性结合的核酸适配体（C04)由84个核苷酸组 成，其序列（5'端至3'端）为： tgctagacga tattcgtcca tctgccctgc cgctccctac tcgggtgggg gatgatttgg atcgctgtca gactgaatat gtca ； 2、 核酸适配体（C04 )单链DNA二级结构表征 使用 MF0LD 软件（http://mfold. rna. albany. edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)对与 三聚氰胺特异性结合的核酸适配体C04单链DNA分子进行二级结构预测，结果表明，其二级 结构具有突出的环和茎，存在G-四链体结构，吉布斯自由能DG=-11. 62,显示该结构具有较 高的稳定性；其二级结构如下：
3、核酸适配体（C04 )的特异性和对三聚氰胺的敏感性 根据核酸适配体C04的序列，用体外转录方法合成生物素标记的核酸适配体，建立了 一种新型的酶联寡核苷酸检测方法，通过此方法对C04的特异性和其对三聚氰胺的敏感 性进行检测；结果显示，C04具有很高的特异性，其能检测到三聚氰胺的最低浓度为4 ng/ y L〇
[0008] 本发明的意义在于： 利用SELEX技术筛选出的配体C04能够高亲和力高特异性的识别并结合三聚氰胺；核 酸适配体C04的鉴别对于食品中残留的三聚氰胺的检测，进而降低三聚氰胺对人体的侵害 具有重要意义。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明中⑶圆二色谱法对K+浓度与核酸适配体C04的关系的分析； 图2为本发明中EL0NA法对核酸适配体C04的特异性分析，图中：空白对照1为三聚氰 胺+脱脂奶；空白对照2 :三聚氰胺+不含配体的生物素；阴性对照1为苏丹红+标记有生 物素的配体C04 ;阴性对照2为a -鹅膏毒肽+标记有生物素的配体C04 ;阴性对照3为草 甘膦+标记有生物素的配体C04 ;阴性对照4为瘦肉精+标记有生物素的配体C04 ;阴性对 照5为乙型脑炎NS1蛋白+标记有生物素的配体C04 ;阴性对照6为乙型脑炎core蛋白+ 标记有生物素的配体C04 ;三聚氰胺：三聚氰胺40 ng/ y L +标记有生物素的配体C04 ; 图3为本发明中Dot Blot法对核酸适配体C04的特异性分析，图中：1 :空白对照(三聚 氰胺+脱脂奶）；2 :空白对照(三聚氰胺+不含配体的生物素）;3 :阴性对照(苏丹红+标记 有生物素的配体C04) ;4 :阴性对照（a -鹅膏毒肽+标记有生物素的配体C04) ;5 :阴性对 照(草甘膦+标记有生物素的配体C04) ;6 :阴性对照(瘦肉精+标记有生物素的配体C04); 7 :阴性对照（乙型脑炎NS1蛋白+标记有生物素的配体C04) ;8 :阴性对照（乙型脑炎core 蛋白+标记有生物素的配体C04) ;9 :三聚氰胺40 ng/ y L +标记有生物素的配体C04 ; 图4为本发明中EL0NA法对核酸适配体C04的最佳浓度的分析，图中：空白对照1 :三 聚氰胺+脱脂奶；空白对照2 :三聚氰胺+不含配体的生物素；配体C04 :三聚氰胺+标记有 生物素的配体C04 ; 图5为本发明中EL0NA法对三聚氰胺灵敏度的分析，图中：空白对照：三聚氰胺+脱脂 奶；配体C04 :三聚氰胺+标记有生物素的配体C04。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合附图和实施例来进一步说明本发明的实质性内容，实施例仅为了更好理 解本发明但不局限与本发明范围，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂 如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0011] 实施例1:三聚氰胺核酸适配体（C04)的筛选 一、配基(三聚氰胺）与基质（琼脂糖凝胶6B)的偶联 1、在3 mL蒸馏水中悬浮1 g的冻干粉末琼脂糖凝胶6B (1 g冻干的粉末能够产生出 大约3. 0 mL的最终的基质体积）； 2、立即在烧结玻璃滤器中（多空度G3)用大约每克粉末200 mL的蒸馏水冲洗1小时； 3、 用6 mL的偶联缓冲溶液（0. 05 M，pH 9. 6的碳酸盐缓冲液)溶解6 g的配基，使其最 终浓度为1 mg/mL，或者用脱盐柱将溶解的配基转移到偶联缓冲溶液中，调整水相的pH值； 4、 将基质与上述步骤3中的浓度为1 mg/mL溶解好配基的缓冲溶液的比例调整为体积 比1:2,在25°C到40°C的水浴条件下，混合16 h，并且37°C摇床过夜； 5、 在40°C到50°C的条件下，用1M的氨基乙醇封闭过剩的基团，至少4 h或者过夜； 6、 用偶联缓冲液洗过剩的配基，4000 rpm离心2 min，吸取上清；用超纯水(每次7-8 mL)清洗3次；紧接着用0. 1 M NaHC03,0. 5 M NaCl，pH 8. 0的溶液清洗3-4次；然后用0. 1 M NaCl，0. 1 M醋酸盐，pH 4. 0的溶液清洗3-4次；最后用质量百分比浓度为20%乙醇6 mL 保存，放置于4 °C冰箱，封口膜封口，竖直放置。
[0012] 二、核酸适配体文库（ssDNA)的PCR 采用TaKaRa公司合成的ssDNA适配体文库； 1、 94°(：预热？0?仪； 2、 将 3 yL ssDNA、30.6 yL 去离子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP 混合物(各2. 5yM)、2yL正向扩增引物、2yL反向扩增引物以及0. 4 yL Taq酶离心管 进行反应。正向扩增引物序列为5 ' - GACATATTCAGTCTGACAGC-3 '，反向扩增引物序列为 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0013] 3、在PCR仪中按以下程序扩增 (1) 预变性 94 °C 5分钟； (2) 40个循环 94 °C 45秒钟 58 °C 45秒钟 72 °C 30 秒钟； (3) 后扩增 72 °C 7分钟。
[0014] 三、配体库的纯化、上样及洗脱 1、配体库的纯化 (1) 核酸适配体文库PCR产物直接与胶回收试剂盒里的溶液按体积比1:1比例混合，进 行DNA片段回收； (2) DNA片段回收后，95°C水浴lOmin，冰浴lOmin ;经过此变性处理，使双链DNA变成单 链 DNA。
[0015] 2、亲和层析 (1) 用偶联缓冲液洗脱偶联过的基质：先吸取上层酒精，加偶联缓冲液至6 mL，混匀， 离心，弃去上清液，此步骤重复3次； (2) 将上述第1步中的单链DNA加入到偶联过的基质中，于37°C温育并40 rpm轻柔转 动2 h ; (3) 加入前述样品到层析柱中，用2-3柱体积的超纯水冲洗柱子； (4) 然后用3-4柱体积的洗脱缓冲液（0. 1 M NaCl，0. 1 M醋酸盐，pH 4.0)进行线性梯 度洗脱，收集洗脱组分； (5) 洗脱组分与胶溶液等体积混合，回收后用TE溶液溶解，得到selex溶液。
[0016] 四、PCR优化和大量扩增核酸适配体 以上述selex溶液作为模板，按如下步骤操作： 1、 94°(：预热？0?仪； 2、 将5 yL 模板、28.6 yL 去离子水、5 yL 10XBuffer、3 yL MgCl2、4 yL dNTP混 合物(各2.5uM)、2 yL正向扩增引物、2 yL反向扩增引物、0.4 yLTaq酶，于PCR离心 管中进行反应。正向扩增引物序列为5' -GACATATTCAGTCTGACAGC-3'，反向扩增引物序列 为 5' -GCTAGACGATATTCGTCCATC-3'。
[0017] 3、在PCR仪中按以下程序扩增： (1) 预变性 94 °C 5分钟； (2) 37个循环： 94 °C 45秒钟 58 °C 45秒钟 72 °C 30 秒钟； (3) 后扩增 72 °C 7分钟； 4、循环结束后，将PCR产物用TIANGEN公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步 骤如下： (1) 将PCR产物与等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室 温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合，12000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液； (2) 加入700 ML的漂洗液(含乙醇）于离心纯化柱中，12000 rpm离心1分钟，倒掉收 集管中的废液； (3) 重复步骤（2); (4) 12000 rpm 离心 3 分钟； (5) 将离心纯化柱置于新的离心管中； (6) 加入30 ML超纯水，在室温下静置5分钟； (7) 12000 rpm离心1分钟，管底溶液即为纯化过的核酸适配体的PCR产物。
[0018] 实施例2:核酸适配体的克隆和测序以及单链DNA二级结构的预测 一、大肠杆菌D