一种百合花花部特异和伤害诱导的dxr启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种百合花花部特异和伤害诱导的DXR启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]启动子是位于结构基因5'端上游区的一段能识别并活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合，确保转录精确而有效地起始的DNA序列。它是植物基因转录调控的中心，是理解基因转录调控机制和表达模式的关键。
[0003]根据启动子的转录模式可将其分为:组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。其中，组织特异型启动子亦称为器官特异启动子，包括果实特异启动子、根特异启动子、叶特异启动子及花器官特异启动子等。在这类启动子的调控下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位，并往往表现发育调控的特性。
[0004]花器官特异表达启动子可使目的基因在花中特异性表达，可有效控制目的基因在花中特异表达且与花发育进程密切相关，此外，花器官基因作用时还会受到许多诱导型等调控元件的协同作用。矮牵牛的调控元件发现其中的一个G-box，是相关转录因子的结合域，是光、厌氧生活和ABA应答元件，受光和紫外线诱导调控，与花特异表达有关(洪亚辉等，2003)。当植物受到人为的创伤或害虫造成的机械损伤后，会产生一些小分子物质和多糖，它们作为信号物质诱导一系列防御基因的表达。土豆损伤基因蛋白酶抑制剂基因Pin II启动子伤诱导区域在启动子的近端区域，将-700?-195区段与-90CaMV35S启动子融合，发现嵌合启动子具有伤诱导的活性，因此认为该区段控制该基因的伤诱导表达。
[0005]花器官特异启动子不仅含有所必须的保守性顺式元件外，还含有一些组织特异型和诱导型启动子的特有序列。并且这种的组织特异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为基础，由这类启动子中同时存在几种控制组织特异性表达的元件的种类、数目及相对位置等共同决定。
[0006]目前对转基因技术中启动子的选择主要采用组成型启动子，在组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和不同的发育阶段都会表达，且持续、高效的表达，没有时空特异性，造成了能量的损耗，影响阳性植株的成活率，引起植株生理和形态发生异常改变，从而影响植物的正常生长发育。由于组织特异和诱导型启动子能够有效地调控下游基因的表达，最大限度地减少由于外源蛋白在转基因植物体内的积累对其自身造成的伤害。Pellegrineschi用胁迫诱导型启动子rd29A驱动DREB1A/CBF3的表达，提高了转基因小麦对干旱胁迫的耐性，而且没有引起明显的畸形。
[0007]花作为植物重要的生殖器官，在利用植物杂种优势人工创建不育系、以花器官的表达元件研究一些基因特别是转录因子的功能等基因工程研究中起重要作用。其中花药特异表达启动子和花粉启动子起到了十分重要的作用。利用花药绒毡层特异启动子TA29、
构建雄性不育基因，创造雄性不育性植株已在烟草、油菜等获得成功。常小丽(2009)将从百合中克隆到的花部特异的基因启动子转入拟南芥中发现，在转化植株的花序部位具有特异性表达。Lewinsohn等(2001)采用说启动子，将仙女扇的Z/5基因导入番茄，成熟的果实合成并释放香气明显的S-芳樟醇和8-轻基芳樟醇。Davidovich等(2007)采用/?启动子，将柠檬罗烯香叶醇合成酶(GES)基因转入番茄，该基因在转基因番茄果实中过量表达导致香叶醇的积累量增加，成功的改变番茄果实风味。在烟草中导入3个柠檬单萜合成酶基因，在组成型启动子35S的调控下成功改变了萜类化合物的含量(El-Tamer etal，2003);将西瓜的AGPLl启动子与甜味蛋白基因Brazzein的融合表达载体转入番茄，通过AGPLl果实特异启动子的调控，在不改变果实其他性状的前提下提高了番茄果实甜味品质(尹涛等，2009)。
[0008]随着植物基因工程技术的发展，组织特异和诱导型启动子可用于人为控制目标基因在植株的特定发育时期、特殊组织器官和相关逆境条件下精确表达，在改良作物的抗性、提高花卉的观赏状、改善果实和蔬菜的风味等方面具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0009]本发明的目的为了克服现有技术中对百合花花部特异和伤害诱导启动子的研究鲜见报道的缺陷，提供一种百合花花部特异和伤害诱导的DXR启动子。
[0010]本发明的另一个目的是提供一种百合花花部特异和伤害诱导的DXR启动子在培育改变花色、花香和育性等花部特有性状及提高抗性的植物新品种的应用。
[0011]本发明通过以下技术方案予以实现上述目的:
一种百合花花部特异和伤害诱导的DXR启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。该启动子总长度为1015bp，分段长度分别为534 bp, 767 bp和969bp。DXR启动子赋予百合花花香基因DXR花部特异和伤害诱导表达特征。本发明所述的DXR启动子序列与GUS基因融合表达转化烟草后，目标基因在烟草仅花组织表达，其表达与花发育进程有关，并且在叶片中表达受伤害和茉莉酸甲酯诱导。
[0012]经过软件分析得到所述DXR启动子含有3个5'端系列缺失的目的片段p_534、p-767 和 p-969，p_534、p_767 和 p-969 的序列如 SEQ ID N0:3 ?5 所示。
[0013]一种重组载体，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入如上所述DXR启动子序列(SEQ ID N0:2)o所述出发载体可以是本技术领域中经常用到的所有类型的植物表达载体，优选地，本发明所用的植物表达载体为PCAMBIA1300G植物表达载体。
[0014]一种重组载体，所述重组载体为在出发载体的多克隆位点插入如上所述DXR启动子的5'端系列缺失的目的片段p-534、p-767和p-969序列。所述出发载体可以是本技术领域中经常用到的所有类型的植物表达载体，优选地，本发明所用的植物表达载体为PCAMBIA1300G植物表达载体。
[0015]一种包含如上所述重组载体的重组菌。一种包含如上所述重组载体的细胞系。
[0016]DXR启动子在培育改变花色、花香和育性等花部特有性状的转基因植物新品种的应用。
[0017]一种培育转基因花香或抗性植物的方法，具体步骤为:将含有如上所述的重组载体导入出发植物细胞，从而得到DXR启动子启动目的基因表达的转基因花香或抗性植物。
[0018]优选地，所述目的基因为⑶S基因。
[0019]本发明同样包括将三种长度的启动子片段作为主要结构部分有效地连接上合适的目标功能基因所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种启动子片段的植物和这种植物的种子。
[0020]根据本发明提供的启动子DNA序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得等同的启动子DNA序列:(I)通过数据库检索获得；(2 )以启动子DNA片段为探针筛选百合花或其它植物的基因组文库获得；(3)根据启动子DNA序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从百合花或其它植物的基因组中获取；(4)在启动子DNA序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得。
[0021]本发明提供的启动子DNA序列具有重要的应用价值。应用之一是将所述的启动子DNA序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将启动子DNA序列导入植物细胞，可获得表达所述花部特异和伤害诱导表达特征，从而应用于生产。本发明所述的启动子DNA序列构建到植物转化载体中，可以对融合表达的下游基因进行调控，从而增强植物产生花香和增强抗性等能力。
[0022]本发明提供的启动子DNA序列的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、SSR (简单序列重复多态)、RFLP (限制性内切酶长度多态)、CAP (切割扩增片段多态)。用这些标记可鉴定百合花或其它植物的花香基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。
[0023]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明将克隆的DXR启动子DNA序列与控制花色、花香和抗性目标功能基因结合，有助于产生新的花色、花香和抗性植物，而且不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。另外，本发明能够进一步提供或应用上述DXR启动子DNA片段获得的新花色、花香和抗性的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其他的植株。
[0024]说明书附图
图1.DXR启动子与⑶S融合表达的转基因烟草⑶S在不同组织表达特异性；A:不同组织⑶S染色情况；B:不同组织⑶S酶活力测定。
[0025]图2.DXR启动子与⑶S融合表达的转基因烟草⑶S在花器官不同发育时期的表达;A:不同发育时期GUS染色情况，其中图示I为未开放的花蕾；2为半开状态的花瓣；3为盛开状态下的花瓣；4为凋谢期的花瓣；B:不同发育时期GUS酶活力情况。
[0026]图3.不同长度片段DXR启动子与⑶S融合表达的转基因烟草⑶S在花瓣中茉莉酸甲酯处理，伤害处理后的表达；A:不同处理后花瓣中⑶S染色情况；B:不同处理后花瓣中GUS酶活力情况；图示I为未处理的花瓣，2为茉莉酸甲酯处理的花瓣，3为伤害处理的花瓣。
[0027]图4.DXR启动子与⑶S融合表达的转基因烟草⑶S在叶片中茉莉酸甲酯，伤害的诱导表达；A:不同处理后，转DXR不同片段的叶片中GUS染色情况；B:不同处理后叶片中GUS酶活力情况。
[0028]图5.不同长度片段DXR启动子与⑶S融合表达的转基因烟草植株的PCR检测图；A: P-534转基因植株PCR检测(图示I为阳性对照，2为阴性对照);B:P_767转基因植株PCR检测(图示I为阳性对照，12为阴性对照)；C:P-969转基因植株PCR检测(图示1，2为阳性对照，16为阴性对照)。
【具体实施方式】
[0029]下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0030]实施例1
DXR启动子序列的获得
S1.百合花花瓣总DNA的提取:将经液氮研磨的0.1?0.2 g百合花植物花瓣粉末转移至2.0 mL离心管中。加入I mL预热的2% CTAB溶液，充分混匀，65°C水浴30分钟；每隔10