一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程领域，涉及CRISPR-Cas9技术，具体涉及一种以RNA介导 的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA。
【背景技术】
[0002] 基因组操作技术是基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对 特定基因或基因组靶位点进行精确编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育 种和模式动物等领域的研究热点。随着近几年ZFN、TALEN及CRISPR/Cas 9等新型基因组 定点编辑技术的出现，可以在不改变基因组组成情况下，只在特定的位点删除或插入研究 人员感兴趣的基因，具有很高的基因编辑效率。相比ZFN和TALEN，CRISPR/Cas 9介导的基 因组编辑其靶标序列的特异性决定于一段小的与靶标序列互补的RNA (sgRNA)。这种基于碱 基互补配对原则的识别，相比较于蛋白质与DNA之间的相互作用要更加稳定和简单，因其 构建方法简单快捷、效率高、脱靶效应低等优点目前已经成为基因组编辑的最主流技术。
[0003] CRISPR/Cas 9主要由两部分组成：具有核酸内切酶作用的Cas9蛋白和sgRNA嵌 合体，进行基因编辑大致的作用过程主要为：Cas9蛋白与sgRNA相结合组成蛋白质RNA复 合体，通过核酸sgRNA(RNA)对靶点基因核酸（DNA)碱基的互补完成配对识别（靶基因尚 需存在一个序列为NGG的原间区毗邻序列PAM)，随后Cas9蛋白则通过其具有的两个作用 域（RUVC)和（HNH)分别将该段DNA的双链切断降解，最终引入DNA双链断裂（DSB)，然后 激活细胞内的非同源末端连接修复机制或者同源重组修复机制，利用细胞自身的修复机制 对DNA进行遗传学修饰。CRISPR/Cas9系统打靶一个位点只需要在原有载体的基础上替换 20-30bp的核苷酸，相当于合成一对引物，相对于ZFN和TALEN构建过程更加简单快捷，适合 规模化、高通量的组装。而且，该系统还可以同时针对同一细胞中的多个位点进行研究，故 而更为简便和经济。此外，该技术还具有独特的优势：构建简单、方便、快捷；用于基因组的 点突变编辑优于ZFN或TALEN ;精确的切口酶活性用于基因治疗安全性高于ZFN或TALEN。 利用CRISPR/Cas9对基因组修饰培育转基因动物，可高效的造成突变，缩短动物新品种培 育的时间。
[0004] FecB基因位于绵羊的常染色体上，具有提高排卵率和产羔数等生物学作用。研究 表明，FecB基因是由BMPR-IB基因A746G碱基突变而来，而BMPR-IB基因是控制Booroola Merino羊高繁特性的主效基因。绵羊FecB基因被定位于6号染色体6q23~q31的狭窄 区域内，编码区由10个外显子组成，共1509bp，编码502个氨基酸。2001年，Mulsant和 Souza等发现绵羊FecB基因实际由BMPR-IB基因（骨骼形成蛋白IB型受体基因）突变而 来，由于该基因A746G碱基突变导致第249位的谷氨酰胺变为精氨酸，因而出现了 FecB表 型，关联分析表明，BMPR-IB基因的该处突变与FecB基因的行为完全一致，证明BMPR-IB基 因是控制Booroola、Merino羊高繁特性的主效基因。Campbell等的研究也证实了 BMPR-IB 基因A746G突变（FecB)是通过提高卵泡细胞对促性腺激素（GnRH)的敏感性而实现其生物 学效应。Montgaomery研究发现促性腺激素释放素受体（GnRHR)位于绵羊六号染色体FecB 位点的外侧，FecB基因突变可以增加GnRH的释放量，从而导致卵泡刺激素（FSH)的浓度上 升而排卵数增加。此外，研究者通过对Booroola羊多胎性状的分离规律研究表明，其多胎 性能是由于常染色体上的突变所致，该基因对排卵数是加性的，对产羔数是部分显性的。
[0005] 绵羊的繁殖性状是绵羊的重要经济性状。在绵羊品种库中现有的近700个品种 中，除少数具有产羔率高、性成熟早和常年发情的特点外，绝大多数属季节性发情，年产一 胎，每胎单羔的绵羊品种。因此，如何有效地提高绵羊的繁殖力成为人们十分关注的研究方 向。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专 用 sgRNA。
[0007] 本发明首先提供了一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA，为序列表的 序列4自5'末端第1至20位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5'末端第1至 20位核苷酸的RNA。本发明的实施例中，所述能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA 具体可为序列表的序列4所示的RNA或序列表的序列6所示的RNA。将序列表的序列4所 示的RNA命名为sgRNA-1。将序列表的序列6所示的RNA命名为sgRNA-2。
[0008] 编码所述"能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA"的DNA分子也属于本发 明的保护范围。所述DNA分子具体可为序列表的序列3所示的DNA分子或序列表的序列5 所示的DNA分子。
[0009] 含有编码所述"能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA"的DNA分子的重组 载体也属于本发明的保护范围。
[0010] 本发明还保护一种能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的靶向序列，如序列表的 序列3所示。
[0011] 本发明还保护一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括所述"能够特异的靶 向修饰绵羊FecB基因的sgRNA"。所述试剂盒还可包括Cas9mRNA。所述Cas9mRNA为编码 序列表的序列8所不Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具体可为具有序列表的序列9自5' 末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列9所示的RNA。
[0012] 本发明还保护一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括编码所述"能够特异 的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA"的DNA分子。所述试剂盒还可包括编码Cas9mRNA的 DNA分子。编码所述"能够特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA"的DNA分子具体可为序 列表的序列3所示的DNA分子或序列表的序列5所示的DNA分子。所述Cas9mRNA为编码 序列表的序列8所不Cas9蛋白的RNA。所述Cas9mRNA具体可为具有序列表的序列9自5' 末端第7至4278位核苷酸的RNA，更具体可为序列表的序列9所示的RNA。编码Cas9mRNA 的DNA分子具体可为具有序列表的序列7自5'末端第24至4295位核苷酸的DNA分子，更 具体可为序列表的序列7所示的分子。
[0013] 本发明还保护一种特异性敲除绵羊FecB基因的试剂盒，包括含有"编码所述能够 特异的靶向修饰绵羊FecB基因的sgRNA"的DNA分子的重组质粒。所述试剂盒还可包括含 有编码Cas9mRNA的DNA分子的重组质粒。
[0014] 本发明还保护一种特异性敲除绵羊FecB基因的方法，是将能够特异的靶向修饰 绵羊FecB基因的sgRNA和Cas9mRNA共转染绵羊细胞，从而敲除绵羊FecB基因。所述共转 染的方式具体可为共注射。所述绵羊细胞具体可为绵羊受精卵细胞。
[0015] 以上任一所述绵羊FecB基因可为编码序列表的序列2所示的蛋白质的基因。以 上任一所述绵羊FecB基因具体可为序列表的序列1所示的DNA分子或序列表的序列1自 5'末端第157-1665位核苷酸所示的DNA分子。
[0016] 目前在大动物基因组上实现修饰和改造的成本和技术要求仍然很高，因此获得特 异、高效的sgRNA成为绵羊基因组编辑培育的关键。本发明将上述sgRNA与Cas9mRNA共同 注射至绵羊受精卵，敲除效率可达38%，证明上述sgRNA特异性较高且能够精确靶向修饰 绵羊FecB基因，实现基因突变。本发明为首次采用CRISPR-Cas9技术在绵羊受精卵中实现 基因组精准修饰突变，利用这种方法不仅构建步骤简单、安全性高，而且大大降低了昂贵的 实验成本和缩短实验周期，为提高绵羊繁殖力奠定了基础，也为今后绵羊分子细胞工程育 种提供了安全、精准的新方法。
[0017] 本发明中，将sgRNA和Cas9mRNA显微注射动物受精卵，在整个打靶过程中不存在 外源DNA的整合，而且由于mRNA的不稳定性，不会长期存在于生物体内，也不会对环境产生 进一步影响，因而可以避免传统转基因导致的生物安全问题。采用本发明提供的sgRNA和 Cas9mRNA，可以借助CRISPR/Cas9基因组编辑技术在绵羊胚胎上对FecB基因进行定向修饰 和改造，可大大缩短育种时间，加快育种进程，提高绵羊繁殖力，为下一步通过受精卵注射 和胚胎移植开展绵羊基因组编辑育种奠定基础，同时为今后利用含有高繁殖力FecB基因 的杂种母羊和杂种公羊建立肉用多胎绵羊核心群，加速绵羊多胎品系的选育步伐有着深远 的意义。
【附图说明】
[0018] 图1为限制性内切酶Bbsl酶单酶切px330质粒后的1%琼脂糖凝胶电泳图；泳道 M 为 lkbDNA Marker。
[0019] 图2为采用FecB-TF和FecB-TR组成的引物对进行PCR扩增的PCR扩增产物的 2%琼脂糖凝胶电泳图；泳道1为15(^口0嫩1&^1?^。
[0020] 图3为sgRNA-3的凝胶电泳图；泳道M为RNA Marker。
[0021] 图4为采用Cas9_F和Cas9_R组成的引物对进行PCR扩增的PCR扩增产物的电泳 图；泳道 M 为 lkb DNA Marker。
[0022] 图5为Cas9mRNA的凝胶电泳图；泳道M为RNA Marker。
[0023] 图6为巣式PCR产物的电泳图；1-20为靶标基因FecB的PCR扩增产物，CK1、CK2 分别为裂解液和水对照，泳道M为150bp DNA Marker。
[0024] 图7为T7核酸内切酶I (T7E1)鉴定的结果；泳道1-22为靶标基因FecB的酶切产 物，CK1、CK2分别为裂解液和水对照的酶切产物，泳道M为150bp DNA Marker。
[0025] 图8为TA克隆测序比对的结果；框中的序列为sgRNA序列，GGG为FecB基因Cas9 打靶的PAM序列。
【具体实施方式】
[0026] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明，此外应理解，在阅读了 本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式 同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明， 均为常规方法，详见《分子克隆（第三版）》。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结 果取平均值。px330质粒：Addgene公司，货号为42330 ANA纯化试剂盒：Life Technologies 公司，货号为AM1908。
[0027] 实施例中的相关引物的核苷酸序列见表1。
[0028] 表1引物序列
[0029]
[0030] 注：各引物均为单链DNA分子。
[0031]实施例 1、制备 sgRNA 和 CastoRN