专利名称：一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的 SELEX技术(即系统进化指数富集技术)制备一组与人乳腺癌组织高特异 性和高亲和力的核酸适配子，以及所述核酸适配子衍生的序列和修饰序列 用于乳腺癌的诊断和靶向治疗。(二) 背景技术-乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，据权威医学资料统计，全 球每B分钟就有一人死于乳腺癌，乳腺癌已经成为严重威胁女性健康的重 要疾病。随着国民经济发展和人民生活水平提高，我国乳腺癌的发病率和 死亡率亦呈迅猛上升态势。中国抗癌协会的最新统计数字显示，中国妇女 乳腺癌死亡率正在以每年3%的速度增长，成为城市中死亡率上升最快的癌 症；乳腺癌在我国的发病率趋于年轻化；85%的患者到医院检査时己处于 乳腺癌的中晚期，早期发现率极低。更加值得注意的是，乳腺癌可通过直 接浸润、淋巴、血液等途径转移，其常见的转移部位依次为肺及胸膜、骨 骼、皮肤软组织、肝、脑，好发血行转移是乳腺癌突出的生物学特征，这 是本病治疗失败的主要原因所在，也是乳腺癌防治上一个非常棘手的难题， 造成数百亿人民币的社会负担。鉴于以上情况，卫生部疾控司在全国范围 内开展"百万妇女乳腺普查工程"，科学规范的乳腺筛査方案为其主要目 的之一，以最终实现对妇女乳腺癌的早期发现、早期诊断和早期治疗，提 高患者生活质量；因此乳腺癌诊治方法的研究对我国有着特殊而重要的社 会意义，同时也形成了相关医药产品的巨大市场，蕴藏着不可估量的经济 效益。SELEX技术(即系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制/ 发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库， 结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过 多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的核苷酸适配子(aptamers )。该技 术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋 白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特 点，与其他组合化学库如随机肤/肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势a.本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不同部位有选择性的标记。d.重复性好，稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子/SELEX技术 具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌 与非癌细胞间微小差异、筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。研究发现，乳腺癌细胞和正常乳腺细胞有着不同的形态和结构，造成 肿瘤细胞特征性形貌的分子基础可能是肿瘤细胞表面的特异分子、受体等， 也可能是癌组织特异标志物，或同一蛋白分子的不同修饰状态或构象结构， 这些特征不会因肿瘤的转移而丢失。
发明内容
本发明的目的在于提供一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用，它利用分子生物学技术中的SELEX技术 (即系统进化指数富集技术)采用消减-复合靶SELEX技术对乳腺癌组织和 正常乳腺组织进行筛选，获得与乳腺癌细胞有特异亲和能力的核酸适配子， 并通过对其核酸适配子特异耙标(肿瘤特异)的鉴定，发现肿瘤治疗新的 药物作用耙点，由此可以构建乳腺癌特异的耙向药物和早期诊断试剂。本发明的技术方案 一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸 适配子，其特征在于其核苷酸序列选自參 ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCAAAATACGCTGCTCTACTGGCTATCACTCTCGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 參 ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCCCAGGCTATTTCCAACTAGCAGCAAGGATAAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 參 ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCCTCCCAACCTATTCGCATTGCCCGACGTCAGCTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 争 ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCGGCTACACTGGTCAGGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 攀 ATCCGCCTGATTAGCGATACTCATTCCACATGTTCTACACCCTAGCCCCGTAGACAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCATCACCGCGTCAGACAAAGACCCACAACACCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 肇 ATCCGCCTGATTAGCGATACTACCCCCTATCACCTCAGTAAATGGGCAGTGTCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG ATCCGCCTGATTAGCGATACTTGCGCCCCCCTCTTTAAAGTCTCTCTACTGACCTGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGCCAGTACGTAACCTCGTCACTCTCCTTCGCCTC ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCACGCACCCTACGCAAAGACCGTTACCACGCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG 參 ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCCTCCCAACTGCCCCACGATACCCTCGATTAAGCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG上述所说的核酸适配子，包括DNA序列和RNA序列，其序列的结构 形式是下面12种二级结构之一。<formula>formula see original document page 9</formula>
上述所说的核酸适配子具有至少60%以上同源序列，且是具有相同功 能的核酸适配子。上述所说的核酸适配子，删除部分或增加部分核酸适配子残基，得到的具有相同功能的核酸适配子序列。上述所说的核酸适配子，进行碱基取代或部分修饰后，得到具有相同功能的核酸适配子序列。上述所说的核酸适配子有相应的衍生的核酸适配子序列。 上述所说的核酸适配子有相应的能与其序列进行杂交的核酸序列。 上述所说的核酸适配子通过对其核酸适配子肿瘤特异耙标的鉴定，发现肿瘤治疗新的药物作用靶点，由此构建乳腺癌特异的耙向药物和早期诊断试剂。本发明中用于SELEX (即系统进化指数富集)筛选的单链DNA随机 文库及引物由invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的 随机序列5'-ATCCGCCTGATTAGCGATACT- ( N35)-ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG-3'，库容量为1015，引物 l:5'-ATCCGCCTGATTAGCGATACT—3'，引物2:5'-biotin-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3'，弓l物3: 5'-biotin-ATC CGCCTGATTAGCGATACT-3'，引物4:5'-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3'。人乳腺癌组织来源于医院确 诊乳腺癌病人病人病理组织切片，核酸适配子的纯化试剂购于宝生物公司， PCR试剂盒、链霉亲和素磁珠与pGEM -T载体购于Promega公司。一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子的制备方法， 它是筛选和鉴定核酸适配子的技术路线，包括以下步骤
(1) ssDNA随机核酸文库的制备——利用消减SELEX方法进行筛选；(2) 扩增与人乳腺癌组织特异结合的核酸适配子——进行下一轮筛选；(3) 不少于12轮筛选后获得目的核酸适配子序列；(4) 克隆测序；(5) 与人乳腺癌组织的特异结合活性检测。 本发明的优越性在于1、本发明采用的技术可以高通量的筛选与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的一组核酸适配子；2、核酸适配子具有比抗 体不可比拟的优势，如体外筛选、合成，易于标记、稳定性高等优点；3、 所获得的针对人乳腺癌组织的核酸适配子通过对其核酸适配子肿瘤特异靶 标的鉴定，可以发现肿瘤治疗新的药物作用靶点，由此用于人乳腺癌的靶 向治疗的乳腺癌特异靶向药物和人乳腺癌临床诊断的早期诊断试剂。(四)
附图1为本发明所涉一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用中的核酸适配子T载体阳性克隆的质粒琼脂糖 凝胶电泳图(如图所示在分子量3000bp左右有明显的质粒条带，而且 以超螺旋为主)。附图2为本发明所涉一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸 适配子及其制备方法与应用中的质粒PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图(我们 的目标条带的分子量大小为81bp，如图所示有分子量为81bp的目标条带， 将有目标条带的阳性克隆进行测序)。附图3为本发明所涉一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸 适配子及其制备方法与应用中的核酸适配子的特异性鉴定结果(如图所示-空白对照的病理切片上没有棕黄色颗粒的出现，而乳腺癌组织切片上的乳 腺癌变部位显示明显的棕黄色颗粒，表明我们筛选得到的DNA适配子与人 乳腺癌组织有特异反应)。附图4为本发明所涉一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸 适配子及其制备方法与应用中的获得的一个核酸适配子的检测乳腺癌的结 果(如图所示空白对照组无明显棕黄色沉淀，而乳腺癌组织显示明显的 棕黄色沉淀，表明筛选得到的核酸适配子能与乳腺癌组织特异结合，从而 在临床上可用于乳腺癌的检测和诊断。(五)
具体实施例方式实施例l:体外筛选与人乳腺癌特异结合的核酸适配子 利用引物l、引物2扩增单链DNA文库引物1和引物2的浓度为 lOOpmol，扩增条件为94。C预变性3min，然后94'C变性40s， 65。C退火 lmin, 72。C延伸2min，循环30次，最后72。C延伸7min。将扩增5，端带有 生物素标记的dsDNA产物与链酶亲和素磁珠结合，室温30min，然后用 0.15mol/L的NaOH作用15min使dsDNA变性解链，磁分离得到ssDNA， 将ssDNA于95t:作用5min，于冰中2min，室温放置10min,既为ssDNA 文库。病理切片常规脱蜡至水，将制备ssDNA文库与正常乳腺组织反筛 后，与人乳腺癌组织孵育。用洗脱缓冲液(20mmol/L Tris—HCl， 4mol/L 异硫氰酸呱，lmmol/LDTT)将ssDNA从人乳腺癌组织上洗脱下来，用作 扩增的模板，进行下一轮筛选。共进行12轮筛选以便得到预期具有高亲 和力的寡聚核苷酸。以第12轮筛选所得文库为模板，以引物1和引物4进行PCR，琼脂糖 电泳后回收81bp处片断，与T载体4"C连接过夜，转化DH5a感受态细胞， 涂板(Amp+， IPTG诱导，X—gal为底物)，37'C培养16h后，挑取单克 隆白斑，置Amp+液体培养基摇菌过夜，提取质粒，如图l所示质粒电泳 图。以质粒为模板，以引物l，引物4扩增，如图2所示在81bp左右处有 扩增出的目标条带，将有目的条带的阳性克隆进行序列测定。以第12轮筛选所得文库为模板，以引物3和引物4进行不对称PCR, 反应产物主要为5'生物素标记的DNA适配子于95'C作用5min,于冰中 2min，室温放置10min，人乳腺癌病理切片常规脱蜡至水，3%&02作用20min 封闭内源性过氧化物酶，PBS洗5min，与制备好DNA适配子室温孵育lh， PBS洗3X5min。切片与辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育30min， DAB显 色，镜下观察并照相，如图3所示空白对照的病理切片上没有棕黄色颗 粒的出现，而乳腺癌组织切片上的乳腺癌变部位显示明显的棕黄色颗粒。实施例2:体外筛选与人乳腺癌特异结合的核酸适配子利用引物l、引物2扩增单链DNA文库采用不对称PCR，引物l/引 物2浓度比100: 1，扩增条件为94T:预变性3min，然后94'C变性30s， 65。C退火45s，循环35次，72。C延伸lmin，最后72。C延伸7min。将获得 的产物主要为ssDNA，于95。C作用3min，于冰中2min,室温放置10min， 既为ssDNA文库。乳腺癌病理切片常规脱蜡至水，将制备ssDNA文库与正 常乳腺组织反筛后，与人乳腺癌组织孵育。用洗脱缓冲液(20mmol/L Tris—HC1， 4mol/L异硫氰酸呱，l咖ol/L DTT)将ssDNA从人乳腺癌组织 上洗脱下来，用作扩增的模板，进行下一轮筛选。共进行12轮筛选以便
得到预期具有高亲和力的寡聚核苷酸。以第12轮筛选所得文库为模板，以引物1和引物4进行PCR， 3%琼脂 糖凝胶电泳后回收81bp处目的片断，与T载体4'C连接过夜，转化DH5a 感受态细胞，涂板(A卿+， IPTG诱导，X—gal为底物)，37。C培养18h后， 挑取单克隆白斑，置Amp+液体培养基摇菌16h,提取质粒以质粒为模板， 以引物l,引物4扩增，在81bp左右处有扩增出的目标条带，将有目的条 带的阳性克隆进行序列测定。以第12轮筛选所得文库为模板，以引物3和引物4进行不对称PCR， 引物3/引物4浓度比100: 1反应产物主要为5'生物素标记的DNA适配 子于95TM乍用5min，于冰中2min，室温放置10min备用。人乳腺癌病理 切片常规脱蜡至水，设立空白对照组，0.3%H202-甲醇溶液作用20min封闭 内源性过氧化物酶，TBS洗5min，与制备好DNA适配子室温孵育lh， TBS 洗3X5min。切片与辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育30min， DAB显色， 镜下观察，空白对照组无明显棕黄色沉淀，而乳腺癌组织显示明显的棕黄色 沉淀，表明筛选到的核酸适配子与乳腺癌组织特异结合。实施例3:筛选的核酸适配子用于乳腺癌的检测以筛选的所测序列为ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCG GCTACACTGGTCAGGGACTTGAGCMAATCACCTGCAGGGG阳性克隆质粒为模板，以 引物3和引物4进行不对称PCR，引物3 (lOOpmol) /引物4浓度比200: 1,扩增条件为94-C预变性3min，然后94。C变性30s, 65。C退火45 s， 72'C延伸lniin，循环35次，最后72。C延伸7min，。将获得的产物主要为 biotin-ssDNA，于95。C作用3min,于冰中2min，室温放置10min，作为检 测试剂备用。人乳腺癌病理切片常规脱蜡至水，设立空白对照组，0. 3%H202-甲醇溶液作用30min封闭内源性过氧化物酶，TBS洗5min，与制备好DNA适 配子室温孵育lh， TBS洗3X5min。切片与辣根过氧化物酶标记的亲和素 (1: 1000稀释)孵育30min, DAB显色液(50mg溶于100ml TB液中，临 用前加入1011130%}|202)中显色5-10min，镜下观察控制显色程度。如图 4所示空白对照组无明显棕黄色沉淀，而乳腺癌组织显示明显的棕黄色 沉淀，表明筛选得到的核酸适配子能与乳腺癌组织特异结合，从而在临床 上可用于乳腺癌的检测和诊断。
权利要求
1、一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，特征在于其核苷酸序列选自● ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCAAAATACGCTGCTCTACTGGCTATCACTCTCGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCCCAGGCTATTTCCAACTAGCAGCAAGGATAAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCCTCCCAACCTATTCGCATTGCCCGACGTCAGCTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCGGCTACACTGGTCAGGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTCATTCCACATGTTCTACACCCTAGCCCCGTAGACAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCATCACCGCGTCAGACAAAGACCCACAACACCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTACCCCCTATCACCTCAGTAAATGGGCAGTGTCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTTGCGCCCCCCTCTTTAAAGTCTCTCTACTGACCTGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGCCAGTACGTAACCTCGTCACTCTCCTTCGCCTCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTAACCCCACAACGCCAGACCTCGAAGGGACAACCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCACGCACCCTACGCAAAGACCGTTACCACGCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG● ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCCTCCCAACTGCCCCACGATACCCTCGATTAAGCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG
2、 根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的 核酸适配子，其特征在于它包括DNA序列和RNA序列，其其序列的结构 形式是下面12种二级结构之一。 <formula>formula see original document page 3</formula>
3、 根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的 核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子具有至少60%以上同源序列， 且是具有相同功能的核酸适配子。
4、 根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的 核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子，删除部分或增加部分核酸适 配子残基，得到的具有相同功能的核酸适配子序列。
5、 根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子，进行碱基取代或部分修饰后， 得到具有相同功能的核酸适配子序列。
6、 根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的 核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子有相应的衍生的核酸适配子序 列。
7、 根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的 核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子有相应的能与其序列进行杂交 的核酸适配子序列。
8、 一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子的应用，其 特征在于所说的核酸适配子通过对其核酸适配子肿瘤特异耙标的鉴定，发 现肿瘤治疗新的药物作用靶点，由此构建乳腺癌特异的耙向药物和早期诊 断试剂。
9、 一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子的制备方 法，它是筛选和鉴定核酸适配子的技术路线，包括以下步骤(1) ssDNA随机核酸适配子库的制备——利用消减SELEX方法进行筛选；(2) 扩增与人乳腺癌组织特异结合的核酸适配子——进行下一轮筛选；(3) 不少于12轮筛选后获得目的核酸适配子序列；(4) 克隆测序；(5) 与人乳腺癌组织的特异结合活性检测。
全文摘要
本发明涉及一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用，该核酸适配子包括DNA序列和RNA序列，它能与人乳腺癌组织特异性地结合。因此，本发明核酸适配子可以用来诊断人乳腺癌和用于人乳腺癌的靶向治疗。本发明中的核酸适配子对人乳腺癌具有高的特异性、亲和力，而对正常乳腺组织无反应。本发明还涉及所述核酸适配子序列的衍生序列，包括修饰后的序列。
文档编号C12N15/12GK101148666SQ200610015738
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月22日 优先权日2006年9月22日
发明者吴淑庆, 弓景波 申请人:国家纳米技术与工程研究院;清华大学