专利名称：毕赤酵母ω3－脂肪酸脱氢酶启动子序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是一种从毕赤酵母中分离的ω3-脂肪酸脱氢酶启动子序列及其应用。从毕赤酵母总DNA中克隆出这一ω3-脂肪酸脱氢酶启动子，并与不同的表达载体连接，转化不同的微生物，使其转基因微生物表达其下游基因的方法和应用。
背景技术：
PUFAs(polyunsaturated fatty acids)是以多种形式存在于细胞中，如细胞膜、储存脂、甘油三脂、鞘脂和脂蛋白等，在细胞内行使不同的生物学功能。PUFAs主要有两大类，n-6和n-3，它们是分别以亚油酸(Linoleic acid，LA表示为18:29，12n-6)和α-亚麻酸(α-Linolenic acid，ALA表示为18:3Δ9，12，15n-3)为底物合成的。两类不饱和脂肪酸在生物体内不仅代谢途径不同，而且有着不同的生物活性，例如在n-6类PUFA中LA是神经酰氨的重要组成成分；AA是类花生酸的前体，类花生酸包括白细胞三烯、前列腺素和凝血烷等功能激素，这些激素参与一些生理和病理过程，如分娩起始，血小板聚集，肾脏的电解质调节，胚细胞移植及免疫细胞的激活；n-6PUFA还可能在细胞间信号传导方面充当第二信使的作用。而在n-3类PUFA除了为代谢过程提供能量和碳原子外，EPA和DHA也可以作为类花生酸的前体，但是与AA衍生的类花生酸相比，只是在EPA和DHA含量很高的组织内才能形成相当数量的这些激素类物质，因此可能只是起到了一些抗炎的作用；DHA在维持视网膜和神经组织的细胞膜功能方面起到非常重要的功能。视网膜和神经组织中如果缺乏n-3PUFAs则会被22:5n-6代偿性的替代，这样的微小改变会足以引起记忆的丧失和视力的损坏。
在大部分真菌和植物体内，n-6类不饱和脂肪酸都是经ω3-脂肪酸脱氢酶催化脱氢生成n-3类不饱和脂肪酸的，所以ω3-脂肪酸脱氢酶是n-3类高不饱和脂肪酸合成过程的限速酶，因此受到多个水平的调节，例如底物或产物水平调节，温度调节，细胞调控因子调节等等，而且这些调节都是通过直接或间接的与其上游启动子相互作用来实现的。虽然目前已从多种生物体内克隆到ω3-脂肪酸脱氢酶基因序列，但对其启动子序列的克隆和分析尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种从毕赤酵母中分离的ω3-脂肪酸脱氢酶启动子序列及其应用。本发明在于转基因微生物中使其外源基因的表达，毕赤酵母中ω3-脂肪酸脱氢酶的表达调控和菌体内α-亚麻酸的含量调节。因此，本发明对改良转基因微生物品质来生产药用α-亚麻酸和高不饱和脂肪酸非常有用。
本发明提供从毕赤酵母中分离的ω3-脂肪酸脱氢酶启动子核苷酸序列，具体讲是毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶启动子核苷酸序列及其应用。将该启动子下游衔接其它外源基因，并与不同的表达载体连接，转化到微生物中，表达其下游基因的方法和应用。
本发明的目的是提供含有该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接，构建功能性表达的表达载体。
本发明的另一个目的是提供含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化宿主细胞或宿主孢子及其后代。
本发明的另一个目的是提供一种用含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化宿主细胞或宿主孢子及其后代细胞，并以此来进行转基因微生物品质改良来生产药用α-亚麻酸和高不饱和脂肪酸等。
本发明提供的毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶启动子序列包括(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(2)与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)与(1)或(2)的核苷酸序列具有基本序列同源性的核苷酸序列；或(4)是(1)、(2)或(3)的核苷酸序列的类似物的核苷酸序列；或(5)与(1)、(2)、(3)或(4)的核苷酸序列，在杂交条件下杂交的核苷酸序列。
本发明的第二方面，提供了含有上述核苷酸序列与质粒载体所构建的重组表达载体。如表达载体pYEPppw3P。
本发明提供一种基因工程化的宿主细胞，它是选自1)用所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；2)用所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。所述的宿主细胞是微生物宿主细胞的后代、蛋白质组成已经改变的微生物细胞。所述的微生物是大肠杆菌或酿酒酵母。
所述的宿主细胞是酿酒酵母细胞。
本发明提供了一种用含有该启动子核苷酸序列或该启动子核苷酸序列与其它外源基因连接的表达载体转化的宿主细胞及其后代细胞来进行转基因微生物蛋白质组成改良来生产药用α-亚麻酸和高不饱和脂肪酸等。
本发明所述的在微生物细胞中表达ω3-脂肪酸脱氢酶启动子的方法，包括下述步骤1)将含有上述核苷酸序列的表达载体载体导入微生物细胞。
2)使所述的微生物细胞生长形成菌体细胞。
本发明可用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品。
本发明所述的毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶启动子序列的分离方法包括下述步骤1)提取毕赤酵母总DNA，将基因组用SalI单酶切。
2)以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)Δ6-脂肪酸脱氢酶开放阅读框架双酶切(BamHI&SalI)所得片段(663bp-1090bp，SEQ ID NO2)作为接头，将酶切后基因组和接头按摩尔比1∶3的比例进行过夜连接。
3)设计并合成如下三条引物引物1GAACTCCTCA GCGGTGTATG GAACAAAGAC引物2ATGACCTGTT GCCTTATGAT GC引物3GGCGATTGT GTTCTCGCTC
4)以连接产物为模板，进行PCR反应反应组分 加入量缓冲液(10×)(含20mmol/L MgCl2)5μldNTP(2.5mmol/L)2μl引物1(1μmol/L)2μl引物2(1μmol/L)2μlTaq(5u/μl)0.5μlH2O 36.5μl模板DNA(0.1μg/μl)1μl总体积 50μl扩增条件94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min。
5)以PCR产物100倍稀释作为模板，以引物1、3，作为引物，如上体系，如上条件进行PCR。
6)回收PCR片段，亚克隆到测序载体；再转化到大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素，终浓度为50-100μg/ml的LB(Luria-Bertani)固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经NcoI和SacI双酶切鉴定和PCR扩增鉴定阳性克隆。
7)对阳性克隆质粒进行测序，确证启动子片段。
本发明中所述的核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入、倒位的核苷酸序列，即原始分离序列的人工突变体，它还具有它的启动子功能。还可以是所述的核苷酸序列与其它的启动子序列的融合序列。
本发明中所述的其它外源基因是指任何一段核苷酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能的，包括RNA或DNA序列，该序列与ω3-脂肪酸脱氢酶启动子正常情况不相结合。此核苷酸序列包括不同于启动子的微生物种类得到的异源核苷酸序列，以及从相同于启动子的微生物种类得到的同源核苷酸序列，但这些序列与野生型(非转基因)微生物的启动子无关。
本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在微生物中进行表达的任何一种载体，例如pYES2.0、pYEP356等。
本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入微生物细胞或微生物孢子的任何转化方法，如细胞电脉冲转化法等。
本发明中所述的宿主细胞或及其后代细胞是指所有微生物细胞或微生物孢子或由这些细胞或孢子繁殖的微生物体。
术语“核苷酸序列”指含有天然存在的碱基，糖和糖之间(支链)的键的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括含有发挥相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可也指基因组或合成的DNA，它们可以是单链或双链，代表有义。
术语“ω3-脂肪酸脱氢酶启动子”是指在启动子控制下表达的基因在有或没有基本表达的微生物细胞中优先表达。
术语“具有基本序列同源性的序列”是指与(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或(2)与(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列之中的序列相比有轻微的或无关紧要的序列变化的那些核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的表达。这些变化可能是由于局部的突变或结构上的修饰。
术语“杂交的序列”是指可以在严格杂交条件下与所述的核苷酸序列(1)、(2)、(3)或(4)之中的序列杂交的核苷酸序列。“严格杂交条件”是指本领域技术人员已知的，或者可以在《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯编著，科学出版社，第二版，1993)中的通用方案中找到。
本发明克隆的毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶基因启动子是首次克隆到的毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶基因启动子，而且是这一启动子的ω3-脂肪酸脱氢酶启动子活性的功能验证。本发明在于转基因微生物中使其外源基因的表达，避免了外源基因在其它部位持续表达所带来的不利影响。因此，本发明对转基因微生物来生产药用蛋白非常有用。这一启动子的研究和开发，对今后转基因植物，转基因微生物具有重大应用前景。
图1酿酒酵母表达载体pYEPpp3示意图。
图2酿酒酵母重组表达载体pYEPppw3P示意图。
图3A、显示α-亚麻酸甲基酯标准物的气相色谱图。
图3B、含pYEPppw3载体的转基因酵母的气相色谱图。
图3C、含重组质粒pYEPppw3P的转基因酵母的气相色谱图。
具体实施例方式
实施例1.毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶基因启动子序列(ppw3P)的分离提取毕赤酵母总DNA，将基因组用SalI单酶切。以深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)Δ6-脂肪酸脱氢酶开放阅读框架双酶切(BamHI&SalI)所得片段(663bp-1090bp，SEQ ID NO2)作为接头，将酶切后基因组和接头按摩尔比1∶3的比例进行过夜连接。设计并合成如下三条引物引物1GAACTCCTCA GCGGTGTATG GAACAAAGAC引物2ATGACCTGTT GCCTTATGAT GC引物3GGCGATTGT GTTCTCGCTC以连接产物为模板，进行PCR反应反应组分 加入量缓冲液(10×)(含20mmol/L MgCl2)5μldNTP(2.5mmol/L)2μl引物1(1μmol/L)2μl引物2(1μmol/L)2μlTaq(5u/μl)0.5μlH2O 36.5μl模板DNA(0.1μg/μl)1μl总体积 50μl扩增条件94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min。
以PCR产物100倍稀释作为模板，以引物1、3，作为引物，如上体系，如上条件进行PCR。回收PCR片段，亚克隆到测序载体；再转化到大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素，终浓度为50-100μg/ml的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经NcoI和SacI双酶切鉴定和PCR扩增鉴定阳性克隆。对阳性克隆质粒进行测序，得到含有潜在启动子序列(SEQ ID NO1，392-779)的ω3-脂肪酸脱氢酶的上游序列(SEQ ID NO1)。
实施例2酿酒酵母重组表达载体的构建根据SEQ ID NO1，392-779所示序列，设计出基因特异性扩增引物(引物5和6)分离其潜在启动子序列引物45-GGCAAGCTTATGTCAAAAGTCACTGTTTCGGG-3`；引物55`GCCTCTAGATTAGGTATCC TTAGG-3`；引物65`-GGCGGTACCGCCGAAGAAAGTAGAAGAGAAG-3`引物4和5的5`端黑体分别含有HindIII和XbaI酶切位点，用于分离ω3-脂肪酸脱氢酶的开放阅读框架(ppw3)。引物6和5的5`端黑体分别含有KpnI和XbaI酶切位点，用于分离ω3-脂肪酸脱氢酶的开放阅读框架及其潜在的启动子序列(ppw3p)。所用的扩增条件和反应组分同上，然后分别取50μl PCR产物和1μl pYEP356分别进行双酶切，回收酶切大片段，并用T4连接酶在4度冰箱中过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见附图2和3，所构建的含有ω3-脂肪酸脱氢酶基因的开放阅读框架酵母表达质粒命名为pYEPppw3。该质粒是由pYEP356和引物4和引物5的PCR产物构建而成。质粒和分别经HindIII和XbaI双酶切后，电泳回收纯化，经T4DNA Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选鉴定出重组质例，命名为pYEPppw3。所构建的含有ω3-脂肪酸脱氢酶基因的开放阅读框架及其潜在的启动子序列的酵母表达质粒命名为pYEPppw3p。该质粒是由pYEP356和引物6和引物5的PCR产物构建而成。质粒和分别经KpnI和XbaI双酶切后，电泳回收纯化，经T4DNA Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选鉴定出重组质粒，命名为pYEPppw3p。
实施例3电击介导的重组质粒酿酒酵母转化将酿酒酵母菌株INVSc1从甘油管中划线接种于YEPD平板上，30℃培养48h进行活化；挑取单菌落于5ml YEPD液体培养基中，30℃、250rpm振荡过夜培养；检测菌液的OD600值，取适量菌液稀释于50ml YEPD液体培养基中，使OD600＝0.4，继续培养2-4h2500rpm离心沉淀细胞，去上清，加50ml提前冰浴的无菌水离心洗涤两次，冰浴的1mol/L山梨醇离心洗涤两次；2ml 1mol/L山梨醇重悬细胞重悬细胞，并以100μl/管分装，至于冰上尽快使用。在100μl感受态酵母细胞中加入10μg重组表达质粒轻柔混匀；设置MicroPulser到“ScaI”挡，参数为Voltage 2.0kV，Number of pulses1；将质粒和酵母细胞混合液转入提前冰浴的0.2cm电击杯中，使液体尽量流到管底，至于电转化仪上进行电击；取下电击杯；立即加入1ml冰浴的1mol/L山梨醇并涂布于SC-Ura(无尿嘧啶)选择性固体培养基(含2％的葡萄糖)上，置30℃培养48h或直至转化子出现实施例5酵母工程菌的诱导表达挑取SC-Ura(无尿嘧啶)选择培养基平板上出现的阳性转化，接种于15ml SC-Ura选择培养基(含2％的葡萄糖)，28℃摇菌过夜培养，以5％的接种量加入含有2％的葡萄糖的100ml SC-Ura培养基，28℃继续培养72h；2500rpm收集菌体，用去离子水洗涤三次，50℃烘干，研碎，取100mg加入5ml 5％的KOH-CH4OH溶液，70℃反应2-3h；反应结束，冷却到室温，用6mol/L的盐酸调节溶液的pH值到2.0，加入4ml 14％BF3-CH3OH，70℃反应1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入饱和的NaCl溶液10ml，剧烈震荡混匀，并转移到分液漏斗中，用8ml 1∶4的氯仿∶己烷抽提两次，合并提取液；加入适量无水Na2SO4干燥提取液，静置1h，去掉Na2SO4，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮气吹干，用200μL的正己烷回溶样品，后用0.45mm的微孔滤膜过滤。
实施例6脂肪酸气相色谱分析按如下条件进行仪器为岛津GC-7A，柱子弹性石英毛细管柱，0.32×30m，固相支持物聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate，DEGS)镀膜物聚酰亚胺。载气N2，线速10cm/s。分流比100∶1，气化室温度250℃，柱温180℃，尾吹50ml/min，检测器氢火焰离子化检测器。以Sigma公司生产的LA甲酯为标准品，把上述方法制备的脂肪酸甲酯化的样品，进行GC分析，上样量为1μl；分析软件Anstar，分析之星色谱工作站。
色谱分析结果见附图4，附图4显示亚油酸甲基酯标准物(4A)、含pYEPppw3载体的转基因酵母(4B)和含重组质粒pYEPppw3p的转基因酵母(4C)的气相色谱图。通过与已知的脂肪酸甲基酯标准物的保留时间进行比较鉴别出各个峰。图4C中保留时间为14.76min对应的峰即为毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶催化油酸产生的亚油酸，而图4B中没有相应的峰出现。由此可知，所分离的ω3-脂肪酸脱氢酶的上游序列具有启动子活性。
序列列表 SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶启动子序列及其应用<130>2006 07 21<160>2<170>Patentln version 3.3<210>1<211>780<212>DNA<213>毕赤酵母(Pichia pastoris)<400>1gtcgacattg tcaagcgaag aagattacta aacattttca ctgagcatgt agtcacactg60tcttgcaatg cttatggatc acacattatg gacaaattat ggcaattctc catcaagttg120aatctcttca aagacagaat tgcactggct ctgtttgaaa acaaagacaa aatcaaggac180agcatctatg gaaaacttgt ttggaagaac tggtctatgg agttatattg ccgaagaatg240tatgactgga aaaatcttat aaaacagcag gagttggagc ttttccccga tcatagagga300gctccaactc tcttgaagaa aaggccccta gaagagccga agaaagtaga agagaagaag360gacaaaagta gaggacgtag aagatatcat tagaagtaaa ttaatatata attgttatta420taattgtgct tttttatagg gtcctttgaa gtaatgggcg agctctattg tacccaaaat480ctggggatga accaaattac acgtaaaacc tatacaactt ttaatttcta tttccaacca540aaaatgtcat atttgacggc aacacgttca agtcaccaca agaaagtctc ctagagtgta600atacaccttt agtattttaa taatataatg gccaataata aaagcctaat acctatcact660
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权利要求
1.一种分离的毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶启动子序列，其特征在于它包括(1)具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(2)与(1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或(3)与(1)或(2)的核苷酸序列具有基本序列同源性的核苷酸序列；或(4)是(1)、(2)或(3)的核苷酸序列的类似物的核苷酸序列；或(5)与(1)、(2)、(3)或(4)的核苷酸序列，在杂交条件下杂交的核苷酸序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒载体所构建的重组表达载体。
3.按照权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于它是pYEP356w3。
4.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自1)用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；2)用权利要求2所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。
5.按照权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是微生物宿主细胞的后代或蛋白质组成已经改变的微生物细胞。
6.按照权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是酿酒酵母。
7.一种在微生物细胞中表达权利要求书1所述的ω3-脂肪酸脱氢酶启动子的方法，其特征在于它的步骤包括1)将权利要求书3所述的重组载体导入微生物细胞；2)使所述的微生物细胞生长形成菌体细胞。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于所述的微生物是大肠杆菌或酿酒酵母。
9.权利要求书1所述的毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶启动子序列的分离方法，其特征在于它包括下述步骤1)提取毕赤酵母总DNA，将基因组用SalI单酶切；2)以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)Δ6-脂肪酸脱氢酶开放阅读框架双酶切(BamHI&SalI)所得片段(663bp-1090bp，SEQ ID NO2)作为接头。将酶切后基因组和接头按摩尔比1∶3的比例进行过夜连接；3)设计并合成如下三条引物引物1GAACTCCTCA GCGGTGTATG GAACAAAGAC引物2ATGACCTGTT GCCTTATGAT GC引物3GGCGATTGT GTTCTCGCTC4)以连接产物为模板，进行PCR反应反应组分加入量缓冲液(10×)(含20mmol/L MgCl2)5μldNTP(2.5mmol/L) 2μl引物1(1μmol/L) 2μl引物2(1μmol/L) 2μlTaq(5u/μl) 0.5μlH2O 36.5μl模板DNA(0.1μg/μl) 1μl总体积 50μl扩增条件94℃5min；94℃30s，56℃1min，72℃2min，共30个循环；72℃10min；5)以PCR产物100倍稀释作为模板，以引物1、3，作为引物，如上体系，如上条件进行PCR；6)回收PCR片段，亚克隆到测序载体；再转化到大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素，终浓度为50-100μg/ml的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法提取质粒，经NcoI和SacI双酶切鉴定和PCR扩增鉴定阳性克隆；7)对阳性克隆质粒进行测序，确证启动子片段。
10.权利要求1所述的毕赤酵母ω3-脂肪酸脱氢酶启动子序列用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品。
全文摘要
本发明涉及一种从毕赤酵母中分离到的ω3－脂肪酸脱氢酶启动子序列及其应用。本发明包括具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明包括利用该启动子序列来改变微生物细胞蛋白质成分的微生物基因工程方法，更具体的说，在这一启动子下游衔接异源或同源基因，并构建到微生物表达载体，转化宿主微生物，在其细胞中表达目的蛋白，实现品质改良或药用用途。本发明克隆毕赤酵母的ω3－脂肪酸脱氢酶基因启动子对今后所有转基因微生物的研究具有重大应用前景。
文档编号C12N1/19GK1966688SQ200610015658
公开日2007年5月23日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者李明春, 张昕欣, 魏东盛, 邢来君, 周皓 申请人:南开大学