专利名称：实时荧光定量rt－pcr技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测人前列腺癌微小转移的试剂盒，主要涉及从患者外周血中分离单个核细胞，提取总RNA，逆转录其中的mRNA得到cDNA，利用实时荧光定量RT-PCR技术，通过定量检测游离于外周血中前列腺细胞的前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)和前列腺特异膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)mRNA的表达量，达到检测前列腺癌微小转移的试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术：
恶性肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是恶性肿瘤致死的一个重要原因。因此早期诊断是正确选择临床治疗方案的关键。目前临床上常用的影像学方法，如经直肠B超、CT、MRI仅能探测到大于1cm的结节，不能准确查出包膜外扩散或淋巴结转移。
80年代末，国际上开始采用血清PSA(prostate specific antigen)水平的检测和直肠指诊作为前列腺癌早期普查和诊断的手段，以血清PSA值0-4.0ng/ml为正常值范围。血清PSA指标的应用使前列腺癌患者的检出率提高了2倍，对早期前列腺癌(A+B期)的检出率提高了一倍。但活组织检查揭示，在血清PSA值大于4ng/ml的男性中约有三分之一患有前列腺癌；而在确诊为前列腺癌的患者中有50％PSA值小于4ng/ml。另有报道指出，虽然血清PSA检测的灵敏度大于90％，但是其特异性只有25％。
研究资料证实，在临床分期为A期、B期患者的外科手术中发现已存在包膜外浸润的分别占11-32％和23-71％。另有报道指出，在施行前列腺切除手术的前列腺癌患者中真正为局限癌的往往仅占40-50％，这不但造成了将近60％的转移患者经受无益的手术痛苦和身体损伤，而且是造成术后复发率较高的主要原因。
由此可见，现有的分期手段包括血清PSA水平、Gleason分级、CT，经直肠B超、磁共振成像，骨扫描等可检查出已明显形成转移灶的肿瘤，所检出的患者多处于疾病的中晚期，但对微小转移患者却无能为力，以至临床上相当一部分患者被人为地诊断为低分期，使得临床医师施治不当。所以临床上迫切需要一种更灵敏的分期指标。因此，我们致力于开发恶性肿瘤转移早期检测及诊断技术，以解决临床治疗的难题。
血行转移是肿瘤扩散的主要途径之一，因此对患者外周血中肿瘤细胞特异性标记物基因表达的检测是了解肿瘤转移程度的一种有效方法。因此，对外周血中微量肿瘤细胞特异基因表达检测的研究，已经引起了人们的广泛关注。
随着分子生物学的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已被尝试用于临床。RT-PCR技术有着高灵敏度和高特异性的优势，为外周血中微量肿瘤细胞的检测提供了可能，但常规RT-PCR技术存在着无法准确定量以及假阳性等问题，在一定程度上阻碍了这一技术在临床检测中的推广应用。1996年发展起来的TaqMan探针荧光实时定量PCR技术，既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的缺点。同时它还有重复性好、省力、低费用等优点。
近几年已经有应用实时定量PCR技术检测前列腺癌微小转移的研究报道。2001年BerndS.等首次报道，利用实时荧光定量PCR技术检测前列腺患者外周血单个核细胞中PSAmRNA的表达，pT2期的前列腺癌患者(n＝19)阳性检出率为40％，高分级的PC患者(n＝28)阳性检出率为72％，BPH患者阳性检出率为8％，并且发现患者外周血单个核细胞中PSA的表达水平同前列腺癌的Gleason分级有着密切的关系，在pT2期患者外周血单个核细胞中检测到相当于1034个LNCaP(前列腺癌细胞系)细胞的PSA mRNA/mL，在高分期患者外周血单个核细胞中检测到相当于7830个LNCaP细胞的PSA mRNA/mL，在前列腺增生患者中只检测到相当于58个LNCaP细胞的PSA mRNA/mL，各组间有显著性差异(P＜0.001)；2003年，Gelmini等用TaqMan探针方法检测了43例前列腺癌患者和16例BPH患者的活检组织中PSAmRNA的表达情况，PSA在前列腺癌组织中表达明显升高；2003年，Schmittgen等采用TaqMan探针荧光实时定量RT-PCR的方法检测了前列腺组织中PSMA表达情况，发现PSMA在正常前列腺组织中要比癌变的前列腺组织表达量低，而且随着Gleason分级的升高而增加。这些研究结果表明，实时定量RT-PCR技术能够有效的检测前列腺癌的微小转移，但目前尚没有相关检测试剂盒面世，因此该试剂盒的研发对前列腺癌微小转移的检测具有重要的意义。
PSA和PSMA是前列腺组织特异性较高的相关抗原。因此检测患者外周血单个核细胞中有无PSA和PSMAmRNA的表达，可以对前列腺癌转移的诊断和预后提供有力依据。
发明内容
由于荧光实时定量RT-PCR技术具有灵敏和特异的特点，可以用于从外周血单个核细胞中检测带有组织特异性的肿瘤标记分子，从而检测肿瘤的微小转移。本发明公开了一种应用实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒的技术方案这种实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒，包含红细胞裂解液、RNA提取试剂、RT反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应液、Taq酶、标准品和对照品；其特点在于RNA提取试剂包括RNA萃取试剂、RNA洗涤液、UNIQ-10柱和DEPC-H2O，RT反应液包括DEPC-H2O、M-MLV RT缓冲液、随机引物N6和dNTPs，PCR反应液包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs，检测用上下游引物和荧光探针；检测用上游引物和下游引物PSA上游引物序列为5’-CAG TCT GCG GCG GTG TT-3’PSA下游引物序列为5’-GCA AGA TCA CGC TTT TGT TCC T-3’PSMA上游引物为5’-AAC TGG ACC CCA GGT CTG GA-3’
PSMA下游引物为5’-GAG GAT TTT ATA AAC CAC CCGAA-3’GAPDH上游引物为5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’GAPDH下游引物为5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’荧光探针序列PSA荧光探针序列为5’-FAM-CCC CAG TGG GTC CTC ACA GCT GC-TAMRA-3’PSMA荧光探针序列为5’-FAM-CTG CAG GGC TGA TAA GCG AGG CA-TAMRA-3’GAPDH荧光探针序列为5’-FAM-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-TAMRA-3’。
PSA标准品序列为pMD 18-T vector中插入下列片段CAGTCTGCGG CGGTGTTCTG GTGCACCCCC AGTGGGTCCT CACAGCTGCCCACTGCATCA GGAACAAAAG CGTGATCTTG C。
PSMA标准品序列为pMD 18-T vector中插入下列片段AACTGGACCC CAGGTCTGGA GCGAATTCCA GCCTGCAGGG CTGATAAGCGAGGCATTAGT GAGATTGAGA GAGACTTTAC CCCGCCGTGG TGGTTGGAGGGCGCGCAGTA GAGCAGCAGC ACAGGCGCGG GTCCCGGGAG GCCGGCTCTGCTCGCGCCGA GATGTGGAAT CTCCTTCACG AAACCGACTC GGCTGTGGCCACCGCGCGCC GCCCGCGCTG GCTGTGCGCT GGGGCGCTGG TGCTGGCGGGTGGCTTCTTT CTCCTCGGCT TCCTCTTCGG GTGGTTTATA AAATCCTC。
GAPDH标准品序列为pMD 18-T vector中插入下列片段GAAGGTGAAG GTCGGAGTCA ACGGATTTGG TCGTATTGGG CGCCTGGTCACCAGGGCTGC TTTTAACTCT GGTAAAGTGG ATATTGTTGC CATCAATGACCCCTTCATTG ACCTCAACTA CATGGTTTAC ATGTTCCAAT ATGATTCCACCCATGGCAAA TTCCATGGCA CCGTCAAGGC TGAGAACGGG AAGCTTGTCATCAATGGAAA TCCCATCACC ATCTTC。
对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无PSA和PSMAmRNA的总RNA样品，阳性对照为有PSA或PSMAmRNA的总RNA样品。
本试剂盒中红细胞裂解液和RNA翠取试剂和RNA洗涤液保存于2-8℃，其余试剂均保存于-10～-30℃，尽量避免反复冻融。
试剂盒的检测方法，它包括下列步骤(1)红细胞裂解法分离人外周血单个核细胞(2)Trizol试剂提取单个核细胞总RNA(3)用M-MLV反转录酶将单个核细胞RNA反转录为cDNA第一链(4)TaqMan探针法进行实时定量RT-PCR的检测。
本发明的有益效果本发明建立了利用TaqMan探针荧光实时定量RT-PCR技术通过检测人外周血单个核细胞中前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)mRNA的表达检测前列腺癌微小转移的方法，经检测患者标本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了RT-PCR扩增技术，使得PSA和PSMmRNA的检测敏感度大大提高，由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规RT-PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的标本中获得足够的信息。本方法所设计的引物、探针以及检测结果，可以为荧光实时定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。
图1A为荧光实时定量RT-PCR检测PSA标准品的荧光曲线1B为根据PSA标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图2A为荧光实时定量RT-PCR检测PSMA标准品的荧光曲线2B为根据PSMA标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图3A为荧光实时定量RT-PCR检测GAPDH标准品的荧光曲线3B为根据GAPDH标准品的荧光曲线图得到的标准曲线具体实施方式
下而结合附图和实施例对本发明的具体实施方式
作进一步说明本发明试剂盒使用方法单个核细胞的分离取4ml肝素抗凝的静脉血，加入8-12ml红细胞裂解液，室温振摇10min，500g离心10min，弃上清，细胞沉淀冻于-80℃。
RNA的提取每4ml静脉血分离的单个核细胞加入2ml Trizol试剂，振荡混匀，室温放置5min；每1ml Trizol试剂加入200μl氯仿，剧烈振荡20s，室温放置1min，然后10,000g，离心10min；每1ml RNA翠取试剂大约取450μl上层水相，与200μl无水乙醇混匀加到UNIQ-10柱中，10,000g，离心1min；加500μl RNA洗涤液，10,000g，离心30s；换一新的1.5m炮弹管，加500μl RNA洗涤液，10,000g，离心2min；换一新的无RNA酶的1.5m炮弹管，在UNIQ-10柱的膜中央小心加入40-80μl DEPC-H2O；静置1min，10,000g，离心1min；将洗脱的RNA溶液，放置于-80℃冰箱保存。
反转录取1μg的RNA，4μl RT缓冲液，1μl M-MLV反转录酶，1μl N6引物，1μl dNTPs，0.5μl RNA酶抑制剂，加DEPC-H2O至总体积为20μl。37℃水浴温育1小时。
荧光实时定量RT-PCR检测每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。PSA和PSMA标准品用无菌水稀释为1×103-1×107拷贝/μl，GAPDH标准品用无菌水稀释为1×104-1×108拷贝/μl。检测在荧光实时定量PCR仪上进行，总体积为25μl，其中22.85μl PCR反应液，2μl检测样品(逆转录产物、标准品、阳性对照和阴性对照)，0.15μl Taq DNA聚合酶。反应条件95℃预变性3min，然后45循环(95℃25s，60℃1min)，60℃延伸2min后置4℃。根据所获得的标准曲线，计算各待测标本中PSA、PSMA和GAPDH的模板数(拷贝数/μl)，然后用PSA或PSMA的模板数除以GAPDH的模板数，得到PSA或PSMA的相对表达量。
实施例1荧光实时定量RT-PCR检测人外周血单个核细胞PSA和PSMAmRNA的应用一.材料Trizol试剂，UNIQ-10柱，N6随机引物，dNTPs购自上海生物工程有限公司，pMD 18-Tvector克隆系统，Taq DNA聚合酶购自大连宝生物技术有限公司，M-MLV反转录酶购自美国Promega公司，2400型PCR仪购自Perkin Elmer公司，MJ Opticon 2荧光实时定量PCR仪购自美国MJ公司。
二.引物及探针的设计与合成以PSA、PSMA、GAPDH全长cDNA序列(GeneBank登录号分别为X05332，M99487，NM 002046)为模板，使用Primer ExpressTM(V1.0，美国Perkin Elmer公司)软件分析引物及TaqMan探针位点，并同时考虑该基因组DNA的序列情况，从中选择最佳组合。
PSA、PSMA和GAPDH的上游引物、下游引物由北京奥科生物技术有限公司合成，荧光探针由上海博亚生物技术有限公司合成。
三.检测标准品的制备培养PSA和PSMA阳性表达的前列腺癌细胞系LNCap，用Trizol试剂提取总RNA，取1μg RNA，在20μl反应体系中用N6随机引物对其进行反转录，分别用PSA、PSMA和GAPDH的上下游引物在PE 2400型PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃3min，30个循环(95℃25s，60℃1min)，最后在60℃延伸5min后置4℃。
PCR产物经电泳检测后插入pMD 18-T vector克隆载体中，并测序验证阳性克隆。对应的PSA、PSMA和GAPDH质粒即为标准品。测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。
四.标本检测9例静脉血样品(3例良性前列腺增生患者样品，3例前列腺局限癌患者样品，3例前列腺转移癌患者样品)，分离单个核细胞后用Trizol试剂提取细胞总RNA，取1μgRNA，在20μl反应体积中用N6随机引物对其进行反转录后，分别用PSA、PSMA和GAPDH的上下游引物在MJ Opticon 2 real-time PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃3min，45个循环(95℃25s，60℃1min)，最后在60℃延伸5min后置4℃。同时加标准品检测作标准曲线。测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的PSA、PSMA和GAPDH表达量。
五.结果(一)标准品的制备经测序，插入的PSA、PSMA和GAPDH序列完全与预期相符，其中插入片断的序列如下PSACAGTCTGCGG CGGTGTTCTG GTGCACCCCC AGTGGGTCCT CACAGCTGCCCACTGCATCA GGAACAAAAG CGTGATCTTGCPSMA
AACTGGACCC CAGGTCTGGA GCGAATTCCA GCCTGCAGGG CTGATAAGCGAGGCATTAGT GAGATTGAGA GAGACTTTAC CCCGCCGTGG TGGTTGGAGGGCGCGCAGTA GAGCAGCAGC ACAGGCGCGG GTCCCGGGAG GCCGGCTCTGCTCGCGCCGA GATGTGGAAT CTCCTTCACG AAACCGACTC GGCTGTGGCCACCGCGCGCC GCCCGCGCTG GCTGTGCGCT GGGGCGCTGG TGCTGGCGGGTGGCTTCTTT CTCCTCGGCT TCCTCTTCGG GTGGTTTATAAAATCCTCGAPDHGAAGGTGAAG GTCGGAGTCA ACGGATTTGG TCGTATTGGG CGCCTGGTCACCAGGGCTGC TTTTAACTCT GGTAAAGTGG ATATTGTTGC CATCAATGACCCCTTCATTG ACCTCAACTA CATGGTTTAC ATGTTCCAAT ATGATTCCACCCATGGCAAA TTCCATGGCA CCGTCAAGGC TGAGAACGGG AAGCTTGTCATCAATGGAAA TCCCATCACC ATCTTC(二)样品检测标准品检测结果见图1，2，3。
9例患者的静脉血样品检测如下GAPDH模板PSMA模板 PSMA/GAPDH(PSA模板 PSA/GAPDH(样品数 数 ‰)数‰)前列腺转移癌19348174715993388.2660924089594584.958907054前列腺转移癌160871829.2 167034410.383073339340685.806286934前列腺转移癌19348174715993388.2660924089594584.958907054前列腺局限癌164922534.4 48346 0.2931 48397.2 0.2935前列腺局限癌16182290.75 4205.6 0.2599 6090.60.3764前列腺局限癌17532344.67 10120 0.5772 707.5 0.0404良性前列腺增生 1260782007936 0.0629 1845.60.0146良性前列腺增生 120892678.5 2216.2 0.0183 3184.70.0263良性前列腺增生 149224454.5 3614 0.0242 6759.30.0453
在本发明的检测中，我们采用了TaqMan探针荧光实时定量RT-PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在荧光实时定量PCR检测技术出现之前，人们对模板的定量基本上要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上均属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响准确定量。荧光实时定量PCR技术的出现，使得人们可以真正的做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。
权利要求
1.一种实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒，包含红细胞裂解液、RNA提取试剂、RT反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、PCR反应液、Taq酶、标准品和对照品；其特征在于RNA提取试剂包括RNA萃取试剂、RNA洗涤液、UNIQ-10柱和DEPC-H2O，RT反应液包括DEPC-H2O、M-MLV RT缓冲液、随机引物N6和dNTPs，PCR反应液包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs，检测用上下游引物和荧光探针；检测用上游引物和下游引物PSA上游引物序列为5’-CAG TCT GCG GCG GTG TT-3’PSA下游引物序列为5’-GCA AGA TCA CGC TTT TGT TCC T-3’PSMA上游引物为5’-AAC TGG ACC CCA GGT CTG GA-3’PSMA下游引物为5’-GAG GAT TTT ATA AAC CAC CCG AA-3’GAPDH上游引物为5’-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3’GAPDH下游引物为5’-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3’荧光探针序列PSA荧光探针序列为5’-FAM-CCC CAG TGG GTC CTC ACA GCT GC-TAMRA-3’PSMA荧光探针序列为5’-FAM-CTG CAG GGC TGA TAA GCG AGG CA-TAMRA-3’GAPDH荧光探针序列为5’-FAM-CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC-TAMRA-3’。
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒，其特征在于PSA标准品序列为pMD 18-T vector中插入下列片段CAGTCTGCGG CGGTGTTCTG GTGCACCCCC AGTGGGTCCT CACAGCTGCCCACTGCATCA GGAACAAAAG CGTGATCTTG C。
3.根据权利要求1所述的实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒，其特征在于PSMA标准品序列为pMD 18-T vector中插入下列片段AACTGGACCC CAGGTCTGGA GCGAATTCCA GCCTGCAGGG CTGATAAGCGAGGCATTAGT GAGATTGAGA GAGACTTTAC CCCGCCGTGG TGGTTGGAGGGCGCGCAGTA GAGCAGCAGC ACAGGCGCGG GTCCCGGGAG GCCGGCTCTGCTCGCGCCGA GATGTGGAAT CTCCTTCACG AAACCGACTC GGCTGTGGCCACCGCGCGCC GCCCGCGCTG GCTGTGCGCT GGGGCGCTGG TGCTGGCGGGTGGCTTCTTT CTCCTCGGCT TCCTCTTCGG GTGGTTTATAAAATCCTC。
4.根据权利要求1所述的实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒，其特征在于GAPDH标准品序列为pMD 18-T vector中插入下列片段GAAGGTGAAG GTCGGAGTCA ACGGATTTGG TCGTATTGGG CGCCTGGTCA CCAGGGCTGCTTTTAACTCT GGTAAAGTGG ATATTGTTGC CATCAATGAC CCCTTCATTG ACCTCAACTACATGGTTTAC ATGTTCCAAT ATGATTCCAC CCATGGCAAA TTCCATGGCA CCGTCAAGGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTC。
5.根据权利要求1所述的实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒，其特征在于对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无PSA和PSMAmRNA的总RNA样品，阳性对照为有PSA或PSMAmRNA的总RNA样品。
6.根据权利要求1所述的实时荧光定量RT-PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒，其特征在于本试剂盒中红细胞裂解液和RNA翠取试剂和RNA洗涤液保存于2-8℃，其余试剂均保存于-10～-30℃，尽量避免反复冻融。
7.根据权利要求1所述的试剂盒的检测方法，其特征在于它包括下列步骤(1)红细胞裂解法分离人外周血单个核细胞(2)Trizol试剂提取单个核细胞总RNA(3)用M-MLV反转录酶将单个核细胞RNA反转录为cDNA第一链(4)TaqMan探针法进行实时定量RT-PCR的检测。
全文摘要
本发明涉及一种检测人前列腺癌微小转移的试剂盒，公开了一种应用实时荧光定量RT－PCR技术检测人前列腺癌微小转移试剂盒的技术方案，主要涵概下列步骤红细胞裂解法分离人外周血单个核细胞，Trizol试剂提取单个核细胞总RNA，用M－MLV反转录酶将单个核细胞RNA反转录为cDNA第一链，TaqMan探针法进行荧光实时定量RT－PCR的检测。本发明的有益效果本方法采用了Taqman探针荧光实时定量RT－PCR技术，大大提高了PSA和PSMAmRNA检测的灵敏度和特异性，有效克服了常规RT－PCR扩增出现假阳性结果的缺点，其灵敏度可以达到检测10
文档编号C12Q1/68GK1995969SQ200610015640
公开日2007年7月11日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者张琚, 石建党, 张立国, 杨睿, 符蓉, 杜小玲, 王克明, 徐勇, 强万明 申请人:南开大学