专利名称：一种实时荧光定量pcr实验内标的设计方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光定量PCR实验内标的设计方法。
背景技术：
目前对标本的靶DNA或基因的相对或绝对含量可通过实时荧光定量PCR进行检测，根据标 本中是否加入内标物，可分为外标法定量PCR和内标法定量PCR。由于外标法存在不同标本间 扩增效率的差异和标本提取(特别是RT-PCR)的微小变化都将导致扩增产物的巨大差异，为 了清除此种影响，国内外都推重采用内标法。在试剂中加入竞争性或非竞争性内标，可有效 监测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差，从而避免假阴性结果。
非竞争性内标在同一试管内，用两对引物，同步扩增来自同一DNA的一段耙序列和另一 段内标序列。通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列定量。以非竞争性内标定量的主要优 点是内标制备简单；复管测定可排除管间差异，并且在一定程度上，可排除样本间的差异。 缺点是内标和靶核酸的逆转录效率有可能不同，并且有可能即使针对的是相同的耙核酸， 逆转录效率也会有很大差异。因此，使用这种方法进行RNA的定量PCR测定极为困难；在扩增 过程中的指数期测定可对原始模板相对定量，但如果没有验证在一定的扩增周期内靶核酸和 内标有相同的扩增效率，则不能进行绝对定量。
"竞争性"内标构建一个与靶基因相同的扩增效率和引物结合位点仅探针结合位点不 同的内标，在同一反应管内，靶基因与内标物和引物竞争性结合，进行同步扩增。靶基因的 量可通过与产生相同产物的竞争物的量相比较而得到。由于竞争性PCR可排除管间和样本间的 差异，目前临床及实验室也有应用竞争性内标，主要是针对探针类实时荧光定量PCR，设计针 对内标基因的探针序列，与目的基因的探针序列共用一对引物，同步扩增靶序列和内标序列。 此类内标主要是用于绝对定量及含低拷贝数样本的定量。对于高浓度样本，由于竞争性作用， 内标的作用则无法体现。
发明内容
本发明的目的在于提供一种实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，应用于核酸的荧光定 量PCR，以有效监测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差，从而避免假阴性结果。
本发明之实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，包括以下步骤(1)针对要检测的目 的基因设计一套引物序列，选择对应的内标基因，其引物序列与目的基因相同；(2)设计目 的基因的探针，确定浓度，在其5'端标记一个荧光报告基团；(3)设计内标基因的两种探针， 一种探针针对内标基因，另一种探针则是针对目的基因的另一序列，在两种探针的5' 端分别标记一个相同的荧光报告基团；(4)提取纯化目的核酸，进行实时荧光定量PCR扩增。 所述目的基因包括各种DNA、 RNA。
所述引物序列包括上游引物(Forward primer)序列和下游引物(Reverse primer)序列。
所述内标基因可以是看家基因或合成基因等。此类基因具备与目的基因序列相同的引物 结合位点，相似的或相同大小、相似的碱基排列顺序。看家基因有如b-actin mRNA、 GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、e 2-微球蛋白mRNA和rRNA等。
所述目的基因的探针、内标基因的两种探针在5'端标记的荧光报告基团，可为6—羧基 荧光素(FAM)、四氯一6—羧基荧光素(TET)、 2， 7 — 二甲基一4， 5—二氯一6—羧基荧光素 (J0E)、六氯一6—甲基荧光素(HEX)等，目的基因的探针上荧光报告基团与内标基因不同， 内标基因的两种探针上的荧光报告基团相同。
所述实时荧光定量PCR是指探针类PCR，即利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产 物的增加。
所述实时荧光定量PCR包括绝对定量、相对定量、基因型分析、阳性和阴性实验等。 本发明的优点使用竞争性内标法，内标使用两种不同探针，在实时荧光定量PCR中内 标与目的基因同步扩增，且低浓度和高浓度的样本中，内标的扩增与目的基因的含量相关， 因此可有效监测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差，从而避免假阴性结果。
图l为本发明之引物、目的基因探针、内标基因探针的设计图； 图2为低浓度HBV-DNA样本目的基因及内标同步扩增图3 (a)(b)为高浓度HBV-DNA样本目的基因及内标同步扩增图；非竞争性内标。
图4 (a)(b)为高浓度HBV-DNA样本目的基因及内标同步扩增图，本发明之竞争性内标。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例l:血清中低浓度乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)的实时荧光定量PCR 检测实施例
参照图1， (1)应用美国基因数据库(Genbank)检索同源区段，在引物设计软件辅助下， 设计乙型肝炎两对引物，即上游引物Pl和下游引物P2，上游引物Pl序列为5， -GTG TCT GCG GCG TTT TAT C -3，，下游引物P2序列为5， - ACA AAC GGG CAA CAT ACC T-3'，选择合成基因为内标基因，其碱基序列为5， -ACGGGAGCGGTTGGTGGTGGAAATCGTGCGTGACATTAAGA -3，， 其引物序列与目的基因相同(同P1、P2); (2)设计目的基因探针，探针序列为5'FAM-CAT CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CTT-3，， 5，端标记FAM荧光报告基团，确定此探针浓度为15pM;
(3)设计内标基因的两种探针，针对内标基因的探针浓度为10pM， 5， HEX-CCACCAACCGCTCCCGTAATCTCTAG-3 ，；针对目的基因的探针浓度为5pM ， 5 ， HEX-AGTATGGTGAGGTGAACA-3';两种探针的5'端标记一个相同的荧光报告基团HEX， (4)将待测 血清(含乙肝脱氧核糖核酸HBV-DNA的目的基因，浓度低于500IU/ml )和0. 3ul 105IU/ml 的内标(含内标基因)加入100ul样本提取液中，内标与样本同步处理，经过核酸提取、纯 化步骤获得高纯度的核酸，荧光定量PCR仪(型号ABI7300，美国应用生物系统公司生产) 上进行绝对定量实验。
结果如图2中所示荧光信号强度较高的一组为目的基因的扩增曲线，相应的荧光信号 稍低的一组为内标基因的扩增曲线。如果内标和样品未扩增，则表示该管扩增无效。因此， 可有效防止待检目的基因出现假阴性结果。
实施例2:血清中高浓度冊V-DNA的实时荧光定量PCR检测实施例
目的基因、内标、引物探针的设计与实施例1中相同，将高浓度的血清样本(含HBV-DNA 目的基因，浓度高于500IU/ml，梯度稀释)和0.3ul 105IU/ml的内标(含内标基因)加入100ul 样本提取液中，针对目的基因、针对内标基因的探针(浓度分别为15pM、10pM)已加入50ul PCR 反应液中，内标与样本同步处理，经过核酸提取、纯化步骤获得高纯度的核酸，荧光定量PCR 仪(ABI7300，美国应用生物系统公司生产)上进行绝对定量实验。
同样的样本采用目前市场上所使用的非竞争性内标法进行对比实验即同样的样本经过 上述核酸提取纯化步骤，加入含非竞争性内标(两套引物， 一套引物针对目的基因， 一套引 物针对内标基因；两种探针， 一种针对目的基因， 一种针对内标基因)的PCR反应液，在同 一台荧光定量PCR仪上进行绝对定量实验。
附图3(a)为非竞争性内标的扩增结果，可以看出曲线较难看，且与目的基因没有一定的 对应性。
图4(a)为本发明的竞争性内标的扩增结果，曲线较好，且其CT与目的基因的浓度具有 一定相关性，目的基因浓度高则CT值靠前。
其他竞争性内标仅使用一种针对内标基因的探针，当含目的基因的样本浓度较高时，由 于竞争性作用，内标则无法扩增，因此无法对扩增情况进行实时监控。
权利要求
1、一种实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，其特征在于，包括以下步骤(1)针对要检测的目的基因设计一套引物序列，选择对应的内标基因，其引物序列与目的基因相同；(2)设计目的基因的探针，确定浓度，在其5’端标记一个荧光报告基团；(3)设计内标基因的两种探针，一种探针针对内标基因，另一种探针则是针对目的基因的另一序列，在两种探针的5’端分别标记一个相同的荧光报告基团；(4)提取纯化目的核酸，进行实时荧光定量PCR扩增。
2、 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，其特征在于，目的 基因为DNA或RNA。
3、 根据权利要求1或2所述的实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，其特征在于，所 述引物序列包括上游引物序列和下游引物序列。
4、 根据权利要求1或2所述的实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，其特征在于， 内标基因为看家基因或合成基因。
5、 根据权利要求1或2所述的实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，其特征在于，目 的基因的探针、内标基因的两种探针在5'端标记的荧光报告基团为6—羧基荧光素、四氯一 6—羧基荧光素、2, 7 — 二甲基一4， 5 — 二氯一6—羧基荧光素或六氯一6—甲基荧光素，目的 基因探针上的荧光报告基团与内标基因不同，内标基因两种探针上的荧光报告基团相同。
6、 根据权利要求3所述的实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，其特征在于，目的基 因的探针、内标基因的两种探针在5'端标记的荧光报告基团为6—羧基荧光素、四氯一6— 羧基荧光素、2， 7 — 二甲基一4， 5—二氯一6—羧基荧光素或六氯一6—甲基荧光素，目的基 因探针上的荧光报告基团与内标基因不同，内标基因两种探针上的荧光报告基团相同。
7、 根据权利要求1或2所述的实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，其特征在于， 实时荧光定量PCR是指探针类PCR，即利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。
8、 根据权利要求1或2所述的实时荧光定量PCR实验中内标的设计方法，其特征在于， 实时荧光定量PCR包括绝对定量、相对定量、基因型分析、阳性和阴性实验。
全文摘要
一种实时荧光定量PCR实验内标的设计方法，其包括以下步骤(1)针对要检测的目的基因设计一套引物序列，选择对应的内标基因，其引物序列与目的基因相同；(2)设计目的基因的探针，确定浓度，在其5’端标记一个荧光报告基团；(3)设计内标基因的两种探针，一种探针针对内标基因，另一种探针则是针对目的基因的另一序列，在两种探针的5’端分别标记一个相同的荧光报告基团；(4)提取纯化目的核酸，进行实时荧光定量PCR扩增。本发明可有效监测核酸提取、扩增及产物分析中出现的误差，从而避免假阴性结果。
文档编号C12Q1/68GK101475988SQ20091004260
公开日2009年7月8日 申请日期2009年2月3日 优先权日2009年2月3日
发明者戴立忠, 熊晓燕, 蔡鸣镝 申请人:戴立忠