专利名称：一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌y13及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物保护领域，尤其涉及一种防治油茶炭疽病的内生生防菌株，具体地说涉及一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13及应用。
背景技术：
油茶(Ca^eL ia oJ"/fera)是我国特有的食用油料树种，亦是世界四大木本油料树种之一，已有2000多年的利用和栽培历史。它适应性广，抗逆性强，适种于广大的红壤丘陵地区。主要生长在南方，以湖南、江西、广西为主，其中湖南省是国内最大的油茶产地和最大的茶油消费区。油茶全身都是宝，具有很高的经济价值。据统计，油茶面积在10万亩以上的县有130个，30万亩以上的县有56个，50万亩以上的县有19个。年产茶油1. 3 1.5亿公斤，是二亿多人口的主要食用油来源。目前全国有油茶林400万公顷，占全国木本食用油料面积的80%以上，常年产油15万吨。目前，油茶的病害种类繁多，其危害程度也愈发严重。每年因病害而造成的经济损失难以估计，其中油茶炭疽病是一种常见的油茶病害。
油茶炭疽病是由胶胞炭疽菌(Co/fetoWc/mw g/oms;wn'ozVfe)侵染引起的一种毁灭性病害，是我国油茶产区的主要病害之一，发生普遍，引起严重落果、落蕾、落叶、枝枯，甚至整株衰亡。病害落果率通常在20%左右，严重时40%以上。据浙江省的资料，由于油茶炭疽病，严重病区发病率高达80%，病树的平均存果率比无病树降低了63.3%。
当前对油茶炭疽病的防治主要通过种植抗性品种和化学防治来控制，但有害生物抗性问题日益严重，且化学农药残留造成严重的危害，如造成残毒、污染环境，对人体健康、生态环境造成了很大的威胁，不利于油茶产业生产的可持续发展。因此寻找一种经济、安全、有效的防治措施是当务之急。生物防治以其安全、高效及无污染等特点已经成为植物病害防治的重要途径，其中拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要优势在于1)种类和数量众多，在植物叶际、叶内大量存在；2)对病原菌的作用方式多种多样，包括竞争、拮抗、寄生、诱导植物抗性的产生等；3)繁殖速度快；4)许多细菌在植物的叶内或叶际定殖力强；5)细菌大多能够人工培养，易于操作，便于生产应用；6)有些细菌不仅能够防治病害而且可以增加作物产量。
从油茶植株内分离筛选获得对油茶炭疽病菌具有拮抗作用的生防菌株，对油茶炭疽病
3的防治具有重要的意义，但目前相关技术仍旧很薄弱甚至空白，至今20多年能有效防治油茶炭疽病病的拮抗细菌未见报道，也没有防治油茶炭疽病的生物农药的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13，枯草芽孢杆菌Y13是一种从油茶植株内分离筛选获得对油茶炭疽病菌具有拮抗作用的生防细菌菌株，对油茶炭疽病的防治具有重要意义。
本发明另一个目的是提供所述高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13在防治炭疽病灾害方面的应用。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13，所述的枯草芽孢杆菌Y13， 5a"7/M做6"加Y13 ，保藏号CCTCC NO.M 208264 。
所述枯草芽孢杆菌Y13具有以下生化特性其对油茶炭疽病病菌有拮抗作用；对油茶炭疽病病菌菌丝有抑制、致畸作用；对油茶炭疽病病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用。
所述的枯草芽孢杆菌Y13在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，圆形或近圆形，边缘较整齐，中央隆起，干燥折皱，不透明，不产生色素，菌落直径一般2 3mm，菌体杆状，革兰氏染色阳性，芽孢中生。
所述的枯草芽孢杆菌Y13用于制备对油茶炭疽病病菌有拮抗作用的生化制剂。
所述的枯草芽孢杆菌Y13用于制备对油茶炭疽病病菌菌丝有抑制、致畸作用的生化制剂。
所述的枯草芽孢杆菌Y13用于制备对油茶炭疽病病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用的生化制剂。
本发明提供枯草芽孢杆菌Y13新菌株，其展现出对油茶炭疽病病菌具有较强的拮抗活性。
本发明的新菌株分离自油茶叶。新菌株培养基为牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g， NaC15.0g，蒸馏水1000mL，琼脂10 20g， pH7.0 7.2。
本发明的枯草芽孢杆菌Y13显示出以下形态和生化特征在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，圆形或近圆形，边缘较整齐，中央隆起，干燥折皱，不透明，不产生色素，菌落直径一般2 3mm，菌体杆状，革兰氏染色阳性，芽孢中生。菌株的生化反应V.P、接触酶、葡萄糖发酵、需氧性测定呈阳性，甲基红反应阴性，其生长能水解淀粉、明胶。
本发明的有益效果是(1) 枯草芽孢杆菌Y13为植物内生菌，对油茶炭疽病菌抑制作用强，对多种病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗细菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，例如种类和数量众多，在植物叶际、叶内大量存在；对病原菌的作用方式多种多样，如对油茶炭疽病病菌有拮抗作用；对油茶炭疸病病菌菌丝有抑制、致畸作用；对油茶炭疽病病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用。繁殖速度快等优点，尤其是对油茶炭疽病的防治具有重要意义。
(2) 种菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。枯草芽孢杆菌(S"c/〃船wMfc) Y13
保藏日期2008年12月27日
保藏单位名称中国典型培养物保藏中心
保藏单位简称CCTCC保藏号CCTCC NO.M 20826
图1为Y13菌株对油茶炭疽病菌的平板对峙拮抗作用图2为10 X 40倍显微镜下观察到的枯草芽孢杆菌Y13对油茶炭疽病菌丝的致畸作用图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1
枯草芽孢杆菌Y13的分离
取普通油茶健康叶，采用常规法进行分离、纯化和保存。
油茶叶用水冲洗干净后，选取适量的健康组织，分别称量后，剪成5mmX5mm的组织块，在75%乙醇中浸泡lmin，然后在0.1%升汞溶液中浸泡40s 70s，再放入75%乙醇浸泡30s，取出后用无菌水冲洗4次。在无菌研钵内加入10ml的无菌水和少许灭过菌的石英砂研磨成匀浆，加盖静置30min，将匀浆10倍系列稀释后，用移液枪分别吸取O.lml至准备好的NA平板上，涂抹均匀后放入培养箱培养，48h后记录菌量，并根据菌落形态、颜色和大小选取，在平板上进行纯化保存，共分离5个批次。实施例2
枯草芽孢杆菌Y13的筛选
初筛采用对峙培养法。对内生菌拮抗病原真菌筛选。将打好直径为6mm的油茶炭疽病菌菌饼放于平板中央，然后用接菌环蘸取待测细菌的悬浮液等距离(距平板中央3cm)点接2 3种内生细菌，放于培养箱中25°C黑暗培养，4d后观察记录抑菌带的有无及大小，共重复3次。选出抑菌带宽度大于等于4mm的8个菌株进行复筛，依次为Y5、Y12、 Y13、 Y19、 Y21、 Y29、 Y31、 Y35进行复筛(见表l)。
表1内生细菌对油茶炭疽病菌的抑菌作用
抑菌带宽度L (mm)菌株编号
L<4Y2、Y3、 Y4、 Y6、 Y7、 Y8、 Y9、 Y10、 Yll、 Y14、 Y15、
Y16、Y17、 Y18、 Y20、 Y22、 Y23、 Y24、 Y25、 Y26、 Y27、
Y28、 Y30、 Y32、 Y33、 Y34、 Y36、 Y37、 Y38
4《L<7Y5、 Y21、 Y29、 Y31
7《L<10Y12、 Y19、、 Y35
10《LY13
复筛采用发酵法。将初步筛选出的8株菌分别在NA培养基上培养2d后，用接菌环移取一环置入装有150mlNB培养液的三角瓶中(250ml)，在28°C、 150rpm的摇床上振荡培养48h。培养液用0.22细菌过滤器过滤得到培养滤液，将滤液与约50°CPDA培养基按1:19混匀倒入培养皿，冷却后在平板中央放入d=6mm的炭疽菌菌饼，4d后测量病菌菌落直径，以无菌水为对照，Y13菌株发酵液的抑菌效果最明显，抑制率达到84.1%。见表2。
表2发酵液对油茶炭疽病菌的抑制作用
菌株菌落直径(mm)抑制率(％)
Y517.872.5
Y1216.275.1
Y1310.384.1
Y1915.476.3
Y2120.568.5
Y2919.869.6
Y3119.470.2
Y3512.980.2
CK65—
实施例3
枯草芽孢杆菌Y13对油茶炭疽病菌丝的抑制作用将直径为6mm的油茶炭疽病菌菌饼放于马铃薯蔗糖培养基PDA平板中央，然后等 距离3cm点接拮抗细菌Y13，三次重复，25 28'C培养，4天后测定抑菌带的直径。由图 1可见枯草芽孢杆菌Y13对油茶炭疽病菌抑菌作用强。 实施例4
枯草芽孢杆菌Y13对油茶炭疽病菌丝的致畸作用
将玻璃纸剪成5mraX25mm的长条状，12rC高压灭菌，用镊子将其铺放于菌株Y13和 病原菌之间。28t:恒温培养5 7天，带菌株Y13和病原菌菌丝之间出现明显的抑菌带后， 将玻璃纸小心取下，置于10X40倍显微镜下观察菌丝的形态变化，以不接菌株Y13的病 原菌为对照。观察到菌丝前期膨大突出，后期明显变细，分枝多而短，形态不均匀，见图 2，其中l:正常菌丝的病原菌菌丝(10X40); 2:前期菌丝膨大突出(10X40)。 实施例5
枯草芽孢杆菌Y13对油茶炭疸病菌丝分生孢子萌发的抑制作用
采用载玻片悬滴法。将油茶炭疽病病菌在PDA平板上(22t!)培养箱中培养10d后， 用移菌环挑取孢子堆转移到盛有灭菌水的试管中，振荡摇匀后配成孢子悬浮液(5X10S个 /ml)，备用。取100ul孢子悬浮液，同100lU发酵原液和被稀释10倍、100倍的发 酵液及lOOul发酵滤液分别混合，滴加到凹玻片上，以滴加无菌水为对照。每处理重复 3次，置于28'C培养箱中培养，48h以后镜检孢子萌发情况，计算孢子萌发率。由表3结 果可知，Y13的发酵原液对炭疽病菌分生孢子的萌发和芽管的生长都有着明显的抑制作 用，其中对孢子萌发的抑制率达到94.4%，发酵液被稀释后抑制效果逐渐降低。Y13发酵 滤液对孢子萌发的抑制效果也十分明显，使孢子萌发率降低了 88.7%,结果表明，菌株在 发酵培养过程中可能产生了对炭疽病菌有抑制作用的代谢产物。
表3 内生菌株培养液对炭疽病菌分生孢子萌发的影响
处理孢子萌发率(％)
稀释100倍的发酵液13.5
稀释10倍的发酵液9.8
发酵原液5.6
发酵液滤液11.3
CK100
权利要求
1、一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌Y13，Bacillus subtilis Y13，保藏号为CCTCC NO.M 208264。
2、 根据权利要求1所述的一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13，其特征在于， 所述枯草芽孢杆菌Y13具有以下生化特性其对油茶炭疽病病菌有拮抗作用；对油茶炭疽 病病菌菌丝有抑制、致畸作用；对油茶炭疽病病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用。
3、 根据权利要求1或2所述的一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13，其特征 在于，所述的枯草芽孢杆菌Y13在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落呈乳白色，圆形或近圆形， 边缘较整齐，中央隆起，干燥折皱，不透明，不产生色素，菌落直径一般2 3mm，菌体杆 状，革兰氏染色阳性，芽孢中生。
4、 权利要求1所述的高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13的应用，其特征在于， 所述的枯草芽孢杆菌Y13用于制备对油茶炭疽病病菌有拮抗作用的生化制剂。
5、 权利要求1所述的高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13的应用，其特征在于， 所述的枯草芽孢杆菌Y13用于制备对油茶炭疽病病菌菌丝有抑制、致畸作用的生化制剂。
6、 权利要求1所述的高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13的应用，其特征在于， 所述的枯草芽孢杆菌Y13用于制备对油茶炭疽病病菌菌丝分生孢子萌发有抑制作用的生化 制剂。
全文摘要
本发明公开了一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13，Bacillus subtilis Y13，保藏号CCTCC NO.M 208264，属植物保护技术领域。同时公开了其分离方法以及应用，所述枯草芽孢杆菌Y13菌株经平板对峙试验筛选所得，能够有效抑制油茶炭疽病菌的生长，防效高，环境安全性好，具有良好的开发应用前景。
文档编号C12N1/20GK101475922SQ20091004246
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月9日 优先权日2009年1月9日
发明者刘君昂, 卢丽俐, 周国英, 宋光桃, 河 李, 琳 李, 靳爱仙 申请人:中南林业科技大学