防治核桃炭疽病的生防菌株及其筛选方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于防治核桃炭疽病的生防菌株技术领域，具体涉及一种防治核桃炭疽病 的真菌生防菌株及其筛选方法与应用。
【背景技术】
[0002] 近些年随着云南省政府大力发展核桃种植，各地依托当地优势资源积极发展核桃 产业。该省的核桃生产在全国核桃生产中占有非常重要的地位，其核桃的栽培面积和产量 约占全国的1/3,作为云南省重要的木本油料植物，核桃在改善当地人们生活水平，提高社 会效益方面发挥着重要作用。大理州漾濞彝族自治县作为云南省五个"全国经济林核桃之 乡"之一，其种植核桃具有较为悠久的历史，核桃产量、品质均居云南省首位。然而，核桃炭 疽病作为近几年来核桃上的重要真菌病害，严重危害着当地核桃产业的健康、有序、快速发 展。据近些年对漾濞核桃产区核桃炭疽病的病害调查结果，严重年份该病发生率高达90% 以上，对当地核桃的生产造成较为严重的经济损失。
[0003] 限于生产上对于该病害的防治措施主要依赖于化学药剂，而病原菌抗药性逐年显 现，急需开发适合生产的优良药剂。目前，学术界对于化学药剂的替代品生防菌的研究逐年 增加，对生防菌的筛选工作多集中于对农作物、蔬菜等方面的报道上。就核桃炭疽病的生防 菌筛选而言，王清海，牛赡光，刘幸红，等.核桃炭疽病高效生防菌株鉴定及抑菌活性[J].山 东农业大学学报（自然科学版），2011，（3) :335-337报道了研究发现短芽孢杆菌PF-2对该菌 的抑菌率最高，为88.47%，还有三株均属于芽孢杆菌属的细菌也对核桃炭疽病菌具有83% 以上的抑菌率，尽管如此，对于可作为核桃炭疽病的生防真菌的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 为解决现有核桃炭疽病防治主要依赖化学药剂的问题，本发明提出一种防治核桃 炭疽病的生防菌株，该生防菌株为真菌，其对核桃炭疽病菌均有80 %以上的抑菌活性，并且 稳定性好。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0006] 一种防治核桃炭疽病的生防菌株，为钩状木霉(Trichoderma hamatum)YB-4_15， 保藏单位：中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，简称:CGMCC，保藏日期:2015-12-07,保藏号：CGMCC No. 11809。
[0007] 进一步，所述生防菌株菌丝对光照条件不敏感，孢子产生需要光照条件。
[0008] 进一步，所述生防菌株菌丝生长的适宜温度为12-28°c，适宜pH值为4-8。
[0009] 进一步，所述生防菌株生长的培养基为PDA培养基。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种防治核桃炭疽病的生防菌株的筛选方法，包括以 下步骤：
[0011] 1) 土壤微生物分离及指示菌株
[0012] 选择大理州漾擤县光明村发病不同的核桃植株根际土壤，|产去表土层，取l〇-15cm 处土样，采用土壤稀释平板法进行分离，28°C的恒温培养箱培养2-3d(天)后，纯化长出的菌 株，再将纯化菌株放入4°C冰箱保存备用；指示菌株为胶孢炭疽菌（Col letotrichum gloeosporioides)；
[0013] 2)生防菌株筛选
[0014] 初筛:将步骤1)的土壤纯化菌株以及指示菌株接种于PDA平板进行活化，采用平板 对峙培养法进行筛选，即将一块直径为6mm的指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距 离的圆周上等距离接4块直径为6mm 土壤纯化菌株，记录指示菌株直径，筛选出效果较好的 菌株得到初筛菌株；
[0015] 复筛：一块指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距离的圆周上等距离接2块 初筛菌株，筛选出对指示菌株抑制作用效果明显、稳定的生防菌株。
[0016] 本发明的再一个目的是提供一种防治核桃炭疽病的生防菌株在制备防治核桃炭 疽病菌剂方面的应用，将生防菌株接种于含牛肉浸膏的马铃薯葡萄糖液体培养基中进行发 酵，将发酵液进行离心，上清液用细菌过滤器过滤，即得无菌滤液菌剂。
[0017] 进一步，所述牛肉浸膏的含量的质量百分数为0.5%。
[0018] 进一步，所述发酵温度为28°c，所述液体培养基的pH值为7。
[0019] 进一步，所述无菌滤液菌剂抑菌处理温度为12_45°C。
[0020] 进一步，所述无菌滤液菌剂抑菌处理温度为28-30 °C。
[0021]本发明的有益效果：
[0022]本发明通过对核桃植株根际土壤进行微生物分离和病原菌对峙培养，分离纯化得 到能够防止核桃炭疽病的生防菌株，该菌株能够对核桃炭疽病菌均有80%以上的抑菌活 性，同时促进核桃植株的生长。
[0023] 本发明的生防菌剂属生物制剂，不会对环境和生态造成污染，其有利于核桃的无 公害生产。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图。
[0025] 图1为本发明实施例2中生防菌株初筛与复筛结果示意图；
[0026] 图2为本发明实施例3生防菌株的菌落形态图；
[0027] 图3为本发明实施例3生防菌株的孢子图；
[0028] 图4为本发明实施例3生防菌株的产孢瓶体图；
[0029] 图5为本发明实施例4生防菌株分子鉴定结果图；
[0030] 图6为本发明实施例5不同光照条件对生防菌株的菌丝生长影响的结果图；
[0031 ]图7为本发明实施例5不同温度条件对生防菌株的菌丝生长影响的结果图；
[0032] 图8为本发明实施例5生防菌株在不同培养基的生长情况的结果图；
[0033] 图9为本发明实施例5不同pH值对生防菌株的菌丝生长影响的结果图；
[0034] 图10为本发明实施例7不同浓度的无菌滤液菌剂抑菌效果图；
[0035] 图11为本发明实施例8不同温度不同时间处理无菌滤液菌剂的抑菌效果。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1
[0037] 土壤微生物分离及指示菌株
[0038]选择大理州漾擤县光明村发病不同的核桃植株根际土壤，|产去表土层，取10-15cm 处土样，采用土壤稀释平板法进行分离，平板为PDA平板，28 °C的恒温培养箱培养2-3d后，每 处理重复4次，编号，纯化生长的菌株，再将纯化菌株放入4°C冰箱保存备用；
[0039] 指示菌株为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides)，本实施例中选用西 南林业大学植物病理学实验室保存的核桃炭疽病菌菌株yb-Ι，该菌株已经在《经济林研究》 2015年9月第33卷第3期的文献中报道过，作者为韩长志与霍超，题目名称为"核桃炭疽病生 防菌yb33的鉴定及其次生代谢物特性分析"。该实验室已经承诺自该专利申请日起20年内 向公众发放该生物材料。
[0040] 该PDA培养基的制作参见中国农业出版社1998年出版的方中达著作的植病研究方 法。
[0041 ] 实施例2
[0042]初筛:将实施例1获得的土壤纯化菌株以及指示菌株接种于PDA平板进行活化，采 用平板对峙培养法进行筛选，每处理重复3次，均置于28°C恒温培养箱进行培养，待对照菌 的菌丝长满培养皿时，采用十字交叉法测量菌落生长直径，观察并记录结果；
[0043]即将一块指示菌株置于roA平板中央，在距中央一定距离的圆周上等距离接4块土 壤纯化菌株，记录指示菌株大小，筛选出抑制效果较好的菌株得到初筛菌株;初筛结果显 示，共有35个菌株的抑菌率在70%以上。
[0044]复筛:一块指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距离的圆周上等距离接2块 初筛菌株，筛选出对病原菌作用效果明显、稳定的生防菌株。经过复筛发现其中的24个菌株 抑菌率为80%以上。
[0045]两次筛选共获得3株抑菌效果均在80%以上的菌株，其编号分别为YB-4-15、YB-8-11-1和YB-7-9-1，上述菌株中，尤以YB-4-15抑菌作用稳定、效果明显参见图1与表1。图1中A 表示初筛结果，图1中B表示复筛结果。
[0046] 表1经初筛与复筛获得的土壤拮抗菌株
[0047]
[0048] 实施例3
[0049]将生防菌株YB-4-15进行形态学鉴定
[0050]将生防菌株YB-4-15接种在PDA平板上培养，观察并记载菌落特征，培养7d后，挑取 菌丝菌落制备玻片，显微镜下观察菌株的微观形态，并测定其孢子大小，并根据魏景超编 著、中国农业出版社1979出版的真菌鉴定手册进行鉴定。鉴定结果如下：
[0051 ] PDA培养基上，YB-4-15形成白色菌落，其背面也为白色，无色素，老化后培养基平 板颜色变为淡黄色，有香气(见图2);显微观察，发现其具有生长稠密的分生孢子堆，可形成 白色疱突，后期分生孢子堆变为淡绿色，后绿色加深，分生孢子梗2.0-3.5μπι，产孢瓶体对 生、轮生或稀疏、不规则着生与孢子梗上，常2-4轮生，少数单生。瓶体一般为烧瓶形，顶端细 长，基部收缩，瓶体直，长(5.0-)6.5-10.0(-12.0)μπι，瓶体中间膨大处2.5-3.5μπι，长宽比为 2.0-4.0(-5.5)，基部宽为1.5-2.5μπι ;分生孢子绿色，细椭球形，大小为3.0-5.5 X 2.5-3.5μ m，长宽比为1.1-1.8,壁光滑(见图3与图4)。通过上述形态学观察，根据真菌鉴定手册，初步 将该菌鉴定为康氏木霉(Trichoderma koningii 0ud)〇
[0052] 实施例4
[0053] 生防菌株YB-4-15ITS序列测定
[0054] 1)ΥΒ-4-15 基因组 DNA 制备
[0055] 将纯化的菌丝块（1 cm X 1 cm)于新鲜的PDA液体培养基中黑暗、28 °C恒温培养箱培 养3d，采用CTAB法提取该菌株的基因组DNA。
[0056] 2)rDNA-ITS区PCR扩增与序列测定
[0057] 采用真菌核糖体rDNA区通用引物扩增ITS1-5.8S rDNA-ITS2片断PCR，测序获得了 生防菌株YB-4-15的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列，见序列表SEQ ID N0:3。扩增引物序列为：
[0058] ITS1:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，见SEQ ID NO: 1 所示；
[0059] itsls'-tcctccgcttattga