专利名称：一株防治烟草炭疽病的枯草芽孢杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株防治烟草炭疽病的枯草芽孢杆菌，属于微生物领域。
背景技术：
烟草炭疽病是烟草主要病害之一，在烟草各生育期都可以发生，以苗期为害最重。 我国各产烟区均有发生，塑料大棚育苗管理不善，消毒不彻底、温湿度不协高，往往在3-4 天之内就会发病，造成烟苗生长缓慢甚至大量死亡，造成苗源缺乏，影响后期的烟叶生产。该病害目前的防治方法主要以化学农药为主，但长期使用化学农药，易使病菌产生抗药性，危害更加猖獗；同时也会造成烟叶农药残留的增加和污染环境等问题，因此与环境相容的生物农药研制与开发应用，是缓解和改变化学农药所导致“三R” (Residue, Resistance, Resurgence)问题的有利措施，是促进烟草行业可持续健康发展的重要手段。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一株无公害且对烟草炭疽病具有显著防效的枯草芽孢杆菌。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种防治烟草炭疽病的菌剂。本发明要解决的第三个技术问题是提供一种防治烟草炭疽病菌剂的制备方法。本发明要解决的第四个技术问题是提供一种防治烟草炭疽病的枯草芽孢杆菌及其菌剂的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案
本发明提供一株枯草芽孢杆菌UaciBm仰力iih、)，命名为MKT-Ol，经鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种UaciBm subtilis subsp. ·5油iih、)，是从烟草根际分离得到，已于 2011年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJ* 址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为 CGMCC No. 5082。本发明还提供一种由保藏编号为CGMCC No. 5082的枯草芽孢杆菌(Macillus 仰况Hil5) MKT-Ol制备的菌剂。该菌剂的优选使用浓度为18.0X108cfu/mL。该菌剂可以通过现有技术中的制备方法来制备，还可以根据需要，添加可接受的辅料，制成各种类型的菌剂。为了更加详细地说明本发明所述菌剂的制备，本发明提供了一种所述枯草芽孢杆菌菌剂的优选的制备方法，该方法包括以下步骤
(1)菌种活化将保藏号为CGMCCNo. 5082的枯草芽孢杆菌UaciB^s subtilis) MKT-Ol接种于斜面培养基上，于条件下培养2 3天；
(2)种子培养从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中，于^TC条件下培养If 24小时，制得种子液；
(3)发酵培养按4 5%的接菌量，将所述种子液接入发酵培养基中，于^TC条件下培养2 3天，即得所述的枯草芽孢杆菌的菌剂。上述方法中涉及的各种培养基均可以是现有技术中适于枯草芽孢杆菌生长的培养基。本发明也提供一种优选的培养基配方，即
所述斜面培养基组分及配比为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10 g，琼脂20 g，加水定容至1000 mL, pH为7. 0 7. 5，121 °C下高温蒸汽灭菌30 min。所述种子培养基和发酵培养基组分及配比为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10 g，加水定容至1000 mL, pH为7. 0 7· 5，121 °C下高温蒸汽灭菌30 min。本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌MKT-Ol或所述菌剂在制备防治烟草炭疽病药物中的应用。本发明的优点是
经过试验证明，本发明所述的枯草芽孢杆菌MKT-Ol对烟草炭疽病的防治效果高达 79. 22%，显著高于目前防治烟草炭疽病的当家生物农药多抗霉素，与化学农药代森锰锌杀菌剂的防治效果持平，因此MKT-Ol的推广应用有望代替化学农药防治烟草炭疽病，保护了环境、降低了农残，提高了烟叶安全性，具有良好的生物农药开发前景。
图1为本发明菌株MKT-Ol的电镜照片，杆状，周生鞭毛； 图2本发明菌株MKT-01对烟草炭疽病的室内抑菌照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。实施例1枯草芽孢杆菌MKT-Ol获得与鉴定一、枯草芽孢杆菌MKT-Ol获得与鉴定
本发明所述的枯草芽孢杆菌MKT-01，2011年6月在黑龙江省牡丹江市宁安县范家乡烟田烟株根际取土样2g在平面培养基中进行培养4d，稀释后在平面培养基中进行涂布，再培养4d后挑取单菌落在平面培养基中划线，纯化后斜面培养保存。本菌为革兰氏阳性菌，菌落圆形或不规则形，表面粗糙不透明，污白色，LB液体培养基培养表面形成污白色皱醭。单个细胞大小0.7 0.8 um X 2 3 um，周生鞭毛，可游动，芽孢0.6 0.9 umXl.O 1.5 um，椭圆到柱状，在pH值低于5. 5及大于8. 0的条件下细菌几乎不能生长，最适PH值为7。最佳培养基成份蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g， 琼脂20g，最适生长温度。本发明所述的枯草芽孢杆菌MKT-01其16S rDNA序列如序列表SEQ ID No:l所不。二、枯草芽孢杆菌MKT-01的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株MKT-01为枯草芽孢杆菌枯草亚种(feciBm subtilis subsp. subtilis),已于2011年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC No. 5082。
实施例2枯草芽孢杆菌MKT-Ol的培养
(1)斜面培养培养时间2天，培养温度28 V，培养基成分(1000 mL):蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10 g，琼脂20 g，pH为7. 0，121 ！下高温蒸汽灭菌30 min。(2)种子培养超净工作台中从斜面挑取经活化的单菌落接入种子培养基中，28°C 摇菌M个小时，转速llOrpm，得到种子液。种子培养基成分(1000 mL):蛋白胨10g，酵母粉 5g，氯化钠10 g，pH为7. 0，121 °C下高温蒸汽灭菌30 min。(3)发酵按5%的接种量，将上述获得的种子液接入发酵培养基中，28°C振荡培养 2天(48小时)，转速llOrpm，得到枯草芽孢杆菌发酵液，即本发明所述的菌剂。发酵培养基配方同种子培养基。实施例3枯草芽孢杆菌MKT-Ol对烟草炭疽病的室内抑菌试验 1供试材料
1.1供试培养基
LB液体培养基蛋白胨10.0 g，酵母粉5g，NaCL 10 g，加水定容至1000 mL，pH为7.0， 121 ！下高温蒸汽灭菌30 min。用于培养待测细菌发酵液。PDA固体培养基将200 g新鲜马铃薯洗净去皮后切碎，加蒸馏水1000 mL，煮沸30 min，用8层纱布过滤去马铃薯，滤液用蒸馏水补足1000 mL，然后加20.0 g葡萄糖，15.0 g 琼脂粉，分装，121 ！下高温蒸汽灭菌30 min。用于细菌纯菌株保存。1. 2供试药品
琼脂粉，葡萄糖，蛋白胨，酵母粉，NaCL等。1. 3仪器设备
灭菌锅，光照培养箱，全温振荡器，1/1000 g电子天平，PH计等。2试验方法
2.1烟草炭疽病菌的分离、纯化、致病力测定及保存
将病斑剪下，用70%的乙醇表面消毒30iT60S，灭菌水漂洗3、次，用灭过菌的剪刀或解剖刀将病斑剪成约0. 5-lcm见方病健交界的小块，放至PDA平板培养基中培养M-4 !，分离到的菌株进行2 3次纯化，取10叶期的烟草植株，喷雾接种病原菌后用薄膜保湿M h，温度控制在观 32 °C，相对湿度保持在86%以上。4 d后观察，根据烟叶发病情况，挑选出致病力强的菌株，再次分离纯化并保存备用。2. 2平板对峙法测定枯草芽孢杆菌MKT-Ol对烟草炭疽病菌抑菌效果
挑取纯培养的待测细菌培养物放入装有50 mL灭菌LB液体培养基的250 mL三角瓶中， 将三角瓶放置到恒温振荡培养箱中观！下震荡培养培养48 h，并用无菌水配制成浓度为 3X IO8 cfu/mL的菌悬液备用。取Iml菌悬液在PDA平板中间划线，然后将两侧分别接种纯化过的炭疽病菌块，4纩72 h后观察抑菌效果，稳定后测量抑菌带宽度及受MKT-Ol抑制后病菌接种点菌丝扩展直径的差异。3试验结果
试验(见图2)结果得到抑菌效果稳定后其抑菌带宽度a为10. 1mm，病菌菌丝扩展受到强烈抑制，扩展半径减少观mm(如图2:正常菌丝扩展宽度c -对峙一侧菌丝扩展宽度b)。 两结果都充分说明枯草芽孢杆菌MKT-Ol对烟草炭疽病菌有较强的抑菌作用。
实施例4枯草芽孢杆菌MKT-Ol (CGMCC No. 5082)对烟草炭疽病拮抗试验
接种炭疽病菌液的制配取已培养炭疽病病原菌的培养基IOg(牡丹江烟草科学研究所纯化保存)，切碎放入500 mL灭菌水中，接种前30 min配制待用。接种生防菌枯草芽孢杆菌MKT-Ol发酵液的制配挑取少许枯草芽孢杆菌MKT-Ol 放入装有500 mL种子培养基的三角瓶中，将三角瓶放置到恒温振荡培养箱中观V震荡培养48 h，接种前30 min配制成浓度为3 X IO8 cfu/mL的菌悬液备用。试验设计设三个处理，一个空白对照，三次重复，12个小区，每小区100株烟。处理A 生物农药多抗霉素，稀释1000倍喷雾处理B:化学农药代森锰锌杀菌剂，稀释800倍喷雾
处理C:枯草芽孢杆菌MKT-Ol发酵液(浓度约18. OX IO8 cfu/mL)； 处理D:培养液喷雾处理E:清水喷雾
试验方法先采用喷雾法实施A、B、C、D、E四个处理，间隔M h，连续实施二次后，再间隔M h喷雾法接种炭疽病菌液。调查方法接种7d后调查各小区的病叶率。试验结果见表1
表1.枯草芽孢杆菌MKT-Ol对炭疽病防治效果(6月12日宁安范家乡)
权利要求
1.一株枯草芽孢杆菌(^aciWw1S 力(Ui1S)MKT-01，其保藏编号为CGMCC No. 5082。
2.一种由保藏编号为CGMCC No. 5082的枯草芽孢杆菌(feci/^As subtil is) MKl-Ql 制备的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的使用浓度为18.OX IO8Cfu/mLo
4.一种枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)菌种活化将保藏编号为CGMCCNo. 5082的枯草芽孢杆菌UaciBm subtil is) 接种于斜面培养基上，于26°C 条件下培养2 3天；(2)种子培养从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中，于^TC条件下培养If 24小时，制得种子液；(3)发酵培养按Γ5%的接菌量，将所述种子液接入发酵培养基中，于^TC条件下培养2 3天，即得所述的枯草芽孢杆菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基组分及配比为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10 g，琼脂20 g，加水定容至1000 mL, pH为7. 0 7· 5 ；所述种子培养基和发酵培养基组分及配比为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10 g，加水定容至1000 mL, pH 为 7. 0 7. 5。
6.权利要求1所述枯草芽孢杆菌MKT-Ol或权利要求2所述菌剂在制备防治烟草炭疽病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株防治烟草炭疽病的枯草芽孢杆菌。该枯草芽孢杆菌MKT-01为一株生防菌，其保藏编号为CGMCCNo.5082。本发明还提供了由该枯草芽孢杆菌MKT-01制备的菌剂及其制备方法。本发明所述的枯草芽孢杆菌MKT-01及其菌剂对烟草炭疽病有显著的抑制作用，防治效果可高达79.22%，具有良好的生物农药开发前景。
文档编号C12R1/125GK102367429SQ20111032599
公开日2012年3月7日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者元野, 孙剑萍, 孙宏伟, 王春艳, 虞艳芳, 贺国强, 郭兆奎 申请人:中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所