专利名称：Bcl2基因3-utr双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法，该质粒用于检测hsa-mir-1915对BCL2基因的调控作用，便于对细胞内microRNA调控的检测，本发明尤其可应用于肿瘤的识别及miCToRNA类抗肿瘤机制的研究。
背景技术：
据世界卫生组织(WHO)的《世界癌症报告》报道，截止到2020年，全球癌症发病率将增加50%。目前，每年新增癌症患者1000万人，与1990年相比，全球癌症患者的发病率增长了 19%，死亡率增长了 18%。现有技术公开了 BCL2致癌基因家族对细胞凋亡的调控失调一直是肿瘤发生过程中的重要途径。BCL2是抑制细胞凋亡基因的BCL2家族中的重要一员，在调节线粒体途径的凋亡过程中发挥了至关重要的作用。目前临床实践中主要是通 过拮抗Bcl-2家族抗凋亡蛋白或降低其水平来达到促进肿瘤细胞凋亡的目的，如采用反义寡核苷酸治疗等。MicroRNA (miRNA)是近年研究发现的一类非编码小RNA分子，是由机体内源基因转录出长约70nt的发夹结构前体，然后被Dicer酶切割后产生的长度约22nt非编码单链核苷酸片段。microRNA通过降解mRNA或抑制蛋白翻译的方式调节特异基因的表达，参与调控了生物体生长和发育等多种复杂的生命过程。miRNA在进化上高度保守，许多miRNA在相差甚远的物种之间也有较高的同源性。最近的研究表明，超过50%的miRNA基因位于肿瘤相关的基因区域，这提示了 miRNA与肿瘤的发生和发展密切相关。而microRNA行使功能主要是与RISC结合，通过不完全或完全的匹配方式，识别、结合靶基因的3-UTR，在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而进一步调控多种生物学行为，如发育进程、干细胞分化、细胞凋亡、疾病、以及肿瘤发生。近期有关研究人员，通过研究HiiCT0RNA在细胞凋亡通路里的功能试图发现hsa-mir-1915对BCL2的抑制作用等，为细胞内microRNA检测提供一个新的研究方法，进而应用于microRNA的抗肿瘤研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法。本发明的进一步目的是提供上述BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒的用途。本发明通过分子克隆的方法构建构BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒，用来检测细胞内hsa-mir-1915的表达,进而应用于microRNA类抗肿瘤机制的研究。本发明中，通过生物芯片技术研究HiiCT0RNA在细胞凋亡通路里的功能发现hsa-mir-1915对BCL2有抑制作用，其中，主要是通过BCL2的3-UTR区的结合，来调节BCL2蛋白的表达，进一步调节细胞凋亡的进程，从而可以起到抑制肿瘤的作用；所述的hsa-mir-1915可以通过与BCL2的3-UTR区结合，影响BCL2的3-UTR表达。具体而言，本发明的BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒，通过下述技术方案施现根据生物信息学数据库miRDB(http://mirdb. org/miRDB/)预测 hsa-mir-1915 与BCL2结合的靶位点，将其中的包含人BCL2基因的3-UTR区的序列(序列I)扩增，插入双荧光素酶报告基因质粒pGL3-pr0m0ter的Xba I位点，构建BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒。所述的BCL2基因3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒构建流程如图1所示。本发明的通过构建BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒的方法可以检测细胞内hsa-mir-1915的表达,从而标示细胞内特异的microRNA表达水平,为细胞内microRNA检测提供新的研究方法；所构建的BCL2基因的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒可用于检测细胞内hsa-mir-1915对BCL2基因的调控作用；进一步用于microRNA的抗肿瘤研究中。
图1是本发明BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒构建流程图。
图2显示了 本发明BCL2基因3-UTR区域的序列。
具体实施例方式实施例1I)生物信息学数据库 miRDB(http://mirdb. org/miRDB/)查询 hsa-mir-1915 与BCL2结合的靶位点，在BCL2的3-UTR区域(如图2所示)。2)根据序列信息(NCIB1:NM 000633),采用primer 5软件设计BCL2的3-UTR区引物序列，并加入酶切位点Xba I的序列。以人基因组总DNA序列为模板，扩增大小2270bp。循环条件95°C for 30s, 59. 1°C for 30s, 72°C forl20s，共 35 个循环，最后 72°C延长 lOmin。Sense GCTCTAGA TTGGAAATCCGACCACTAAntisense GCTCTAGA TGGCAGGATAGCAGCAC
权利要求
1.一种凋亡抑制基因BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒，其特征是，通过下述方法构建 根据生物信息学数据库miRDB预测hsa-mir-1915与BCL2结合的靶位点，将其中的包含人BCL2基因的3-UTR区的序列扩增，插入双荧光素酶报告基因质粒pGL3-pr0m0ter的Xba I位点，构建BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒；所述的BCL2基因的3-UTR区具有序列I的结构。
2.权利要求1的凋亡抑制基因BCL2的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒的制备方法，其特征在于，其包括步骤 1)生物信息学数据库miRDB查询hsa-mir-1915与BCL2结合的靶位点，获得BCL2的3-UTR区域； 2)根据序列信息(NCIB1:NM 000633),采用primer 5软件设计BCL2的3-UTR区引物序列，并加入酶切位点Xba I的序列；以人基因组总DNA序列为模板，扩增大小2270bp ； 3)用3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒对BCL2-3-UTR片段回收； 4)选用XbaI限制性内切酶酶切步骤3的BCL2-3-UTR片段， 其中，酶切体系
3.按权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤2)的扩增BCL2基因的3-UTR区的序列的引物为Sense GCTCTAGA TTGGAAATCCGACCACTA,Antisense GCTCTAGA TGGCAGGATAGCAGCAC。
4.按权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤2)的BCL2基因的3-UTR区的序列扩增产物具有序列4的结构。
5.权利要求1所述的BCL2基因的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒在用于检测细胞内hsa-mir-1915对BCL2基因的调控作用中的用途。
6.权利要求1所述的BCL2基因的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒在用于抗肿瘤机制研究方法中的用途。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及BCL2基因3-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其构建方法。本发明通过将凋亡抑制基因BCL2的3-UTR区域插入双荧光素酶报告质粒pGL3-promoter的Xba I位点，构建包含BCL2的3-UTR区域的双荧光素报告基因质粒pGL3-p-BCL2-3-UTR，用于检测hsa-mir-1915对BCL2基因的调控作用，从而便于对细胞内microRNA调控的检测。本发明检测细胞内hsa-mir-1915的表达，从而标示细胞内特异的microRNA表达水平，为细胞内microRNA检测提供新的研究方法；所构建的BCL2基因的3-UTR区双荧光素酶报告基因质粒可用于检测细胞内hsa-mir-1915对BCL2基因的调控作用；进一步用于microRNA的抗肿瘤研究中，具有极佳的应用前景。
文档编号C12N15/66GK103060355SQ20111032590
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者范忠泽, 肖海娟, 许建华, 刘建文, 孙珏, 崔大苓, 徐可, 梁欣, 李琦, 殷佩浩, 高虹, 赵成根, 陆海, 金泉克, 王国娟, 余文燕, 朱晏伟, 张勇 申请人:上海中医药大学附属普陀医院, 华东理工大学