专利名称：一种携带荧光素酶报告基因的hsv-1 bac系统的构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与病毒学领域。更具体涉及一种新型的携带荧光素酶 报告基因的HSV-I BAC系统的构建方法。这种新型的HSV-I反向遗传操作系统可以用于在 大肠杆菌内对病毒基因组进行快速、准确的改造，同时又可以方便快捷地在体外对病毒进 行半定量，为进一步开展病毒功能基因组结构和蛋白质组学的研究、建立HSV-I基因治疗 和高效疫苗病毒载体系统奠定了坚实的基础。
背景技术：
疱疹病毒是一大类具有囊膜的双链线性DNA病毒，基因组大小约125 245 kb，能 感染人类及多种动物。疱疹病毒科包括110多种病毒，根据其生物学特性及临床致病特点 的不同可分为α、β、Y三个亚科。I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus I ,HSV-1) 属于α亚科，具有较强的感染性。它有着独特的生活周期，感染后可在生物体内长期潜伏， 终生存在，并能在一定的刺激条件作用下，由潜伏感染转入裂解性感染，导致疾病的反复发 作，给患者生活及临床治疗带来了极大困难。治疗用药因耐药性问题日益显著，因而急需寻 找开发新型的抗病毒药物和疫苗。而这个过程中对病毒分子生物学特性的研究是关键。由于疱疹病毒基因组庞大(125 245 kb)，过去往往对单个基因进行表达分析， 虽然为基因在体内的功能研究提供了线索，但更深的了解仍然需要在病毒基因组中进行遗 传分析。了解其复制和致病性分子特征的重要途径是，通过对感兴趣的基因进行定向突变 产生有感染性的子代病毒，进一步研究这种突变对病毒表型的影响一即病毒学研究中的 “反向遗传技术(reverse genetics) ”。疱疹病毒的反向遗传技术在早期是应用常规的分子 克隆技术，经过了需要辅助病毒参与、在真核细胞中重组并重建病毒的阶段，或使用重叠粘 粒库转染细胞、重组构成疱疹病毒全基因组并产生子代病毒。其中，载体构建和重组病毒的 筛选等工作费时又费力。随着大DNA片段克隆载体如酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染 色体(bacterial artificial chromosome, BAC)及相关操作技术的出现，疱疹病毒的遗传 分析也发展到一个新的阶段，即在BAC基础上的全长基因组感染性克隆技术。该技术允许 病毒基因组以BAC形式在大肠杆菌(五coli)中保存、增殖和引入人工突变，BAC质粒转染 到真核细胞即可重建病毒，经过复制的病毒可用于进一步的表型分析。这种在原核_真核 细胞之间往返的操作系统构成一个穿梭系统，从理论上讲，它允许对病毒基因组中任何基 因的任何遗传修饰。BAC技术在α、β、Y疱疹病毒亚科成员的基因组感染性克隆中都已获得成功， 主要是应用于探索病毒的基因功能，可以用于研究病毒的复制、生长特性、致病性、病毒与 宿主之间的关系如侵袭与免疫、潜伏感染、细胞嗜性、调节细胞信号功能等。通过构建重组 病毒突变体将基因置于病毒基因组的背景中进行研究，是解析疱疹病毒功能基因组学、蛋 白质组学和研究病毒感染和致病机理最有效的方法。传统的同源重组方法获得病毒突变 株难度大、无法对必需基因进行缺失或者突变操作，因此将HSV-I全基因组克隆入细菌人 工染色体，可以在大肠杆菌中开展病毒基因组的改造，提高构建重组病毒的效率，这将为
4HSV-I的基础和应用研究建立良好的技术平台。先前的研究已有一些HSV-I的BAC感染性 克隆被报道，但有些由于BAC骨架的插入导致某些病毒基因被失活，有些又由于缺少合适 的筛选标记使得后续的重组病毒的分离纯化变得困难。因而建立新型的、操作更为方便的 重组BAC系统对于HSV-I的分子生物学功能研究具有非常重要的理论和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种携带荧光素酶报告基因的HSV-I BAC系统的构建 方法，方法易行，操作简便，该方法在系统中引入了绿色荧光蛋白(GFP)和萤火虫荧光素酶 (Luciferase)双报告基因，既能在体外方便地对病毒基因组进行修饰，又能方便地在体外 对病毒粒子进行半定量，从而极大地简化了疱疹病毒的反向遗传学研究。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案
一种新型的携带荧光素酶报告基因的HSV-I BAC系统的构建方法，它包含了 GFP和 Luciferase的双重报告基因，其构建可分为两个过程首先将病毒基因组插入BAC载体构 建重组BAC，然后将Luciferase导入重组BAC构建新型的含Luciferase的重组BAC。其步 骤是
1、构建HSV-I BAC系统: 其具体方案包括下列步骤
(1)根据HSV-I F 株序列(Accession no. GU734771)设计含 HSV-1 UL37 和 UL38 同源 臂和BAC载体序列的引物(小写字母显示的是酶切位点，斜体显示的是保护性碱基)，引物 由上海生工生物技术有限公司合成，其序列为
UL37 forward :7^ggatccGAGCTGCAGCAGGCTGGAG
UL37 reverse :07( aagcttATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGTGGCCG TATAACACCC
UL38 forward =^aagcttATAACTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATAAGTCCCGG CATCCCGTTCG
UL38 reverse ^rggatccGCCCAAACAGCCGCTCCAG
(2)构建转移载体pUSF6:
1)用高保真酶KOD (日本Toyobo公司)以及上述引物使用PCR扩增UL37和UL38臂， 分别用回收试剂盒(北京Tiangen公司)回收；UL37臂PCR产物经I酶切后试剂盒回 收，pBluescript SK+ (pBSSK)载体(美国 Stratagene 公司)用 I 禾Π ^boR V双酶切 后试剂盒回收，上述片段经连接转化构建重组质粒PBSSK-UL37，然后用fee I酶切后用T4 DNA聚合酶(美国NEB公司)补平，然后用I酶切，回收后的片段与同样用I酶切 后回收的UL38臂片段连接，构建pBSSK-UL37-UL38质粒；
2) BAC ic#pUSF5 (Zhang, Ζ. , Rowe, J. , Wang, W. , Sommer, Μ. , Arvin, Α., Moffat, J. & Zhu, H. (2007). Genetic analysis of varicella-zoster virus ORFO to
0RF4 by use of a novel luciferase bacterial artificial chromosome system. J Virol
81，9024-9033.)用HinA III酶切后用碱性磷酸酶(CIP)(美国NEB公司)进行去
5磷酸化；PBSSK-UL37-UL38质粒经历/ d III酶切后，通过1. 5% (质量体积比，
下相同)的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，试剂盒回收UL37-UL38片段，与经CIP处理过的 PUSF5载体进行连接，构建转移载体PUSF6。
(3)构建HSV-I BAC重组病毒
1)将pUSF6用BarMI线性化，试剂盒回收；
2)取2mg pUSF6用Lipofectamine 2000 (美国Invitrogen公司)转染非洲绿猴肾 细胞(Vero)，然后用野生型F株HSV-I (wt HSV-I F)(中国普通微生物菌种保藏管理中心 购得)进行感染，选择表达绿色荧光的噬斑即为重组型；
(4)重组病毒的噬斑纯化
将绿色荧光的噬斑进行10、100、1000倍稀释后分别感染新鲜的单层Vero细胞，挑取只 表达绿色荧光的噬斑，重复此过程2 3次直到最终病毒感染的细胞全部表达绿色荧光(命 名为 HSV-I BAC)；
(5)重组病毒的鉴定
以纯化的HSV-I BAC重组病毒感染Vero细胞，提取病毒基因组，然后用Vifld III和 EcoR I进行酶切鉴定；
(6)构建穿梭型的重组BAC:
1)扩增HSV-IBAC重组病毒，测定病毒滴度，以10 m. o. i.的HSV-I BAC病毒感染 Vero单层细胞纩3 h后，刮取细胞，提取环状病毒基因组；
2)环状病毒基因组经透析后，电转化到大肠杆菌(五cWi)DH10B (美国Invirogen公 司)电转化感受态细胞中，均勻涂在12. 5 mg/ml有氯霉素(CAM)抗性的LB固体培养基上， 37 ！培养过夜；
3)挑取单个克隆，37！培养过夜，碱裂解法小量提取(4飞ml)BAC质粒，经历^dIII酶 切分析，选择与预期条带相符的克隆作为候选克隆(命名为PHSV-I BAC)；
(J) vHSV-1 BAC重组病毒的拯救
1)按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒(德国Macherey-Nagel公司)说明书，500 ml过夜培养的菌液用于提取pHSV-1 BAC质粒，最后用200 mL ddH20溶解；
2)取广2mg pHSV-1 BAC电转染到Vero细胞中，2 3天后观察到表达绿色荧光的噬斑 (命名为 vHSV-1 BAC)；
(8)BAC骨架的切除
取pHSV-1 BAC质粒广2 mg与0. 5 mg的Cre重组酶表达质粒pGS403 (Zhang, Ζ.， Rowe, J. , Wang, W. , Sommer, Μ. , Arvin, Α. , Moffat, J. & Zhu， H. (2007). Genetic analysis of varicella-zoster virus ORFO to 0RF4 by use of a novel luciferase bacterial artificial chromosome system. J Virol 81，9024-9033.)同时电转染到 Vero细胞中，2 3天后观察到同时有表达绿色荧光和不表达绿色荧光的噬斑，用步骤(4)所 描述的噬斑纯化方法纯化出不表达绿色荧光的病毒(命名为HSV-I Iox)；
(9)野生型及重组病毒生长特性的鉴定
用传统的噬斑检测法同时测定wt HSV-UHSV-I BAC, HSV-I Iox和HSV-1 BAC Luc病 毒的一步生长曲线；结果细胞培养上清和细胞沉淀中各重组病毒和野生型病毒表现出几乎 一致的生长曲线，表明BAC载体(pUSF5)的插入并没有改变病毒的生长特性。这种构建的HSV-I BAC系统可以进一步用来对病毒基因组进行改造或修饰。2、构建新型的Luciferase稳定表达的HSV-1 BAC系统 其具体方案包括下列步骤
(1)设计扩增Luciferase-Hyglr表达盒的PCR引物，引物5’端包含UL3与UL4基因间 隔区的各40 bp的序列，用于同源重组，引物3’端包含Luciferase-Hyglr表达盒19 bp的序 列，用于扩增Luciferase-Hyf片段。引物由上海生工生物技术有限公司合成，其序列为
Luc-Hyg forwordCCGAGATAACGTCATGCTGGCCTCGGGGGCCGAGTAACCGCGAGCTCTTACGCGTGC
TA
Luc-Hyg reverse
TGCCACCCCCCCTGCGGGCGGTCCATTAAAGACAACAAACTCAGGCGCCGGGGGCGGTG
(2)用高保真KOD酶(日本Toyobo公司)以及上述引物PCR扩增Luciferase-Hyglr片 段，用回收试剂盒回收，回收后的片段用Dpn I (美国NEB公司)消化后再次用试剂盒回收， 双蒸水洗脱DNA片段；
(3)将pHSV-1 BAC 电转化到五 coli DY380 中(Zhang, Ζ. , Rowe, J. , Wang, W. , Sommer, Μ. , Arvin, A. , Moffat, J. & Zhu, H. (2007). Genetic analysis of varicella-zoster virus ORFO to 0RF4 by use of a novel luciferase bacterial artificial chromosome system. J Virol 81，9024-9033. )，32 °C培养 24 48 h，挑取单 个克隆制备pHSV-1 BAC DY380电转化感受态细胞；
(4)取回收的Luciferase-Hygr DNA 片段 200 ng 电转化至Ij pHSV-1 BAC/DY380 电转化 感受态细胞中，涂在氯霉素(CAM)和潮霉素(Hyg)双抗性的LB琼脂平板上32 ！培养过夜；
(5)挑取单个克隆用PCR进行鉴定，对PCR阳性的克隆用碱裂解法小量(4飞ml)提 取BAC质粒，然后用Z/i/7d III进行酶切鉴定，与预期条带相符的克隆作为候选克隆(命名为 pHSV-1 BAC Luc)；
(6)挑取pHSV-1BAC Luc DY380单克隆，每天传代一次，连续传代20天，在传代后的 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天分别提取其BAC DNA用历idIII酶切后进行限制性片段长度 多态性(RFLP)分析。(7)按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒(德国Macherey-Nagel公司)说明 书，500 ml过夜培养的菌液用于提取pHSV-1 BAC Luc质粒，取广2 mg pHSV-1 BAC Luc质 粒电转染到Vero细胞中，2 3天后观察绿色荧光噬斑的表达(命名为HSV-I BAC Luc)；
(8)将HSV-I BAC Luc重组病毒感染Vero细胞后，同时用传统的噬斑检测法和荧光素 酶检测试剂盒测定病毒的一步生长曲线，比较两种不同测定方法的相关性。结果唯有HSV-I BAC Luc病毒感染的细胞能检测到荧光素酶活性的升高，而其它的重组病毒均检测不到荧 光素酶活性的变化，从而表明荧光素酶基因已经稳定地整合到病毒的基因组上并且病毒的 感染可以通过检测荧光素酶的活性来指示。传统的噬斑检测法和荧光素酶检测试剂盒测定 的病毒的一步生长曲线表现出相似的趋势，表明本发明所构建的重组BAC系统可以用来在 体外对病毒进行半定量。综上所述，本发明所构建的HSV-I BAC反向遗传操作系统不仅可以用来准确地 在体外对病毒基因组进行修饰，还能在体外对病毒进行半定量，这为病毒功能基因组学、蛋 白质组学的研究及重组病毒疫苗的研制打下了夯实的基础。
7
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
本发明所构建的新型的携带荧光素酶报告基因的HSV-I BAC系统包含 了 GFP和Luciferase的双重报告基因，它有以下一些优点1、这套重组BAC系统可以 在原核和真核细胞间穿梭，在细菌内可以稳定传代，转染到真核细胞中又可以产生感染性 的病毒粒子；2、BAC骨架两侧的IoxP位点使得外源的BAC序列可以很容易地通过共转染 Cre重组酶表达质粒得到切除；3、BAC载体上的GFP报告基因使得后续的重组病毒的分离纯 化变得容易；4、Luciferase报告基因使得可以在体外方便地测定病毒粒子的产量，免去了 传统的病毒滴定的繁琐；5、重组BAC可以在大肠杆菌中稳定传代，且拯救后的重组病毒表 现出与野生型病毒相似的生长特性，表明这套系统具有很好的稳定性。本发明所构建的HSV-I BAC系统为其毒力基因、保护性抗原基因、
重组病毒构建、功能基因组学和蛋白质组学研究以及基因缺失病毒疫苗的研制提供了 良好的技术平台，从而为研制安全、稳定的病毒载体疫苗奠定了基础。
图1为一种HSV-I BAC重组病毒的构建流程图
PUSF6为一 BAC载体，它包含原核细胞复制起点(ori )基因，复制与分隔(χ印E，parA, and parB)基因，氯霉素抗性(CAM)基因，绿色荧光蛋白(政/7)基因，两个1. 3 kbp的同源臂 (UL37和UL38)以及两个IoxP位点。线性化的pUSF6被转染到Vero细胞中，然后用HSV-I 感染，经同源重组，BAC骨架被整合到HSV-I F基因组的UL37与UL38基因之间的基因间隔 区。表达绿色荧光的重组病毒通过噬斑纯化得以分离。图2为野生型HSV-I及各重组病毒表型鉴定示意图
A为wt HSV-I感染Vero细胞后的噬斑没有荧光，B为HSV-I BAC重组病毒的噬斑则 表达绿色荧光，C为BAC骨架切除后的重组病毒HSV-I Iox的噬斑没有荧光，D为拯救后的 HSV-I BAC Luc重组病毒表达绿色荧光。图3为重组BAC及其拯救病毒的限制性片段长度多态性(RFLP)分析示意图
wt HSV-U HSV-I BAC、pHSV-1 BAC 禾口 vHSV_l BAC 用 IIIfP^boR I it^f RFLP ^ 析，星号标记的条带显示的是BAC载体插入HSV-I基因组后所产生的酶切谱带的变化。图4为野生型HSV-I及各重组病毒的限制性片段长度多态性(RFLP)分析示意图 wt HSV-I、HSV-I BAC.vHSV-l BAC, HSV-I Iox 禾口 HSV-1 BAC Luc 用III进行 RFLP
分析，wt HSV-I 和HSV-I Iox酶切谱带一致，HSV-I BAC与 vHSV-1 BAC谱带一致，而HSV-1 BAC Luc则多出一条约2 kb的条带(星号标示)。图5为一种表达Luciferase的HSV-1重组BAC构建流程图
大肠杆菌DY380提供了一种高效的同源重组系统，它能允许发生重组所需的同 源序列短至40个碱基。这种系统被一种温度敏感型的阻遏蛋白严谨调控，可以通过在42 °C孵育15 min使重组系统激活。含pHSV_l BAC的DY380在42 °C热击使重组系统激活后， 转入线性化的Luciferase-Hyglr DNA,经同源重组，Luciferase-Hygr被整合到HSV-1基因 组的相应位点。随后通过PCR鉴定、抗性筛选及酶切鉴定来确定正确的重组克隆。鉴定的 pHSV-1 BAC Luc被转染到真核细胞拯救出感染性的病毒。图6为HSV-I BAC Luc重组病毒荧光素酶活性与病毒滴度的相关性分析示意图用0.01 m. ο. i.的HSV-I BAC Luc重组病毒感染Vero细胞，在感染后6、12、 24、36、48、72 h收集细胞，分别用传统的噬斑检测法和荧光素酶活性检测法测定病毒的一 步生长曲线，比较两种方法的相关性。图7为一种含Luciferase的重组BAC在大肠杆菌中的稳定性分析示意图
pHSV-1 BAC Luc在DY380中每天传代一次，连续传代20天，在传代后的2、4，、6、 8、10、12、14、16、18、20天分别提取其BAC DNA用历/ d III酶切后进行RFLP分析。图8为野生型与重组型HSV-I病毒的一步生长曲线分析示意图
用 0.01 m. O. i.的 Wt HSV-UHSV-I BAC, HSV-I IoxfPHSV-I BAC Luc 病毒分别感 染Vero细胞，37 °C孵育1 h后，用柠檬酸缓冲液处理去掉残余的未吸附的病毒，PBS洗2 次，加维持液覆盖。在感染后6、12、24、36、48、72 h分别收集上清和细胞沉淀，在Vero细胞 上测定病毒滴度，绘制一步生长曲线。图8A为收集的病毒感染细胞沉淀在单层Vero细胞 上的一步生长曲线，图8B为收集的病毒感染细胞上清在Vero细胞上的一步生长曲线。
具体实施例方式实施例1
一种携带荧光素酶报告基因的HSV-I BAC系统的构建方法，其步骤是 1、构建HSV-I BAC系统
(1)根据HSV-I F 株序列(Accession no. GU734771)设计含 HSV-1 UL37 和 UL38 同源 臂和BAC载体序列的引物，UL37和UL38臂两侧包含两个IoxP位点，中间含有一汉I的 酶切位点。(小写字母显示的是酶切位点，斜体显示的是保护性碱基)
UL37 forward :7^ggatccGAGCTGCAGCAGGCTGGAG
UL37 reverse :07( aagcttATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGTGGCCG TATAACACCC
UL38 forward =^aagcttATAACTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATAAGTCCCGG CATCCCGTTCG
UL38 reverse ^rggatccGCCCAAACAGCCGCTCCAG ；
(2)构建转移载体pUSF6:
1)用高保真酶KOD以及上述引物PCR扩增UL37和UL38臂，分别用回收试剂盒(北 京Tiangen公司)回收；UL37臂PCR产物经I酶切后试剂盒回收，pBluescript SK+ (pBSSK)载体(美国Stratagene公司)用汉警H I和V双酶切后试剂盒回收，上述片 段经连接转化构建质粒PBSSK-UL37，然后用Sac I酶切后用T4 DNA聚合酶(美国NEB公司) 补平，然后用I酶切，回收后的片段与同样用I酶切后回收的UL38臂片段连接， 构建 pBSSK-UL37-UL38 质粒；
2)BACic#pUSF5 (Zhang, Ζ. , Rowe, J. , Wang, W. , Sommer, Μ. , Arvin, Α., Moffat, J. & Zhu, H. (2007). Genetic analysis of varicella-zoster virus ORFO to 0RF4 by use of a novel luciferase bacterial artificial chromosome system. J Virol 81，024-9033.)用历·/ (! Ill酶切后用碱性磷酸酶(CIP)(美国NEB公司)进行去磷酸 化，试剂盒回收；PBSSK-UL37-UL38质粒经历id III酶切后，通过1. 5% (质量体积比)的琼脂 糖凝胶电泳分离，切胶，试剂盒回收UL37-UL38片段，与经CIP处理过的pUSF5载体进行连
9接，连接产物转化DH5a大肠杆菌(美国invitrogen公司)，构建转移载体pUSF6。
(3)构建HSV-I BAC重组病毒
1)将pUSF6用I线性化，试剂盒(北京Tiangen公司)回收；
2)取2mg线性化的pUSF6用Lipofectamine 2000 (美国Invitrogen公司)转染非 洲绿猴肾细胞(Vero)，转染8 h后，弃培养液，PBS洗两次，然后用1 m. o. i.的野生型F株 HSV-I (中国普通微生物菌种保藏管理中心购得)(wt HSV-I F)进行感染，37 °C孵育1 h 后，PBS洗两次后换维持液继续培养，于24、8 h观察绿色荧光的表达情况，选择表达绿色 荧光的噬斑即为重组型(如图1所示)；
(4)重组病毒的噬斑纯化
挑取含绿色荧光的噬斑进行10、100、1000倍稀释后分别感染新鲜的单层Vero细胞，挑 取只表达绿色荧光的噬斑，重复此过程2 3次直到最终病毒感染的细胞全部表达绿色荧光 (命名为HSV-I BAC，如图2所示)；
(5)重组病毒的鉴定
以纯化的HSV-I BAC重组病毒感染Vero细胞，提取病毒基因组，然后用Vifld III和 EcoR I进行酶切鉴定；
病毒基因组提取的具体步骤为75 cm2单层Vero细胞，按10 m. o. i.的量接种 HSV-I BAC重组病毒，待细胞出现70°/Γ80%病变时，将细胞从培养瓶壁上刮下，700 X g离心 5 min，收获细胞沉淀，以4 °C预冷的10 mM PBS CpH 7. 4)洗涤一次，加入500 mL预冷的 TE CpH 8.0)悬浮细胞，加入1% (体积比)Triton X-100，超声破碎一次，4 °C 2000 X g离 心10 min，小心吸出上清，加入适当体积的1/10微球菌核酸酶缓冲液和50 U酶(大连宝生 物工程有限公司)，37 °C孵育30 min后以EDTA终止核酸酶酶切。加入SDS和蛋白酶K，使 其终浓度分别为0. 5% (体积比)和0. 2 mg/ml，于52°C水浴中消化2 h，等体积的苯酚-氯 仿_异戊醇抽提2次，氯仿抽提1次，最后用异丙醇沉淀病毒DNA，洗涤干燥后再溶解于50 mL TE中。取5 mL以历idIII ^WEcoR I酶切分析。结果由于BAC的插入，HSV-1 BAC的酶 切谱带发生了变化，两条特异的5922 bp和3581 bp的条带出现在HSV-I BAC的基因组中， 而在野生型的HSV-I (中国普通微生物菌种保藏管理中心购得)基因组中并不出现，这与预 期的分析相符。^oR I酶切分析也表现出相似的结果。(如图3所示，星号标记显示的是 BAC插入后产生的差异条带)
(6)构建穿梭型的重组BAC:
1)扩增HSV-I BAC重组病毒，测定病毒滴度，以10 m. o. i.的HSV-I BAC重组病毒 感染Vero单层细胞2 3 h后，刮取细胞，提取环状病毒基因组；
病毒的环状基因组DNA提取参照Hirt法稍加以修改。具体过程为25 cm2 Vero单层 细胞，按10 m. ο. i.的量接种HSV-I BAC重组病毒，37 °C吸附1 h后，继续感染2 3 h， 然后将细胞刮下，以1 ml PBS洗涤一次，4000 Xg离心5 min，沉淀以100 mL TECpH 7.5， 10 mM Tris, 1 mM EDTA)分散悬浮，加入500 mL细胞裂解缓冲液(pH 7. 5, IOmM Tris, 0. 6% SDS, 10 mM EDTA)和 5 mL RNase A，室温(20 25°C，以下相同)放置 30 min，加入 400 mL 5M NaCl，立即颠倒数次(6 8次)混合液体，4 °C放置24 h，15000X g离心30 min，小心取 出上清后以苯酚_氯仿_异戊醇抽提1次，吸取上层水相，以异丙醇沉淀DNA，70% (体积比) 乙醇洗涤干燥后，加入20 mL纯水溶解。
2)取2 mL提取的病毒基因组电转化到DHlOB大肠杆菌(五cWi)电转化感受态 细胞(美国Invitrogen公司)中，均勻涂在有氯霉素(CAM)抗性的LB固体培养基上，37 V 培养过夜；
细菌电转化的具体步骤为将HSV-I BAC病毒环状基因组DNA与50 mL DHlOB感受 态细胞混合后置于预冷的0. 1 cm电转化杯中，以2500 V, 25 mF, 200 Ω的条件下进行电转 化(Bio-Rad电传孔仪和电击杯)。电击后迅速加入1 ml预热至37 V的SOC液体培养基，置 于37 °C,振摇培养1 h后，涂布于含12. 5 mg/ml的CAM的LB琼脂平板，每块平板200 mL。 24 h后，挑取单菌落于含CAM的LB液体培养基中培养16 h。3)挑取单个克隆，37 °C培养过夜，碱裂解法小量(4飞ml)提取BAC质粒，历^dIII 酶切分析，选择与预期条带相符的克隆作为候选克隆(命名为PHSV-I BAC)；
BAC质粒碱裂解法小量提取的具体步骤为挑取的单克隆加入4 ml培养基培养过 夜，12000 rpmX 1 min收集菌液，去上清，加入300 mL溶液I，涡旋混勻，加入300 mL溶 液II，颠倒混勻，室温作用3 min,加入300 mL溶液III，颠倒混勻，冰上作用10 min, 12000 rpmX 10 min，转移上清加等体积酚-氯仿(1 1) (800^900 mL)，充分混勻，12000 rpm X 10 min将800 mL上层水相转移至1.5 ml Tube加入等体积或0. 7倍体积的异丙醇，混勻， 冰上 10 min (或室温 5 min)，12000 rpm X 10 min 70% (体积比)乙醇 500 mL 洗 1 次， 离心12000 rpmX 5 min，室温干燥沉淀，加入35 mL 40 mL含20 mg/ml RNaseA的TE在室 温或者37 °C作用30 min，使之充分溶解，取8或10 mL进行酶切分析。pHSV-1 BAC酶切分 析的结果与预期相符(如图3所示)。所述的溶液I Tris · Cl 50 mmol/L pH 8. 0
EDTA 10 mmol/L pH 8. 0
所述的溶液II (临用前配置) NaOH 0. 2 mol/L
SDS1%
所述的溶液III 3 mol/L乙酸钾 60 ml 冰乙酸 11. 5 ml 无菌水 28. 5 ml (7) vHSV-1 BAC重组病毒的拯救
1)按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒(德国Macherey-Nagel公司)说明书，500 ml过夜培养的菌液用于提取pHSV-1 BAC质粒，最后用200 mL ddH20溶解；
2)取广2mg pHSV-1 BAC质粒电转染到Vero细胞中，2 3天后观察到表达绿色荧光的 噬斑(命名为vHSV-1 BAC)(如图2所示)。电转染的具体步骤为培养单层vero细胞至80%汇合度。用PBS溶液将细胞洗 涤两次。在单层细胞表面加入胰蛋白酶溶液0.5 ml，使其覆盖在细胞表面，37 °C反应;Γ5 min，待全部细胞从培养血壁上脱落下来，加入DMEM (美国Gibco公司)+10% (体积比)FBS (美国Gibco公司)的培养液。将细胞收集在15 ml无菌离心管中，4 °C, 1500 rpm离心5 min。将细胞沉淀用PBS溶液重新悬浮，4 °C, 1500 rpm离心5 min。重复上述操作两次。收 集细胞沉淀，再将细胞重新悬浮在OPTI-MEM溶液中。用台盼蓝法(美国Sigma公司)进行细 胞记数，并调整细胞浓度。轻轻混勻。设置电穿孔仪参数为950 μ FD, 220 V,4 mm电转杯。
11转移细胞和DNA的混合物至4 mm的冰预冷电转化杯中，冰浴10 min后，装入电转化槽，按 电脉冲开关，产生一个10 msec的脉冲。迅速冰浴10 min。迅速加入10 ml DMEM+10% (体 积比)FBS的培养液，转移至15 ml无菌离心管中，4 °C, 1500 rpm离心5 min，收集细胞沉 淀，再次加入10 ml DMEM+10% (体积比)FBS的培养液，充分悬浮细胞。将细胞悬浮液转移 至细胞培养皿中培养。转染后48 h可观察绿色荧光的表达情况。(8) BAC骨架的切除
取pHSV-1 BAC质粒广2 mg与0. 5 mg的Cre重组酶表达质粒pGS403 (Zhang, Ζ.， Rowe, J. , Wang, W., Sommer, Μ., Arvin, Α. , Moffat, J. & Zhu， H. (2007). Genetic analysis of varicella-zoster virus ORFO to 0RF4 by use of a novel luciferase bacterial artificial chromosome system. J Virol 81，9024-9033.)同时电转染到 Vero细胞中，2 3天后观察到同时有表达绿色荧光和不表达绿色荧光的噬斑，用步骤(4)所 描述的噬斑纯化方法纯化出不表达绿色荧光的病毒(命名为HSV-I Iox)(如图2所示)； (9)野生型HSV-I及各重组病毒生长特性的鉴定
用噬斑检测法同时测定wt HSV-UHSV-I BAC, HSV-I IoxfPHSV-I BAC Luc病毒的一 步生长曲线；
噬斑检测法的具体步骤为Vero细胞培养于24孔板，待长成单层后，以0.01 m. o. i. 分别感染wt HSV-UHSV-I BAC、HSV-I Iox和HSV-1 BAC Luc病毒，吸附1 h后，以灭菌的 CBS缓冲液(40 mM柠檬酸钠，10 mM氯化钾，135 mM氯化钠，pH 3. O )洗涤一次，再以PBS洗 涤2次后，加入1 ml维持液继续培养。于接种后6、12、24、36、48和72 h分别收集细胞培 养上清和细胞沉淀，_70°C冷冻保存。细胞沉淀冻融一次，5000 rpm离心5 min，取上清和细 胞培养上清，同时测定病毒滴度，分析重组病毒的繁殖特性。结果细胞培养上清和细胞沉淀中各重组病毒和野生型病毒表现出几乎一致的生 长曲线，表明BAC载体的插入并没有改变病毒的生长特性(如图8所示)。这种构建的HSV-I BAC系统可以进一步用来对病毒基因组进行改造或修饰。2、构建新型的Luciferase稳定表达的HSV-1 BAC系统
(1)设计扩增Luciferase-Hyglr表达盒的PCR引物，引物5’端包含UL3与UL4基因间 隔区的各40 bp的序列，用于同源重组，引物3’端包含Luciferase-Hyglr表达盒19 bp的序 列，用于扩增Luciferase-Hyf片段。引物由上海生工生物技术有限公司合成，其序列为
Luc-Hyg forwordCCGAGATAACGTCATGCTGGCCTCGGGGGCCGAGTAACCGCGAGCTCTTACGCGTGC
TA ；
Luc-Hyg reverse
TGCCACCCCCCCTGCGGGCGGTCCATTAAAGACAACAAACTCAGGCGCCGGGGGCGGTG ；
(2)用高保真KOD酶(日本Toyobo公司)以及上述引物PCR扩增Luciferase-Hyglr片 段，用溶液回收试剂盒(北京Tiangen公司)回收，回收后的片段用Dpn I (美国NEB公司)消 化后再次用溶液回收试剂盒回收，双蒸水洗脱DNA片段；
(3)将pHSV-1 BAC 电转化到五 coli DY380 (Zhang, Ζ.，Rowe, J.，Wang, W., Sommer, Μ. , Arvin, Α. , Moffat, J. & Zhu, H. (2007). Genetic analysis of varicella-zoster virus ORFO to 0RF4 by use of a novel luciferase bacterial artificial chromosome system. J Virol 81，9024-9033·)中，32 °C培养 24 48 h，挑取单个克隆制备pHSV-1 BAC/DY380电转化感受态细胞；
电转化感受态细胞制备的具体步骤为挑取单克隆的pHSV-1 BAC/DY380菌在32 V 培养过夜，次日以1:100转接到200 ml含12. 5 mg/ml氯霉素(CAM)和50 mg/ml潮霉素 (Hyg)的低盐LB培养基中，32 °C培养至OD6tltlnm值达0. 5，迅速将培养基转至42 ！水浴中剧 烈振摇15 min，然后立即将培养基转移至冰水混合物中作用30 min,6000 X g 10 min于 4 ！收集细菌沉淀，用冰预冷的双蒸水洗涤沉淀两次，然后用10% (体积比)冰预冷的甘油 洗涤沉淀2次，1 ml 10% (体积比)冰预冷的甘油重悬，40 mL每支分装，冻存于_80°C备用。(4)取回收的 Luciferase-Hygr DNA片段2OO ng 电转化到pHSV-1 BAC/DY380 电 转化感受态细胞中，电转参数为1800 V, 25 mF,200 W, 1 ml SOC培养基32 °C振摇2 h后均 勻涂在含CAM和Hyg双抗性的LB固体培养基上32 ！培养过夜；
(5)挑取单个克隆用PCR进行鉴定，对PCR阳性的克隆用碱裂解法小量(4飞ml)提 取BAC质粒，然后用HinA III进行酶切鉴定，与预期条带相符的克隆作为候选克隆(命名为 pHSV-1 BAC Luc)；
(6)挑取pHSV-1BAC Luc DY380单克隆，每天传代一次，连续传代20天，在传代后的 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天分别提取BAC DNA用历·/ (! III酶切后进行RFLP分析。结果 显示不同传代次数的pHSV-1 BAC Luc均显示出相似的酶切谱带，表明pHSV-1 BAC Luc在 大肠杆菌DY380中具有良好的稳定性。(7)按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒说明书，500 ml过夜培养的菌液用于 提取pHSV-1 BAC Luc质粒，取广2 mg pHSV-1 BAC Luc质粒电转染到Vero细胞中，2 3天 后观察绿色荧光噬斑的表达(命名为HSV-I BAC Luc)(如图2所示)；
(8)将HSV-I BAC Luc重组病毒感染Vero细胞后，同时用传统的噬斑检测法和荧光素 酶检测试剂盒测定病毒的一步生长曲线，比较两种不同测定方法的相关性。其具体操作步骤为用0.01 m. o. i.的HSV-1 BAC Luc病毒感染Vero细胞，37 °C孵育1 h后，用柠檬酸缓冲液处理去掉残余的未吸附的病毒，PBS洗2次，加维持液覆盖。 在感染后6、12、24、36、48、72 h收集细胞沉淀，在Vero细胞上同时用荧光素酶检测试剂盒 和传统的噬斑检测法测定病毒滴度，绘制一步生长曲线。结果唯有HSV-I BAC Luc病毒感 染的细胞能检测到荧光素酶活性的升高，而其它的重组病毒均检测不到荧光素酶活性的变 化，从而表明荧光素酶基因已经稳定地整合到病毒的基因组上并且病毒的感染可以通过检 测荧光素酶的活性来指示。传统的噬斑检测法和荧光素酶检测试剂盒测定的病毒的一步生 长曲线表现出相似的趋势(如图6所示)，表明本发明所构建的重组BAC系统可以用来在体 外对病毒进行半定量。综上所述，本发明所构建的一种新型的携带荧光素酶报告基因的HSV-I BAC系统 不仅可以用来准确地在体外对病毒基因组进行改造或修饰，还能在体外对病毒进行半定 量，从而不仅为HSV-I功能基因组学、蛋白质组学研究提供了良好的技术平台，也为安全、 稳定的病毒载体疫苗的研制奠定了基础。
权利要求
一种携带荧光素酶报告基因的HSV 1 BAC系统的构建方法，其步骤是A、构建HSV 1 BAC系统(1) 根据HSV 1 F株序列设计含HSV 1 UL37和UL38同源臂和BAC载体序列的引物，其序列为UL37 forwardTAggatccGAGCTGCAGCAGGCTGGAG；UL37 reverseCCGaagcttATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGTGGCCGTATAACACCC；UL38 forwardCGCaagcttATAACTTCGTATAATGTATGCTAT ACGAAGTTATAAGTCCCGGCATCCCGTTCG；UL38 reverseATggatccGCCCAAACAGCCGCTCCAG；(2) 构建转移载体pUSF6 a) 用高保真酶KOD以及上述引物使用PCR扩增UL37和UL38臂，分别用回收试剂盒回收；UL37臂 PCR产物经BamHⅠ酶切后试剂盒回收，pBluescript SK+(pBSSK)载体用BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切后试剂盒回收，上述片段经连接转化构建重组质粒pBSSK UL37，然后用SacⅠ酶切后用T4 DNA聚合酶补平，然后用BamHⅠ酶切，回收后的片段与同样用BamHⅠ酶切后回收的UL38臂片段连接，构建pBSSK UL37 UL38质粒；b)BAC载体pUSF5用HindⅢ酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化；pBSSK UL37 UL38质粒经HindⅢ酶切后，通过1.5%质量体积比的琼脂糖凝胶电泳分离，切胶，试剂盒回收UL37 UL38片段，与经CIP处理过的pUSF5载体进行连接，构建转移载体pUSF6； (3)构建HSV 1 BAC重组病毒a)将pUSF6用BamHⅠ线性化，试剂盒回收；b) 取2 mg pUSF6用Lipofectamine 2000转染非洲绿猴肾细胞，然后用野生型F株HSV 1(wt HSV 1 F)进行感染，选择表达绿色荧光的噬斑即为重组型； (4) 重组病毒的噬斑纯化将绿色荧光的噬斑进行10、100、1000倍稀释后分别感染新鲜的单层Vero细胞，挑取只表达绿色荧光的噬斑，重复此过程2~3次直到最终病毒感染的细胞全部表达绿色荧光，为HSV 1 BAC； (5)重组病毒的鉴定以纯化的HSV 1 BAC重组病毒感染Vero细胞，提取病毒基因组，然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行酶切鉴定；(6)构建穿梭型的重组BAC a) 扩增HSV 1 BAC重组病毒，测定病毒滴度，以10 m. o. i.的HSV 1 BAC病毒感染Vero单层细胞2~3 h后，刮取细胞，提取环状病毒基因组；b) 环状病毒基因组经透析后，电转化到大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞中，均匀涂在12.5 mg/ml有氯霉素抗性的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜；c) 挑取单个克隆，37 ℃培养过夜，碱裂解法小量提取BAC质粒，经HindⅢ酶切分析，选择与预期条带相符的克隆作为候选克隆，为pHSV 1 BAC；(7) vHSV 1 BAC重组病毒的拯救a)按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒说明书，500 ml过夜培养的菌液用于提取pHSV 1 BAC质粒，最后用200 mL ddH2O溶解；b)取1~2 mg pHSV 1 BAC电转染到Vero细胞中，2~3天后观察到表达绿色荧光的噬斑，为vHSV 1 BAC；(8)BAC骨架的切除取pHSV 1 BAC质粒1~2 mg与0.5 mg的Cre重组酶表达质粒pGS403同时电转染到Vero细胞中，2~3天后观察到同时有表达绿色荧光和不表达绿色荧光的噬斑，用步骤(4)所描述的噬斑纯化方法纯化出不表达绿色荧光的病毒，为HSV 1 lox；(9)野生型及重组病毒生长特性的鉴定用噬斑检测法同时测定wt HSV 1、HSV 1 BAC、HSV 1 lox和HSV 1 BAC Luc病毒的一步生长曲线，结果各重组病毒和野生型病毒表现出几乎一致的生长曲线，表明BAC载体的插入并没有改变病毒的生长特性，这种构建的HSV 1 BAC系统进一步用来对病毒基因组进行改造或修饰；B、构建Luciferase稳定表达的HSV 1 BAC系统(1) 设计扩增Luciferase Hygr表达盒的PCR引物，引物5’端包含UL3与UL4基因间隔区的各40 bp的序列，用于同源重组，引物3’端包含Luciferase Hygr表达盒19 bp的序列，用于扩增Luciferase Hygr片段，其序列为Luc Hyg forwordCCGAGATAACGTCATGCTGGCCTCGGGGGCCGAGTAACCGCGAGCTCTTACGCGTGCTALuc Hyg reverseTGCCACCCCCCCTGCGGGCGGTCCATTAAAGACAACAAACTCAGGCGCCGGGGGCGGTG；(2) 用高保真KOD酶以及上述引物PCR扩增Luciferase Hygr片段，用回收试剂盒回收，回收后的片段用DpnⅠ消化后再次用试剂盒回收，双蒸水洗脱DNA片段；(3) 将pHSV 1 BAC电转化到E. coli DY380中，32 ℃培养24~48 h，挑取单个克隆制备pHSV 1 BAC/DY380 电转化感受态细胞；(4)取回收的Luciferase Hygr DNA片段200 ng电转化到pHSV 1 BAC/DY380 电转化感受态细胞中，涂在氯霉素和潮霉素双抗性的LB琼脂平板上32 ℃培养过夜；(5) 挑取单个克隆用PCR进行鉴定，对PCR阳性的克隆用碱裂解法提取BAC质粒，然后用HindⅢ进行酶切鉴定，与预期条带相符的克隆作为候选克隆，为pHSV 1 BAC Luc；(6) 挑取pHSV 1 BAC Luc/DY380单克隆，每天传代一次，连续传代20天，在传代后的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天分别提取其BAC DNA用HindⅢ酶切后进行限制性片段长度多态性分析；(7) 按照NucleoBond的BAC质粒提取试剂盒说明书，500 ml过夜培养的菌液用于提取pHSV 1 BAC Luc质粒，取1~2 mg pHSV 1 BAC Luc质粒电转染到Vero细胞中，2~3天后观察绿色荧光噬斑的表达，为HSV 1 BAC Luc；(8) 将HSV 1 BAC Luc重组病毒感染Vero细胞后，同时用噬斑检测法和荧光素酶检测试剂盒测定病毒的一步生长曲线，所构建的重组BAC系统用来在体外对病毒进行半定量。
全文摘要
本发明公开了一种携带荧光素酶报告基因的HSV-1BAC系统的构建方法，步骤是A、构建系统(1)根据HSV-1F株序列设计引物；(2)构建转移载体；(3)构建重组病毒；(4)噬斑纯化；(5)重组病毒的鉴定(6)构建重组BAC；(7)重组病毒的拯救；(8)生长曲线测定；B、构建Luciferase稳定表达系统(1)设计扩增Luciferase-Hygr引物；(2)用高保真KOD酶扩增片段；(3)将pHSV-1BAC电转化到E.coliDY380中；(4)取回收的DNA片段电转化到pHSV-1BAC/DY380电转化感受态细胞中；(5)鉴定；(6)挑取DY380单克隆；(7)BAC质粒提取；(8)病毒拯救；(9)将HSV-1BACLuc重组病毒感染细胞，在体外对病毒进行半定量。方法易行，操作简便，既可在体外对病毒基因组进行修饰，又可在体外对病毒粒子进行半定量。
文档编号C12Q1/66GK101979598SQ20101051458
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月20日 优先权日2010年10月20日
发明者李友, 郑春福 申请人:中国科学院武汉病毒研究所