专利名称：一种检测马立克氏肿瘤的方法
技术领域：
本发明属生物检测技术领域，具体涉及一种检测马立克氏肿瘤的方法。
背景技术：
马立克氏病是一种淋巴组织增生性肿瘤病，目前是危害养鸡业健康发展的三大主要疫病之一，引起鸡群较高的发病率和死亡率，给养殖带来极大地经济损失。因此，及早地进行诊断有助于减少损失。通常可根据临床症状进行初步诊断，但对于临床上较难判断的需送实验室进行病毒分离鉴定、血清学方法、组织学检查以及核酸探针等方法进行确诊。琼脂扩散试验方法是用马立克氏病抗血清确定病鸡羽毛囊中有无该病毒存在，但该方法只能确定是否感染，不能确定是否发生肿瘤。
发明内容
针对以上问题，本发明目的在于提供一种检测马立克氏肿瘤的方法。为了实现本发明目的，本发明的技术方案在于采用一种检测马立克氏肿瘤的方法，包括以下步骤
1)分离样品抗凝血液中的淋巴细胞；
2)提取淋巴细胞中的基因组DNA；
3)设计微卫星引物；
4)PCR扩增目的片段；
5)对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。步骤1)所述的淋巴细胞分离方法为先将淋巴分离液加于试管底部，然后沿试管壁加入抗凝血液，低速离心，吸取中间层到另一干净于试管中，-20°C保存备用。所述的淋巴分离液与抗凝血液体积比为2 :1。步骤4)所述的PCR扩增的体系为模板1 μ L,Taq DNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各 ι μ L，dNTP 2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水补足 25 μ L。步骤4)所述的PCR扩增采用降落PCR，PCR扩增的程序为 94°C预变性5min ；
94 °C 变性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s 72 0C 7min ；
前两步退火温度各10个循环，最后一步退火为15个循环。步骤5)所述的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓度为12%，所述的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的变性剂为尿素。
本发明有益效果本发明方法操作灵敏，结果准确，采用此方法在群体未发生马立克氏肿瘤前就可以进行基因组检测，以基因组的变化结果来判定是否发生马立克氏肿瘤， 减少鸡群发病的机率，提高群体的安全性，通过这种方法发现病因，可及时地进行针对性治疗。
图1为现有的诊断马立克病的引物IPCS，目的条带约为327bp，Marker 600bpr,以作为本发明的试验结果的对比；
图2为微卫星ABR107R MSI的变化的变性凝胶电泳图，L 淋巴细胞，1、2、3、4 ；不同的个体，M:DNA Marker (PUC18 DNA/MspI)；
图3为微卫星ABR204R MSI的变化的变性凝胶电泳图，L 淋巴细胞，1、2、3、4 ；不同的个体，M:DNA Marker (PUC18 DNA/MspI)；
图4为微卫星ABR495R MSI的变化的变性凝胶电泳图，L 淋巴细胞，1、2、3、4 ；不同的个体，M:DNA Marker (PUC18 DNA/MspI)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，首先分离样品抗凝血液中的淋巴细胞，再提取淋巴细胞中的基因组DNA ；然后设计微卫星引物，PCR扩增目的片段；最后对 PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。下述实施例中所用方法如无特殊说明为常规方法。实施例1
1、淋巴细胞的分离选择临床症状表现比较明显的鸡群，主要有肉眼可见的肿瘤块，采集Irnl抗凝血，保存在4°C冰箱，加入2ml淋巴分离液于试管底部，然后沿试管壁加入 Iml抗凝血液，在2500g/min条件下离心20min，用移液枪吸取中间层即淋巴细胞到另一干净的试管中，-20°C保存；
2、DNA的提取用细胞提取核酸DAN试剂盒提取淋巴细胞的DNA，按照试剂盒的说明书进行操作，并检测DNA的含量及纯度，提取的DNA的浓度为100 μ g / mL, 0D260/280为1. 7 ；
3、设计引物引物序列如下
上游引物 IPCS 5' -AAT GAG CGA ACT GCC TCA CAC AAC-3‘； 下游引物 IPCA 5' -GAT CGC CCA CCA CGA TTA CTA CCT-3‘； 引物是由上海英骏生物有限公司合成；
4、PCR扩增目的片段PCR扩增的体系为模板lyL，TaqDNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP 2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水补足25 μ L，PCR扩增的程序为
94°C预变性5min ； 94 °C 变性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s72 °C 7min ；
前两步退火温度各10个循环，最后一步退火为15个循环。5、对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测采用浓度为12%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶液配制(1 mm厚4板，50 ml):45%丙烯酰胺溶液12 ml，10XTBE缓冲液 5 ml，去离子水34 ml;尿素40 g，在55°C水浴，使尿素溶解并冷却至室温后，加入3 ml新配制的1. 6%过硫酸铵，然后加入TEMED，充分混勻；电泳结束后，将凝胶置于盛200 ml固定液的瓷盘中，固定5-10 min，固定后，取出凝胶放入染色液中重染色15-30 min，然后用去离子水冲洗两次，每次放在摇床上轻摇30 s ；最后用显色液显色直到条带出现为止，显色时间 5-10 min，用凝胶成像系统拍照，并分析各泳道情况，依据DNA Marker记录条带结果。实验结果出现预期条带327bp。6、测序将PCR产物纯化后测序，测序结果与Genbank上发表的马立克病强毒株的基因序列同源性达到99. 5%，说明这群鸡发生是马立克病。实施例2
1、淋巴细胞的分离同实施例1 ；
2、DNA的提取同实施例1；
3、设计微卫星引物根据选择微卫星位点ABR107进行引物设计，引物序列如下 上游引物 P1 5 ‘ -CCGTTACTGACTTCTGCTTT-3 ‘；
下游引物 p2:5' -TTTGTATTGGCTCCCTCATC-3‘； 引物是由上海英骏生物有限公司合成；
4、PCR扩增目的片段PCR扩增的体系为模板lyL，TaqDNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP :2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水补足25 μ L，PCR扩增的程序为
94°C预变性5min ； 94 °C 变性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s 72 0C 7min ；
前两步退火温度各10个循环，最后一步退火为15个循环。5、对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤同实施例1。实验结果如图2所示，说明发生马立克病时，鸡群的基因序列的微位星点发生相应的变化。实施例3
1、淋巴细胞的分离同实施例1 ；
2、DNA的提取同实施例1；
3、设计微卫星引物根据选择微卫星位点ABR204进行引物设计，引物序列如下 上游引物 P3 5 ‘ -TAAATAAAGGTGTTGGCAGTT-3 ‘；
下游引物 P4 5 ‘ -CAGATTGTTAAAATAGTTGGGTT-3 ‘； 引物是由上海英骏生物有限公司合成；
4、PCR扩增目的片段PCR扩增的体系为模板lyL，TaqDNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP :2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水补足25 μ L，PCR扩增的程序为 94°C预变性5min ； 94 °C 变性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s 72 0C 7min ；
前两步退火温度各10个循环，最后一步退火为15个循环。5、对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤同实施例1，实验结果如图 3所示说明发生马立克病时，鸡群的基因序列的微位星点发生相应的变化。实施例4
1、淋巴细胞的分离同实施例1 ；
2、DNA的提取同实施例1；
3、设计微卫星引物根据选择微卫星位点ABR495进行引物设计，引物序列如下 上游引物 p5 5 ‘ -TTGTACTGGGTAGCATTTGA-3 ‘；
下游引物 p6 5, -ACTCTTTGGCCTACTTTTCC-3 ‘； 引物是由上海英骏生物有限公司合成；
4、PCR扩增目的片段PCR扩增的体系为模板lyL，TaqDNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP :2 μ L，IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水补足25 μ L，PCR扩增的程序为
94°C预变性5min ； 94 °C 变性 30 s ； 55 退火 30 s ； 50 退火 30 s ； 45°C退火 30 s ； 68 0C 30 s 72 0C 7min ；
前两步退火温度各10个循环，最后一步退火为15个循环。5、对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤同实施例1。实验结果如图4所示，说明发生马立克病时，鸡群的基因序列的微位星点发生相应的变化。
序列表
<110>郑州后羿制药有限公司 <120> 一种检测马立克氏肿瘤的方法 <160>8
<170> PatentIn Version3.5 <210> IPCS <211> 24 <212> DNA<213>人工序列 <400>IPCS
aatgagcgaa ctgcctcaca caac24
<210> IPCA
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400>IPCA
gatcgcccac cacgattact acct24
<210> Pl
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P1
ccgttactga cttctgcttt20
<210> P2
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P2
tttgtattgg ctccctcatc20
<210> P3
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P3
taaataaagg tgttggcagt t21
<210> P4
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P4
cagattgtta aaatagttgg gtt23
<210> P5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400>P5
ttgtactggg tagcatttga20<210> P6 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400>P6
actctttggc ctacttttcc20
权利要求
1.一种检测马立克氏肿瘤的方法，其特征在于所述的检测方法包括以下步骤 1)分离样品抗凝血液中的淋巴细胞；2)提取淋巴细胞中的基因组DNA；3)设计微卫星引物；4)PCR扩增目的片段；5)对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
2.根据权利要求1所述的检测马立克氏肿瘤的方法，其特征在于步骤1)所述的淋巴细胞分离方法为先将淋巴分离液加于试管底部，然后沿试管壁加入抗凝血液，低速离心， 吸取中间层到另一干净于试管中，冷冻保存。
3.根据权利要求2所述的检测马立克氏肿瘤的方法，其特征在于所述的淋巴分离液与抗凝血液体积比为2:1。
4.根据权利要求1所述的检测马立克氏肿瘤的方法，其特征在于步骤4)所述的PCR 扩增的体系为模板lPL，Taq DNA聚合酶0. 4 μ L，上、下游引物各1 μ L，dNTP :2yL, IOXbuffer :2. 5 μ L，最后蒸水补足 25 μ L。
5.根据权利要求1所述的检测马立克氏肿瘤的方法，其特征在于步骤4)所述的PCR 扩增采用降落PCR，PCR扩增的程序为94°C预变性5min ；94 °C 变性 30 s ；55 退火 30 s ；50 退火 30 s ；45°C退火 30 s ；68 0C 30 s72 0C 7min ；前两步退火温度各10个循环，最后一步退火为15个循环。
6.根据权利要求1所述的检测马立克氏肿瘤的方法，其特征在于步骤5)所述的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓度为12%，所述的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的变性剂为尿素。
全文摘要
本发明公开了一种检测马立克氏肿瘤的方法，其步骤为分离样品抗凝血液中的淋巴细胞、提取淋巴细胞中的基因组DNA、设计微卫星引物、PCR扩增目的片段、对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，本发明方法操作灵敏，结果准确，采用此方法在群体未发生马立克氏肿瘤前就可以进行基因组检测，以基因组的变化结果来判定是否发生马立克氏肿瘤，减少鸡群发病的机率，提高群体的安全性，通过这种方法发现病因，可及时地进行针对性治疗。
文档编号C12Q1/68GK102453750SQ20101051369
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者吴红云, 李建正, 郭俊清 申请人:郑州后羿制药有限公司