专利名称：HER2/neu-特异性抗体和其使用方法
HER2/neu-特异性抗体和其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2008年4月2日提交的美国专利申请系列第61/041，649号(待决) 的优先权，通过引用将其整体并入本文。序列表的引用根据37C. F. R. 1. 821以及其下列，本申请包含一个或多个序列表，它们已在纸件 和计算机可读介质中公开，并且所述纸件和计算机可读公开内容通过引用整体并入本文。发明背景发明领域本申请涉及特异性结合HER2/neU的新颖4D5抗体，尤其是HER2/neU的新颖嵌合 4D5抗体，所述新颖4D5抗体与已知的4D5抗体相比具有减少的糖基化和改变的效应子功 能。本发明还涉及抗体和包含它们的组合物用于下列疾病的诊断、预后和治疗的方法例 如，癌症、自身免疫疾病、炎性疾患和传染病。相关技术说明HER2/neu 和 HER2/neu 受体细胞生长和分化过程涉及生长因子，生长因子通过特异性受体如酪氨酸激酶发 挥它们的作用。配体与酪氨酸激酶受体的结合触发最终导致细胞增殖和分化的事件级 联。(Carpenter 等人(1979)Biochem. 48 :193-216 ；Sachs 等人(1987) Cancer Res. 47 1981-8196)。酪氨酸激酶受体根据它们的序列相似性和不同特征可以分为几组。一种 这类家族是ErbB或表皮生长因子受体家族，该家族包括多种受体，它们称为HER-I (也 称为 erbB-Ι 或 EGFR)、HER-2 或 HER2/neu(也称为 erbB-2、c-neu 或 pl85)、HER-3 (也 称为erbB-3)和HER_4(也称为erbB_4)。(参见，例如，Carpenter等人，如上；Semba等 人(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 82 :6497-6501 ；Coussens 等人(1985) Science, 230 :1130-1139, Bargmann 等人(1986)Cell 45 :649-657 ；Kraus 等人(1989)PNAS 86 9193-9197 ；Carraway 等人(1994) J. Biol. Chem. 269 :14303-14306 ；和 Plowman 等人(1993) Nature 366 :473-475 ；Tzahar 等人(1994)Biol. Chem. 269 :25226-25233)。在正常发育过程和人肿瘤发生二者中ErbB受体在传播调节细胞增殖、分化、迁移 和凋亡的信号中起重要作用。(Slamon等人(1989) kience244 :707-712)。例如，erbB受体 的激活偶联并刺激下游MAPK-Erkl/2和磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT生长和存活途径。在 癌症中这些途径的失调与疾病进展和治疗不应性相联系。(Fukazawa等人(1996) J.Biol. Chem. 271 :14554-14559 ；Tzahar 等人(1996)Mol. Cell. Biol. 16:5276-5287 ；Lange 等 人(1998)J. Biol. Chem. 273 :31308-31316 ；Olayioye ^ 人(1998)Mol. Cell. Biol. 18 5042-5051 ；Hackel 等人(1999)Curr. Opin. Cell Biol. 11 :184-189)。PI3K/AKT 的激活促 进细胞存活和肿瘤侵袭性增强，并且据报道在过表达HER2/neU的乳癌中AKT2被激活并过 表达。(Shak (1999) Semin. Oncol. Suppl 12 :71-77 ；Huang 等人(2000) Clinical Cancer Res. 7 :2166-2174 ；Bacus 等人(2002) Oncogene 21 :3532-3540)。
受体ErbB家族的信号传导由配体结合启动，配体结合触发同源或异源受体二聚 化、胞质尾部的相互酪氨酸磷酸化和胞内信号转导途径的激活。(Citri等人00(Χ3)ΕΧρ. Cell Res. 284 :54)。结合并激活ErbB受体的配体的有效性是由多种金属蛋白酶介导的，如 催化特异性蛋白的细胞表面胞外域脱落的ADAM(解联蛋白和金属蛋白酶)家族的锌依赖性 金属蛋白酶。(参见 Chang 和 WerM200l)Trends in Cell Biology 11 :537-543 ;Moss 和 Lambert(2002)Essays in Biochemistry 38 :141-153 ;Seals 禾口 Courtneidge(2003)Genes and Development 17:7-30)。具体地，据显示ADAM家族切割负责激活ErbB受体的配体，例 如 APP 和 Notch。(Blobel(2005)Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6 :32-43)。ErbB家族的一个重要成员HER2/neu是185kDa的受体蛋白，它最初是作为来自化 学处理的大鼠的神经母细胞瘤的转化基因的产物鉴定的。HER2/neU由于其在几种人的癌中 和在哺乳动物发育中的作用而被广泛地研究。(Hynes和Mem(1994)Biochim. et Biophys. Acta 1198 :165-184 ；和 Dougall 等人(1994) Oncogene 9 :2109-2123 ；Lee 等人(1995) Nature378 :394-398)。人 HER2/neu 基因和 HER2/neu 蛋白描述于 kmba 等人(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )82 :6497-6501 和 Yamamoto 等人(I986)Nature 319 :230-234 中 并且其序列可以在GenBank中以登录号X03363获得。HER2/neu包含四个结构域配体结 合的胞外结构域；亲脂的跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和羧基端信号传导 结构域，该结构域具有可以被磷酸化的几个酪氨酸残基。(Plowman等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )90 :1746-1750)。HER2/neu 胞外(ECD)结构域的序列由 Franklin 等人 (2004) Cancer Cell. 5(4) :317-3 描述，并且可以在蛋白数据库记录(Protein DataBank Record) 1S78(2004)中获得。HER2/neU充当生长因子受体并且通常由诸如乳癌、卵巢癌和肺癌等肿瘤表达。 HER2/neU在25-30%的人乳癌和卵巢癌中过表达，并且与这些患者中的侵袭性临床进展或 弱的预后相关。(Slamon 等人(1987) Science 2；35 ； 177-182 ;Slamon 等人(1989) Science 244 :707-712)。已在其他癌中观察到HER2/neu的过表达，所述其他癌症包括胃癌、子宫 内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和膀胱癌。(参见，例如King等 人(1985)kience 229 :974 ；McCann 等人(1990) Cancer 65 :88-92 ；Yonemura 等人(1991) Cancer Research 51:1034)。HER2/neu的激活与在乳癌患者中对激素治疗的临床反应性降低相关。(Wright 等人(1989) Cancer Res. 49 :2087-2090 ；Kurokawa & Arteaga (2001) Clin. Cancer Res. 7 4436s-42s，4411s-4412s)。实际上，HER2/neu表达足以传达抗雌激素抗性。(Benz等人 (1993) Breast Cancer Res. Treat. 24 :85-95)。HER2/neu 和 HER-3 似乎还参与了前列腺癌 患者中激素抗性的发病。大约三分之一的前列腺癌患者接受以破坏睾丸和肾上腺雄激素为 目的的激素治疗。对于乳癌，抗性是不可避免的。最近的数据表明，由HER2/neU和HER-3所 发出的信号诱导“激素-不应”状态。(Mellinghoff等人(2004) CancerCell 6:517-527)。已经知道几种截断和剪接形式的HER2/neu。例如，位于一些胃癌细胞的核周胞 质的截断ECD是通过使用内含子中的多聚腺苷酸化信号产生的替代性转录物来制备的。 (Yamamoto 等人(1986)Nature 319 :230-234 ；和 Scott 等人(1993)Mol. Cell. Biol. 13 2247-2257)。还没有可归因于这种截短E⑶多肽的具体治疗、诊断或研究效用。HER2/neU 的ECD还可以以蛋白水解的方式从培养的乳癌细胞脱落，并且它出现在一些癌症患者的血清中，此时它可以是转移性乳癌的和总体差预后的血清标记物。(Petch等人(1990)Mol. Cell. Biol. 10 :2973-2982 ；Leitzel 等人(1992) J. Clin. Oncol. 10 :1436-1443 ；Scott 等人 (1993)Mol. Cell. Biol. 13 :2247-2257 ；和 Lee 和 Maihle (1998) Oncogene 16 :3243-3252)。 在一些过表达HER2/neu的肿瘤细胞中，熟知的金属蛋白酶激活剂乙酸4-氨基苯汞(APMA) 激活诸如ADAMlO和ADAM15等金属蛋白酶以将HER2/neU受体切割成两部分截断的膜结 合受体，称为P95 ；和可溶性E⑶，称为pl05或E⑶105。(参见，例如，Molina等人Q001) Cancer Res. 61 :4744-4749 ；美国专利公布第2004/0247602号)。ECD的丢失使得p95受体 成为组成型活性的酪氨酸激酶，该组成型活性的酪氨酸激酶可以递送生长和存活信号给癌 细胞。(参见，例如，美国专利第6，M1，214号)。研究已显示在过表达HER2/heu的乳癌细胞中，用HER2/neu特异性抗体与化疗剂 (例如，顺钼、阿霉素(doxoubicin)、紫杉醇)组合治疗引发了比用单独的化疗剂治疗更高 的细胞毒性反应。(Hancock 等人(1991)CancerRes. 51 :4575-4580 ；Arteaga 等人(1994) Cancer 54 :3758-3765 ；Pietras 等人(1994)Oncogene 9 :1829-1838)。HER2/neu 抗体可 以增强对化疗剂的反应的一个可能机制是通过HER2/neU蛋白表达的调控或通过DNA修复 的干扰。Gtancovski 等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. Α.) 88 :8691-8695 ；Bacus 等 人(1992)Cell Growth & Diff. 3 :401-411 ；Bacus等人(1993)Cancer Res. 53 :5251-5261 ； Klapper 等人(1997)Oncogene 14 :2099-2109 ；Klapper φ 人 U000)Cancer Res. 60 3384-3388 ;Arteaga 等人(2001) J ClinicalOncology 19 (18s) :32s_40s)。已经开发了靶向HER-I或HER2/neu的大量单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑 制剂。例如，称为4D5的鼠单克隆抗体识别与跨膜区极为接近的HER2/neU富半胱氨酸结 构域II中的胞外表位(氨基酸5 至627)。如通过受体磷酸化测定所测量的，用4D5进 行的乳癌细胞治疗部分阻断HER2/neu-HER-3复合体的NDF/heregulin激活。(Carter等 人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A. )89 :4285-4289 ；Sliwkowski 等人(1999) Sem. inOncol. 26 :60-70 ；Ye 等人(1999)Oncogene 18 :731-738 ；Vogel 等人(2001)Oncology 61(增刊 2) :37-42 ;Vogel 等人 Q002) Journal of Clinical 0ncology20 (3) :719-726; Fujimoto-Ouchi 等人 O002) Cancer Chemother. Pharmacol. 49 :211-216)。然而，给人施用 4D5是临床上失败的，因为患者会迅速地出现HAMA反应，因此开发了人源化形式。人源化抗 体4D5的序列和晶体结构已在美国专利第6，054, 297号；Carter等人，如上；和Eigenbrot 等人(1993) J. Mol. Biol. 229 :969-95 中描述。开发了称为曲妥单抗(由Genentech，Inc.以赫赛汀 销售)的人源化形式 的4D5，并且它已被批准用于治疗涉及HER2/neU的过表达或基因扩增的癌症，包括乳癌。 (Cobleigh 等人(1999) J. Clin. Oncol. 17 :2639-2648)。曲妥单抗在体外抑制 ΑΡΜΑ 介导 的HER2/neu向E⑶和p95部分的切割，并且相信它在体外通过不同的机制起作用，包括 可能抑制 HER2/neu 脱落。(Pegram 等人(1998) Journal of Clinical Oncology 16(8) 2659-2671 ;Baselga 等人 OOOlWeminars in Oncology 28(5)(增刊 16) :4-11 ；Baselga 等人(2001)Annals of Oncology 12(增刊1) :S35_S41)。然而，曲妥单抗治疗具有许多缺 点，如在一些患者中的心脏毒性和HAHA反应的出现。因此，仍然存在对于用于癌症治疗的新的或改进形式的HER2/neU抗体的需求，例 如具有增加的亲和力或特异性、降低的HAMA或HAHA反应的可能、改变的效应子功能和类似特征的4D5抗体。Fc 受体抗体-抗原复合体与免疫系统的细胞的相互作用导致了广泛的一系列的反应，其 范围从效应子功能如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱颗粒和吞噬作用到免疫调节信号， 如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌。所有这些相互作用均是通过抗体的Fc结构域或免疫复 合体与Fc受体的结合启动的，Fc受体是造血细胞上的特化的细胞表面受体。由抗体和免 疫复合体所触发的细胞反应的多样性是由Fc受体的结构不均一性产生的。Fc受体共同拥 有结构上相关的配体结合结构域，该结构域大概介导细胞内信号传导。免疫球蛋白基因超家族的蛋白成员Fc受体是可以结合免疫球蛋白分子的Fc部 分的表面糖蛋白。该家族的每个成员通过Fc受体的α链上的识别结构域识别一种或多 种同种型的免疫球蛋白。Fc受体是由他们对免疫球蛋白亚型的特异性定义的。IgG的Fc 受体称为"Fe y R”，IgE的Fc受体称为"F ε R”并且IgA的Fc受体称为"Fe α R”。不同的 佐细胞拥有不同同种型抗体的Fc受体，并且抗体的同种型决定了哪些佐细胞将参与给定 的反应(Billadeau 等人(2002) J. Clin. Investigat. 2 (109) :161-81 ；Gerber 等人(2001) Microbes Infection 3 :131-139 ；Ravetch 等人(2001)Annu. Rev. Immunol. 19 :275-90 ； Ravetch 等人(2000) Science 290:84-89 ；Ravetch (1994) Cell78(4) :553-560 ；Ravetch ^ 人(1991) Annu. Rev. Immunol. 9 :457-492 ；还参见，Immunobiology :The Immune System in Health and Disease (免疫生物学健康与疾病中的免疫系统)(第4版，1999年)Jlsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York)。各种受体的总括呈现在表 1 中。
权利要求
1.一种多肽，所述多肽包含含有N65S取代的嵌合4D5免疫球蛋白轻链。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含具有SEQID NO :4的氨基酸序列的轻 链可变结构域。
3.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽具有SEQID NO :2的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3任一项所述的多肽，其中所述多肽是抗体。
5.如权利要求4所述的抗体，其中所述抗体包含在Fc结构域中具有至少一种修饰的变 体Fc结构域。
6.如权利要求5所述的抗体，其中所述修饰包含选自由下列组成的组的至少一个取 代L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396L。
7.如权利要求6所述的抗体，其中所述修饰包括(A)选自由下列组成的组的至少一个取代F243L、D270E、R292P、S298NJ300L、V305I、 A330V 和 P396L ；(B)选自由下列组成的组的至少两个取代FM3L和P396L；FM3L和R292P ；以及R292P 和 V305I ；(C)选自由下列组成的组的至少三个取代F243L、R292P和Y300L；F243L、R292P和 V305I ；F243L、R292P 和 P396L ；以及 R292P、V305I 和 P396L ；或(D)选自由下列组成的组的至少四个取代FM3L、I^92P、Y300L和P396L；以及F243L、 R292P、V305I 和 P396L。
8.如权利要求7所述的抗体，其中所述抗体包括下列取代(A)F243L.R292P和 Y300L ；(B)L235V,F243L、R292P、Y300L和 P396L ；或(C)F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396L。
9.如权利要求5所述的抗体，其中所述变体Fc结构域与野生型Fc结构域相比表现出(A)增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；(B)增加的与Fcy RIIA或与Fc y RIIIA的结合；(C)降低的与Fcy RIIB的结合；或(D)增加的与Fcy RIIB的结合。
10.一种多肽，所述多肽包含免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含具有选自由 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 13组成的组的氨基酸序列的可变结构域。
11.一种多肽，所述多肽包含含有下列的4D5免疫球蛋白重链(A)选自由下列组成的组的至少一个取代F243L、D270E、R292P、S298NJ300L、V305I、 A330V 和 P396L ；(B)选自由下列组成的组的至少两个取代(1)F243L和 P396L ；(2)F243L和 R292P ；以及(3)R292P和 V305I ；(C)选自由下列组成的组的至少三个取代(1)F243L、R292P和 Y300L ；(2)F243L、R292P和 V305I ；(3)F243L、R292P 和 P396L ；以及(4)R292P.V305I和 P396L ；(D)选自由下列组成的组的至少四个取代(1)F243L、R292P、Y300L 和 P396L ；以及(2)F243L、R292P、V305I和P396L ； 或(E)至少F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396 取代。
12.如权利要求11所述的多肽，其中所述多肽是抗体。
13.如权利要求4或5所述的抗体，其中所述抗体还包含免疫球蛋白重链，所述免疫球 蛋白重链包含具有 SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO 13 的氨基酸 序列的可变结构域。
14.如权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包括(A)选自由下列组成的组的至少一个取代F243L、D270E、R292P、S298NJ300L、V305I、 A330V 和 P396L ；(B)选自由下列组成的组的至少两个取代(1)F243L和 P396L ；(2)F243L和 R292P ；以及(3)R292P和 V305I ；(C)选自由下列组成的组的至少三个取代(1)F243L、R292P和 Y300L(2)F243L、R292P和 V305I(3)F243L、R292P 和 P396L ；以及(4)R292P.V305I和 P396L(D)选自由下列组成的组的至少四个取代(1)F243L、R292P、Y300L 和 P396L ；以及(2)F243L、R292P、V305I和P396L ； 或(E)至少F243L、R292P、Y300L、V305I 和 P396 取代。
15.如权利要求13所述的抗体，其中所述免疫球蛋白轻链包含具有SEQID NO :4的氨 基酸序列的可变结构域，并且所述免疫球蛋白重链包含SEQ ID NO 9,SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 13的氨基酸序列。
16.如权利要求5、6、7、8、9、13、14或15任一项所述的抗体，其中所述抗体是F(ab')2 片段、F(ab)片段、单链抗体、单克隆抗体或双体。
17.如权利要求5、6、7、8、9、13、14、15或16任一项所述的抗体，其中。
18.如权利要求5、6、7、8、9、13、14、15或16任一项所述的抗体在制备用于治疗患者的 癌症的药物中的用途。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述癌症是表达HER2/neu的癌症并且其中所述抗 体结合人HER2/neu。
20.如权利要求18或19任一项所述的用途，其中所述治疗还包括与所述抗体同时或顺序施用第二治疗剂的步骤，其中所述第二治疗剂选自由下列组成的组抗血管发生剂、抗肿 瘤剂、化疗剂和细胞毒性剂。
全文摘要
本发明涉及特异性结合HER2/neu的抗体，并且尤其是HER2/neu的嵌合4D5抗体，所述4D5抗体与已知的4D5抗体相比具有减少的糖基化。本发明还涉及4D5抗体和包含它们的组合物用于下列疾病的诊断、预后和治疗的方法例如，癌症、自身免疫疾病、炎性病患和传染病。
文档编号C12P21/08GK102046195SQ200980119403
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月25日 优先权日2008年4月2日
发明者埃兹奥·泊韦尼, 纳丁·泰朗, 莱斯利·S·约翰逊, 菱·黄 申请人:宏观基因有限公司