通过赖氨酸环化制备α-氨基-ε-己内酰胺的制作方法

专利名称：通过赖氨酸环化制备α-氨基-ε-己内酰胺的制作方法
通过赖氨酸环化制备α _氨基_ ε _己内酰胺本发明涉及制备α-氨基-ε-己内酰胺(下文也称作ACL)的方法。本发明还涉 及其中ACL被用于制备ε-己内酰胺(下文称作“己内酰胺”)的方法。本发明还涉及可用 于制备ACL或己内酰胺的宿主细胞。己内酰胺是一种内酰胺，其可以被用于生产聚酰胺，例如尼龙_6或尼龙-6，12 (己 内酰胺和十二内酰胺的共聚物)。由大量化学品制备己内酰胺的多种方式是本领域已知的， 它们包括由环己酮、甲苯、苯酚、环己醇、苯或环己烷制备己内酰胺。这些中间产物化合物通 常得自矿物油。考虑到使用更加可持续的技术来制备材料的日益增长的需要，人们期望提 供一种方法，其中由能够从生物来源获得的中间产物化合物或至少由使用生物化学方法被 转化成己二酸或己内酰胺的中间产物来制备己内酰胺。另外，想要提供一种方法，所述方法 比利用来自石油化学来源的大量化学品的传统化学工艺需要更少能源。由6-氨基己酸(6-ACA)制备己内酰胺是已知的，例如如US-A 6，194，572中所述。 如TO 2005/068643中所公开的，可以在存在具有α，β -烯酸酯还原酶活性的酶时，通过转 化6-氨基己-2-稀酸(6-ΑΗΕΑ)以生物化学方式制备6-ACA。可以例如以生物化学方式或 通过纯化学合成，由赖氨酸制备6-ΑΗΕΑ。尽管可以通过WO 2005/068643中公开的方法通过 6-ΑΗΕΑ的还原来制备6-ACA，但是本发明人发现在还原反应条件下，6-ΑΗΕΑ可自发并且基 本不可逆地环化形成不想要的副产物，特别是β-高脯氨酸。所述环化可以是6-ACA生产 中的瓶颈，其导致相当大的产率损失。本发明的一个目的是提供用于制备己内酰胺的新颖方法，所述方法可以作为已知 方法的替代方式。本发明尤其有一个目的是提供用于制备下述中间产物化合物的新颖方 法，所述中间产物化合物可以被用于制备己内酰胺。本发明的又一个目的是提供克服一种或多种上文提到的缺点的新颖方法。本发明的又一个目的是提供用于制备己内酰胺或用于制备己内酰胺的中间产物 化合物的新颖发酵方法。根据本发明可解决的一个或多个其他目的可根据下文的说明书获知。目前已发现，可从特定的起始化合物以生物催化方式制备己内酰胺或用于制备己 内酰胺的中间产物化合物。因此，本发明涉及用于制备α-氨基-ε-己内酰胺(ACL)的方法，所述方法包括 将赖氨酸转化成α _氨基_ ε _己内酰胺，其中所述转化由生物催化剂催化。本发明还涉及由α-氨基-ε-己内酰胺制备己内酰胺的方法。本发明基于下述认识可从赖氨酸或从可通过赖氨酸的环化获得的产物以生物催 化方式制备己内酰胺。本发明人认为尤其出乎意料的是，根据本发明的方法也可以在水性环境中，例如 在细胞内环境中进行。可以预期，大量水的存在(如典型地存在于(活)生物内的那样)， 会将从赖氨酸到ACL的反应平衡驱动至赖氨酸侧。毕竟，本质上赖氨酸的闭环是其中形成 肽键的反应。通常在水性环境中，酶促水解是在动力学上比酶促肽键形成更受欢迎的反应。通过下述事实进一步阐述本发明的预料不到的特性针对天然微生物在科学文献和数据库中进行的彻底搜索未能找到任何关于能将赖氨酸转化成ACL的已知生物的报道。根据本发明，未注意到关于在形成ACL以及任选地形成己内酰胺时中间产物的不 想要的环化的问题，这导致产率的损失。在本发明的一个有利的实施方案中，ACL或己内酰胺是发酵制备的。除非另有说明，在本文中使用的术语“或者”表示“和/或”。在本文中使用的术语“一个”(“a”或“an”)表示“至少一个”。提到单数名词(例如一种化合物、一种添加剂等)时，复数旨在被包括在内。因此， 除非另有说明，当涉及特定的名词例如“化合物”时，表示“至少一种”所述名词，例如“至少 一种化合物”。提到存在立体异构体的化合物时，所述化合物可以是任何这类立体异构体或其组 合。因此，提到例如存在对映异构体的ACL或氨基酸时，所述ACL或氨基酸可以是L-对映 异构体、D-对映异构体或其组合。存在天然立体异构体时，化合物优选地是天然立体异构 体。在本文中提到羧酸或羧酸酯例如6-ACA、另外的氨基酸或脂肪酸时，这些术语旨 在包括质子化的羧酸、它们相应的羧酸酯(其共轭碱)及其盐。在本文中提到氨基酸例如 6-ACA时，所述术语旨在包括其两性离子(zwitterionic)形式的氨基酸(其中氨基是质子 化的形式且羧酸酯基是去质子化的形式)，其中氨基是质子化的且羧基为其中性形式的氨 基酸，和其中氨基为中性形式且羧酸酯基是去质子化形式的氨基酸，以及它们的盐。类似 地，提到胺(例如赖氨酸或另外的氨基酸或ACL)时，这旨在包括质子化的胺(典型地为阳 离子的，例如R-NH3+)和非质子化的胺(典型地不带电荷，例如R-NH2)。当使用括号中的酶种类(EC)提到酶时，所述酶种类是以Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biο1οgy(NC-1UBMB)提 供的Enzyme Nomenclature为基础，将酶归类或可以归类在其中的种类，所述命名法可见 http //www, chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/。(尚)未归类但是可以同样被归类于特定 种类中的其他合适的酶也旨在包括在内。术语“同源物”在本文中尤其用于具有至少30%、优选地至少40%、更优选地至少 60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、尤 其是至少85 %、更尤其是至少90 %、至少91 %、92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少 96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的多核苷酸或多肽。术语同源物也旨 在包括由于遗传密码子的简并性而与另外的核酸序列(多核苷酸序列)不同但编码相同多 肽序列的核酸序列(多核苷酸序列)。序列同一性或相似性在本文中被定义为两条或更多条多肽序列或两条或更多条 核酸序列(多核苷酸序列)之间的相互关系，这是通过比较所述序列来测定的。通常，序 列同一性或相似性是在序列全长上比较的，但是也可以仅在彼此对齐的序列的一部分上比 较。在本领域中，“同一性”或“相似性”也表示多肽序列或核酸序列(多核苷酸序列)之间 的序列相关性程度，根据情况由这类序列串之间的匹配来确定。测定同一性或相似性的优 选方法被设计为在测试的序列之间给出最大匹配。在本发明的上下文中，测定两条序列之 间同一性和相似性的一种优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN (Altschul，S. F. et al.，J. Mol. Biol. 1990，215，403-410)，公众可以从 NCBI 和其他来源(BLAST Manual,Altschul, S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)获得。使用 BLASTP 进行多肽序 列比较的优选参数为缺口开放10. 0，缺口延伸0. 5，Blosum 62矩阵。使用BLASTN进行核 酸序列比较的优选参数为缺口开放10. 0，缺口延伸0. 5，DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。在本发明的方法中，使用生物催化剂，即所述方法中至少一个反应步骤由生物材 料或来自生物来源的部分(例如来自生物来源的生物或生物分子)催化。生物催化剂可尤 其包含一种或多种酶。生物催化剂可以以任何形式使用。在一个实施方案中，使用从天然 环境中分离(从生产它们的生物中分离)的一种或多种酶，例如作为溶液、乳液、分散液、冻 干细胞(悬浮液)、作为裂解物或固定在支持物上。在一个实施方案中，一种或多种酶形成 活生物的一部分(如活的完整细胞)。酶可在细胞内发挥催化功能。酶还可能被分泌进所 述细胞存在的培养基中。活细胞可以是生长中的细胞、静止或休眠细胞(例如孢子)或稳定期细胞。还可 能使用酶形成通透化(即，使其对酶的底物或一种或多种酶的底物前体通透)的细胞的部 分。本发明方法中使用的生物催化剂原则上可以是任何生物，或得自或源于任何生 物。生物可以是真核生物或原核生物。具体地，所述生物可选自动物(除人之外，至少在生 物本身的使用被涉及的生物中)、植物、细菌、古细菌、酵母和真菌。合适的生物催化剂或其 部分原则上也可以来自人。具体地，酶可得自或源于用于本发明方法中的人细胞材料。在一个实施方案中，生物催化剂例如酶可源自动物，尤其源自其部分，例如肝、胰、 脑、肾或其他器官。动物可尤其选自无脊椎海洋动物，更尤其选自海绵(Porifera)，尤其选 自 Demospongiaeλ Pachastrellidae 或 Jaspidae,例如 Jaspis sp.、Pachastrella sp.、 Poecillastra sollasi、Choristidae 和哺乳动物，更尤其是选自 L印oridae、Muridae、 Suidae和Bovidae的组的哺乳动物。合适的细菌可尤其选自下组Pseudomonas、Bacillus、Escherichia、 Ochrobactrum、CitrobacterΛ Klebsiella、Mycobacterium、Providencia、AchromobacterΛ Rhodococcus、Myxococcus、Enterobacter、Methylophilus、Streptomyces、Nocardia、 Thermus 禾口 Alcaligenes0合适的真菌可尤其选自Aspergillus、Tremella和Periconia的组。合适的酵母可尤其选自 Candida、Saccharomyces、Kluyveromyces、Cryptococcus 禾口 Trichosporon 的组。本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的天然 存在的生物催化剂(野生型)或天然存在的生物催化剂的突变体。可以通过本领域技术人员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计 (rational design)改进天然存在的生物催化剂的特性。可例如通过使用本领域技术人员 已知的诱变技术(随机诱变、定点诱变、定向进化、基因重组等)修饰下述生物的编码DNA 来制造野生型生物催化剂的突变体，所述生物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生 物催化剂部分(如酶)。具体地，可以修饰DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸 的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得 突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者影响合适的(宿主)细胞中藉此被修饰的DNA 的表达。后者可以通过本领域技术人员已知的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于WO 2008/000632中所述的方法。WO 2003/010183公开了一种尤其合适的制备变
体多核苷酸的方法，其中使用对多核苷酸起始种群的诱变以及对经突变的多核苷酸加以重 组的组合。突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面针对底 物的选择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、PH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利 用和底物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员 已知的这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。提到来自具体来源的生物催化剂(尤其是酶)、来自第一生物但是实际上在(经遗 传修饰的)第二生物中生产的重组生物催化剂(尤其是酶)时，特定地旨在包括来自所述 第一生物的生物催化剂(尤其是酶)。根据本发明的方法，ACL通过环化赖氨酸制备，其中所述环化由生物催化剂催化。 原则上，可以使用D-赖氨酸、L-赖氨酸或其混合物。通过环化这些赖氨酸形成了 D-ACL、 L-ACL或其混合物。在实践中L-赖氨酸是优选的。环化反应中使用的生物催化剂优选地包含具有赖氨酸环化酶活性的酶。例如，可 以使用来自上文提到的生物的具有赖氨酸环化酶活性的酶。具体地，能够催化赖氨酸环化成为ACL的酶可选自水解酶(EC 3)的组。水解酶 优选地选自作用于酯键的水解酶(酯酶)(EC 3. 1)和作用于除肽键之外的碳-氮键(EC 3. 5)的水解酶的组。酯酶可尤其选自羧酸酯水解酶(EC 3. 1. 1)的组，更尤其选自羧基酯酶 (EC 3.1. 1.1)，优选地选自猪肝酯酶。EC 3. 5类的酶可尤其选自主要作用于线性酰胺(EC 3. 5. 1)的水解酶组。主要作用于线性酰胺的水解酶(如酰胺酶)可尤其是来自Ochrobactrum、 Rhodococcus、Enterobacter、Thermus> Klebsiella、Aspergillus、Methylophilus 或 Mycobacterium的此类水解酶。更尤其可使用来自下述生物的主要作用于线性酰胺 的水解酶(如酰胺酶)，所述生物选自下组0chrobactrum anthropi、Rhodococcus erythropo1is>Enterobacter cloacae、Thermus sp. ^Klebsiella terrigena>Klebsiella oxytoca、Aspergillus nidulans、Methylophilus methylotrophus 禾口 Mycobacterium smegmatis。 * 自 Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321 的酉先月安自 Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540的酰胺酶在其中ACL还被用于制备己内酰胺的方法中是尤其 有利的。这类酰胺酶可尤其包含根据Sequence ID 4,Sequence ID 6的氨基酸序列或其同 源物。另外，可使用US 2005/0079595或EP-A 1 409 667中所述酰胺酶进行环化反应， 所述参考文献中与具有赖氨酸环化酶活性的酶和编码这类酶的基因相关的内容通过引用 并入本文。另外，EC 3.5类的酶也尤其选自主要作用于环状酰胺中C-N键的水解酶(EC 3.5.2)(也可称作内酰胺酶)的组，尤其选自赖氨酸内酰胺酶(EC 3.5.2.11)的组。具体地，内酰胺酶(即在环状酰胺中发挥作用的水解酶)可选自L-赖氨酸-1， 6-内酰胺水解酶(EC 3. 5. 2. 11)和6-氨基己酸酯-环状二聚体水解酶(EC 3. 5. 2. 12)等寸。在一个实施方案中，内酰胺酶，尤其是L-赖氨酸内酰胺酶选自来自Aspergillus、Cryptococcus> Candida、Citrobacter> Trichosporon、Tremella 禾口 Providencia 白勺内酉先 胺酶的组。更具体地，所述内酰胺酶可选自来自Aspergillus ustus、Aspergillus niger、 Cryptococcus laurentii> Candida humicola、 Citrobacter freundii> Trichosporon cutaneum、Tremella fuciformis、Tremella aurentia、Tremella foliacea、Tremella sub;anom;ali;a 禾口 Providencigi alcalifaciens _ Μ Ι安在一个实施方案中，内酰胺酶，尤其是6-氨基己酸酯-环状二聚体水解酶(EC 3.5.2. 12)是下述来自Alcaligenes的内酰胺酶，例如来自Alcaligenes Iactamlytics或 来自 Achromobacter,例如来自 Achromobacter xerosis 或 Achromobacter guttatus。脂肪酶可尤其选自来自哺乳动物的脂肪酶，如猪脂肪酶、牛脂肪酶等等。具体地， 本发明方法中使用的脂肪酶可以是胰脂肪酶。脂肪酶可商业获得，例如猪胰脂肪酶可得自 Rohm (产品目录号7023C)或得自Sigma(产品目录号L-3126)。本领域技术人员已知， 商业猪肝酯酶(PLE)制剂，例如可作为悬浮液(产品目录号E2884)或粉末形式(产品目录 号E3019)得自Sigma的商业猪肝酯酶(PLE)制剂通常是酶(尤其是猪肝酯酶)的混合物。 认为PLE制剂中这些同工酶中的一种或多种负责将赖氨酸生物转化成ACL。本领域技术人 员知道如何在需要时在合适的宿主中分离、克隆猪肝酯酶同工酶和/或将猪肝酯酶同工酶 表达进合适的宿主中。在一个实施方案中，可以使用非核糖体肽合酶(NRPS)来环化赖氨酸。已知 次级代谢产物生产者通过非核糖体肽合酶(NRPS)来合成肽。NRPS被详细描述于例如 "Assembly-Line Enzymology for Polyketide and Nonribosomal Peptide Antibiotics Logic, Machinery, and Mechanisms"Michae1 A.Fischbach and Christopher T. Walsh, Chem. Rev. 2006，106，3468-3496 和 W0/00/58478 中。在一些情况下，与 NRPS 的一些部分类 似的生物催化剂也被用于生产经修饰的氨基酸(例如，作为尼柯霉素X中咪唑啉酮基元前 体的新生霉素和羟基组氨酸中的氨基香豆素)，作为次级代谢产物的构建块。在细菌 和低级真菌中，生产次级代谢产物所需的生物合成基因典型地在基因组上一个基因座中成 簇。具体地，在使用NRPS的一个实施方案中，NRPS可以是模块非核糖体肽合酶，所述合酶 包含赖氨酸特异性腺苷酸化结构域、肽基运载体结构域和硫代酯酶/环化结构域。在一个特定的实施方案中，用于将赖氨酸环化成ACL的生物催化剂可被发现于下 述基因族中，所述基因族编石马 bengamides、nocardiamycins、capuramycins、circinatins 或含有次级代谢产物的任何其它ACL或ACL-衍生物的生物合成。此类基因簇可存在于生 产这类化合物的任何微生物或其微生物内共生体中。可使用来自已知生物合成通路的信息 通过本领域普遍已知的方法容易地鉴定此类基因簇，所述方法例如为基因组扫描、全基因 组测序、使用简并引物的PCR或Southern杂交。特定的生物催化剂可由截短的NRPS模块 构成，所述NRPS模块由赖氨酸活化特异性腺苷酸化结构域、肽基运载体结构域和特异性环 化结构域构成。预期该环化结构域与催化环状非核糖体肽(如短杆菌酪肽(tyrocidin)) 大环化(macrocyclisation)的已知硫代酯酶同源。预期赖氨酸环化特异性的环化结构域 含有允许其与其它环化硫代酯酶或硫代酯酶结构域差异化的特异性签名基序。赖氨酸环化 所需的结构域可由一个开放读码框编码，得到模块生物催化剂，或者在单独的开放读码框 中编码，得到单独的蛋白质，所述单独的蛋白质一起形成生物催化剂。在本发明中使用这类 生物催化剂可以是有利的，因为所述反应与ATP的水解偶联，并因此(至少基本上)是不可逆的。在本发明方法中制备的ACL可用于制备己内酰胺。这可以以化学方式完成，例如 使用羟胺-ο-磺酸和氢氧化钾或氢氧化钠在水、醇或其混合物中进行脱氨基来完成。合适 的制备方法和随后的纯化步骤例如描述于WO 07/99029中。在一个实施方案中，在本发明方法中制备的ACL被转化成(Z)-6，7- 二氢-IH-氮 杂卓-2(5H)_酮(6，7-DA0)。这可以化学方式完成，或由生物催化剂催化。6，7_DA0可被用 作为用于制备己内酰胺的中间产物化合物。6，7-DA0可尤其在下述方法中由ACL制备，所述方法包括通过生物催化去除ACL 的氨(由具有氨解酶活性的生物催化剂催化)，从α -氨基-ε -己内酰胺中生物催化性去 除α “氨基，从而形成6，7-DA0,或者通过能够催化这类消除的另外的生物催化剂或能够催 化这类氨基去除的另外的生物催化剂，从ACL去除α _氨基。另外，6，7_DA0的化学制备可基于例如 Reimschuessel，H. K. et al. J. Org. Chem. (1969)，34，969，其公开内容通过引用并入本文，尤其是涉及反应条件的公开内容。基于该 方法，技术人员应当能够如下由ACL制备6，7-DA0 在存在HCl或HBr (或类似物)时用NaNO2 使ACL叠氮化，藉此将形成的重氮ACL衍生物分别原位转化为α-氯或α-溴己内酰胺。可 以如所述参考文献中所述，使用2，6-二甲基吡啶，在消除反应中将后者化合物(或使用不 同的酸时的类似化合物)转化成6，7-DA0。另外，去除ACL的α -氨基得到6，7-DA0可以例如通过氨消除或通过随后的转氨 基反应、酮基还原和脱水来完成。去除反应可由一种或多种生物催化剂催化。具体地，α-氨基的去除可以由包含裂合酶(EC 4)的生物催化剂催化。优选地使 用C-N裂合酶(EC 4. 3)，更优选地使用氨解酶(EC 4. 3. 1)。催化ACL转化成6，7-DA0的生物催化剂可例如来自如上文所述的生物。还可使用如下文所述的选择方法，选择合适的生物催化剂，用于将ACL转化成6， 7-DA0。例如，可使用下述文库来选择生物催化剂，所述文库包含用于从ACL去除α -氨基 的可能的生物催化剂的集合。在用于发现合适的生物催化剂的选择方法中，将候选的生物 催化剂与下述培养基接触，所述培养基中存在作为唯一氮源的ACL和/或至少一种ACL的 功能性类似物。只有能够使用ACL-类似物作为氮源的这些微生物能够生长。之后，选择在这类培养基上显示生长的一种或多种样品(所谓的“生长培养物”)。 之后测试一种或多种这些生长培养物是否具有将ACL转化成6，7-DA0的活性。任选地，尤其 是在仅一种或多种ACL-类似物被用作唯一氮源的情况下，首先针对显示转化一种或多种 ACL-类似物的活性来对生长培养物加以检查，之后测试显示这类活性的一种或多种培养物 将ACL转化成6，7-DA0的活性。因此，在本发明的一个特定方面中，本发明涉及寻找能够催化从ACL去除α-氨基 的生物催化剂的方法，所述方法包括-提供在一种或多种细胞培养物中包含多种候选生物催化剂的文库，所述培养物 包含含有α _氨基_ ε _己内酰胺和/或一种或多种其类似物作为唯一氮源的培养基；-选择在所述培养基上生长的一种或多种候选者生物催化剂；和-筛选出在所述培养物中生长的、具有从ACL中去除α-氨基的催化活性的生物催化剂。在本文中使用时，术语“选择”被定义为一种方法，其中使用某些特定的条件针对 生长来测试一种或多种生物催化剂，所述生长是存在期望的生物催化活性的指征。在本文中使用时，术语“筛选”被定义为一种方法，其中针对一种(或多种)想要 的生物催化转化测试一种或多种生物催化剂。文库可尤其是宏基因组(metagenomic)文库，其包含微生物的基因组片段，所述 片段可已被鉴定或者可以是未被鉴定的，并且所述片段已被克隆进用于表达的合适微生物 如 Escherichia、PseudomonasΛ Bacillus、Streptomyces 或 Saccharomyces 中。所述片段 可原则上来自任何生物和一种或多种生物。所述生物可以是在现存条件下可培养或不可培 养的，可具有特定的生境、需要特定的环境因素(例如温度、PH、光、氧、养分)或共生伴侣。 具体地，所述生物可以是多细胞生物如海绵、昆虫、哺乳动物或植物的内共生体。在一个实施方案中，文库包含含有候选生物催化剂的多种环境样品，尤其是多种 水样品(例如废水样品)、堆肥(compost)样品和/或土壤样品。这类样品包含多种野生型 微生物。术语“ACL的功能性类似物”在本文中被用于表示所述类似物包含可被生物催化 剂识别的功能性基团。具体地，功能性类似物可具有L-构型或D-构型或其任何比例的混 合物，由α-位和任选地内酰胺氮上具有额外碳取代基的七元α-氨基内酰胺或α-氨基 (硫代)内酯组成。优选地，选择ACL类似物，所述类似物i)引起想要的ACL氨解酶活性或导致从ACL 去除α-氨基的类似活性，和ii)具有消除副反应的低倾向。具体地，唯一的氮源可由式I 或II表示的一种或多种化合物组成
权利要求
1.用于制备α-氨基-ε-己内酰胺的方法，所述方法包括将赖氨酸转化成α-氨 基-ε -己内酰胺，其中所述转化由生物催化剂催化。
2.根据权利要求1的方法，其中所述生物催化剂具有赖氨酸环化酶活性。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述生物催化剂包含选自水解酶(EC3)组的 酶，尤其是选自作用于酯键的水解酶(EC 3. 1)和作用于并且肽键的碳-氮键的水解酶(EC 3. 5)组的酶。
4.根据权利要求3的方法，其中所述水解酶选自羧酸酯水解酶(EC3.1. 1)、作用于线性 酰胺的水解酶(EC 3. 5. 1)和作用于环状酰胺的水解酶(EC 3. 5. 2)的组。
5.根据权利要求4的方法，其中所述水解酶选自猪肝酯酶(EC3.1. 1. 1)、作用于线性酰 胺的水解酶(EC 3.5. 1)、L-赖氨酸-1，6-内酰胺水解酶(EC 3.5.2.11)和6-氨基己酸-环 状二聚体水解酶(3. 5. 2. 12)的组。
6.根据权利要求3、4或5的方法，其中所述酶选自来自下述生物或生物的部分的、能 够催化赖氨酸环化成α -氨基-ε -己内酰胺的酶的组，所述生物选自哺乳动物、Jaspis, Poechi1lastra、Periconia、Pachastrella、Myxococcus、Nocardia、Streptomyces、 Ochrobactrum、Rhodococcus、Enterobacter、Thermus> Aspergillus、Methylophilus、 Mycobacterium^ Citrobacter> Alcaligenes> Achromobacter>, ^ PC 12/1000—B4、 Providencia> Tremella> Cryptococcus> Candida 禾口 Trichosporon 白勺组。
7.根据权利要求6的方法，其中所述生物选自选自Ochrobactrum、Iihodococcus、 Aspergillus、 Citrobacter> Providencia、 Tremella、 Cryptococcus、 Candida 禾口 Trichosporon的组的生物的组。
8.根据前述权利要求任一的方法，其中所述生物催化剂包含SEQIDNo. 4,SEQ ID No. 6 所示氨基酸序列或任何这些序列的同源物。
9.根据权利要求8的方法，其中所述氨基酸序列与任何所述kquencelD具有至少 80 %、尤其是至少90 %、更尤其是至少95 %的序列同一性。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述方法在水性环境中进行。
11.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，所述方法包括使用肽合酶将赖氨酸转 化成α-氨基-ε-己内酰胺。
12.制备(Z)-6，7-二氢-IH-氮杂卓-2(5Η)-酮的方法，所述方法包括在根据前述权 利要求中任意一项所述的方法中制备α -氨基-ε -己内酰胺之后，从α -氨基-ε -己内 酰胺去除α-氨基。
13.用于制备己内酰胺的方法，所述方法包括在根据权利要求12的方法中制备 (Z) -6，7- 二氢-IH-氮杂卓-2 (5Η)-酮之后，还原(Z) -6，7- 二氢-IH-氮杂卓-2 (5Η)-酮的 碳-碳双键。
14.包含至少一种下述重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含编码具有赖氨酸环化 酶活性的生物催化剂的核酸序列。
15.根据权利要求14的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码具有氨解酶活性的生物催化 剂的核酸序列。
16.根据权利要求14或15的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由Aspergillus、 Penicillium、Saccharomyces、Kluyveromyces、Pichia、Candida、Hansenula、Bacillus、Corynebacterium 禾口 Escherichia 构成的属组。
17.根据权利要求14-16中任意一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码下 述生物催化剂的核酸序列，所述生物催化剂包含SEQ IDNo. 4,SEQ ID No. 6所示的氨基酸序 列或任何这些序列的同源物。
全文摘要
本发明涉及制备α-氨基-ε-己内酰胺的方法，所述方法包括将赖氨酸转化成α-氨基-ε-己内酰胺，其中所述转化由生物催化剂催化。另外，本发明涉及包含至少一种重组载体的宿主细胞，所述重组载体包含编码具有赖氨酸环化酶活性的生物催化剂的核酸序列。本发明还提供了一种方法，其中用α-氨基-ε-己内酰胺来制备ε-己内酰胺。
文档编号C12P17/10GK102037131SQ200980118682
公开日2011年4月27日 申请日期2009年5月20日 优先权日2008年5月20日
发明者伯纳德斯·卡普特因, 埃克斯勒·克里斯多佛·特里弗泽, 彼托纳拉·凯瑟琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯, 蓓提·伯奈斯·库森斯, 马丁·斯库尔曼 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司