专利名称：源自生存素的新型强力mhc ⅱ类肽的制作方法
源自生存素的新型强力MHC I I类肽
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、核酸和细胞。尤其是，本发明涉及癌症的 免疫疗法。本发明进一步涉及源自生存素的肿瘤相关细胞毒性T辅助细胞(CTL)肽表 位，为单独或结合其它作为刺激抗肿瘤免疫反应疫苗复合物的活性药物成分的肿瘤相关 肽。本发明尤其涉及三种新型肽序列及其变体，系源自可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫 苗组合物中的人肿瘤HLAI类和II类分子。
发明背景
神经胶质瘤是源自神经系统胶质细胞的脑肿瘤。神经胶质细胞(Glial cell)，通 常称为神经胶质(neuroglia)或简单地称为胶质(glia)，是提供支持和营养、保持动态平 衡、形成髓鞘和参与神经系统信号传输的非神经元细胞。神经胶质瘤的两个最重要的亚 群为星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤，根据其来源的正常胶质细胞类型(分别为星形胶质 细胞和少突胶质细胞)而得名。多形性胶质母细胞瘤(以下简称胶质母细胞瘤)属于星形 细胞瘤的亚群，是成人中最常见的恶性脑肿瘤，约占所有恶性脑肿瘤的40%，约占胶质 瘤的50% (CBTRUS，2006)。它对中枢神经系统有很强的侵袭性，是所有胶质瘤中恶性 水平最高(IV级)的肿瘤。由于神经影像学、显微外科学、各种治疗方案(如替莫唑胺 或放射)的进步，在该疾病的治疗方法上已经取得了稳步发展，虽然如此，胶质母细胞 瘤仍无法治愈(Macdonald，2001 ； Burton and Prados, 2000 ； Prados and Levin, 2000)。 该类型的脑肿瘤致死率非常高自首次确诊后的预期平均存活时间为9至12个月。在 1986年到1990年的观察期，其5年存活率为8.0%。截至目前，侵入性治疗，包括肿瘤全 切除，治疗后五年存活率仍然不足 10% (Burton and Prados, 2000 ； Nieder et al.，2000 ； Napolitano et al.，1999 ； Dazzi et al.，2000)。因此，医学上对替代性的有效治疗方法有 着强烈的需求。
胶质母细胞瘤的肿瘤细胞是脑肿瘤中分化最低的肿瘤细胞，所以，肿瘤细胞很 可能迁移和增殖，并且具有高度的浸润性，从而导致预后非常差。由于胶质母细胞瘤在 大脑中呈快速、侵袭性及浸润性生长，因此会导致死亡。浸润性生长模式导致这些肿瘤 具有不可切除的特性。同时，胶质母细胞瘤对放疗、化疗也具有相对的抗性，因此，治 疗后复发率高。此外，在手术切除和放疗后，肿瘤细胞的免疫反应对彻底消除肿瘤细胞 无效(Roth and Weller，1999 ； Dix et al., 1999 ； Sablotzki et al.，2000)。
胶质母细胞瘤分为原发性胶质母细胞瘤(新肿瘤)和继发性胶质母细胞瘤，这取 决于在未分化星形胶质细胞或胶质前体细胞的恶性转化期间基因机制上的差异。继发性 胶质母细胞瘤发生在最大年龄为45岁的较年轻的人群中。平均在4到5年期间，继发 性胶质母细胞瘤从低级别的星形细胞瘤发展为未分化的星形细胞瘤。相比之下，原发性 胶质母细胞瘤主要发生在较年长的人群中，平均年龄为55岁。一般来说，原发性胶质 母细胞瘤作为暴发性胶质母细胞瘤而发生，特点是在3个月内就可从无任何临床或病理 异常状态进展为胶质母细胞瘤(Pathology and Genetics of the Nervous Systems.29-39 (IARC Press, Lyon, France, 2000))。
胶质母细胞瘤沿有髓神经迁移并在中枢神经系统中广泛扩散。对于大多数病例，手术治疗只显示出有限的可持续疗效(Neurol.Med.Chir.(Tokyo)34，91-94，1994 ； Neurol.Med.Chir. (Tokyo) 33，425-458，1993 ； Neuropathology 17, 186-188，1997) (Macdonald, 2001 ； Prados and Levin, 2000)。
恶性胶质瘤细胞通过产生会削弱T细胞增殖的免疫抑制物以及产生免疫刺激因 子IL-2，而逃开宿主免疫系统的侦测(Dix et al.，1999)。
颅内肿瘤可发生于CNS的任何结构或细胞类型，包括脑、脑膜、脑垂体、头 骨、甚至残留的胚胎组织。在美国，原发性脑肿瘤的总体年发病率是每10万人中有14 例。最常见的原发性脑肿瘤为脑膜瘤，占所有原发性脑肿瘤的27%，以及胶质母细胞 瘤，占所有原发性脑肿瘤的23% (而成人中，胶质母细胞瘤占恶性脑瘤的40%)。这些 肿瘤中，很多都具有侵袭性，并且级别高。原发性脑肿瘤是儿童中最常见的实体瘤，在 儿童中，是仅次于白血病的第二位最常见癌症死亡原因。
如今，对胶质母细胞瘤患者有效治疗方法的探究工作仍在进行。已有研究对抗 这些肿瘤细胞的免疫疗法或通过征募免疫系统的治疗方法。首先，在人类的免疫治疗研 究中，Northwest Therapeutics使用“DCVaxBrdn”(脑癌疫苗)治疗胶质母细胞瘤获得 了令人鼓舞的成果，其可诱导抗原特异性CTL反应，与正在采用的标准治疗相比，延长 了中位存活时间，同时最大限度地降低了毒性(Heimbergeretal.，2006)。
结直肠癌
根据美国癌症协会的报道，在美国，结直肠癌(CRC)是位于第三位的最常见癌 症，受罪的新患者每年超过175,000名。在美国、日本、法国、德国、意大利、西班牙和 英国，每年有超过480,000例患者罹患该疾病。它是发达国家癌症死亡的最常见原因之 一。结直肠癌患者的1年和5年相对存活率分别为84%和64%。确诊5年后存活率继 续下降，10年时下降至57%。如果结直肠癌在早期未扩散阶段被发现，则5年存活率为 90%；但是只有39%的结直肠癌患者会在此阶段得到确诊，主要原因是筛查率低。当癌 细胞已发生区域扩散而累及邻近器官或淋巴结后，5年存活率下降至68%。有远处转移 的患者5年存活率仅为10%。
研究表明，结直肠癌的发病是遗传和环境因素之间相互作用的结果。在大多数 病例中，结直肠肿瘤似乎由腺瘤息肉演变而来；但是这个演变过程可能需要很多年。结 直肠癌的主要风险因素是年龄，90%的病例在50岁之后诊断患有此病。根据美国癌症协 会的报道，结直肠癌的其它风险因素包括饮酒、高脂肪和/或红色肉类饮食、水果和蔬 菜的摄取量不足。结直肠癌的发病率继续上升，特别是日本等地区，这些地区接受西化 饮食，摄入过多的脂肪和肉类而纤维摄入量减少，这些因素可能是罪魁祸首。但是发病 率的上升速度比不上以前，这可能是由于进行了更多的筛查和息肉切除从而防止了息肉 发展成为癌症。
和大多数实体肿瘤的治疗一样，一线治疗为手术治疗，然而，手术受益者仍仅 限于早期患者，但有很大一部分患者在确诊时已是晚期。基于氟尿嘧啶的化疗方案是晚 期结直肠癌的标准治疗。这些治疗方案的大多数为所谓的FOLFOX方案(输注5-FU/亚 叶酸+奥沙利钼)和FOLFIRI (伊立替康、亚叶酸，团注和连续输注5-FU)方案。
第三代细胞毒素类药物的引入，如伊立替康和奥沙利钼，增加了显著改善疗效 的希望，但预后仍较差，转移癌的存活率一般仍只有大约20个月，因此，治疗该疾病的5需求仍远未满足。
最近出现了新一代药物，即靶向分子药物，如阿瓦斯丁(贝伐单抗)和爱必妥 (西妥昔单抗)，而且大约有40种针对不同阶段结直肠癌的化合物处于后期临床开发阶 段。这些化合物中的几种相结合可增加未来潜在治疗选择的数量。绝大部分药物都处于 二期阶段，在结直肠癌的临床研究中，这些化合物靶向表皮生长因子受体(EGFR)比靶 向其它靶标更经常，这是由于在约80%的结直肠癌患者中，EGRF表达都上调。
针对II期结直肠患者使用最近批准的单克隆抗体(mAb)联合化疗(西妥昔单抗 +伊立替康或FOLFOX4方案；贝伐单抗单药或与FOLFOX4方案联合)的临床试验目前 正在进行。经过三至四年的观察，预计这些试验会得出有统计学意义的结果。
目前肿瘤科所用的单克隆抗体(mAb) —般都很可能不会干扰积极免疫治疗。事 实上，有临床前(GABRILOVICH 1999)和临床证据表明，用贝伐单抗消耗VEGF可导 致DC介导的T细胞激活的积极结果(Osada T，Chong G，Tansik R，Hong T，Spector N, KumarR, HurwitzHI, Devi, NixonAB, Lyerly HK, ClayT, Morse MA. The effect of anti-VEGFtherapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients.Cancer Immunollmmunother.2OO8Jan 10.)。
前列腺癌和其它肿瘤
据估计，2007年有27050人死于前列腺癌，它是男性癌症死亡的首要原因。虽 然自20世纪90年代初以来，其死亡率在白人和非裔美国男性中一直下降，但是，非裔美 国男性的死亡率仍然比白人男性高两倍以上。前列腺癌是男性中最常见的癌症。非裔美 国男性的发病率显著高于白人男性，其原因不明。在过去20年里，前列腺癌的发病率发 生了很大的变化在1988-1992年期间迅速上升、1992-1995年期间急剧下降、自1995 年以来略有增加。这些趋势在很大程度上反映了采用前列腺特异抗原(PSA)血液检查进 行前列腺癌筛查的增加。过去10年中发病率增加趋缓最有可能是由于在65岁以上的男 性中普遍开展PSA筛查。在65岁以上的男性中，前列腺癌的发病率趋于稳定。在白人 男性中，发病率于1992年达到高峰(每100000人男性中有237.6人)，而在非裔美国男 性中，于1993年达到高峰(每100000人男性中有342.8人)。
前列腺癌的治疗包括观察等待、手术、放射治疗、高强度聚焦超声(HIFU)、化 疗、冷冻手术、激素治疗、或一些组合疗法。哪种方案最佳取决于疾病的阶段、Gleasan 评分和PSA水平。其它重要因素是男性的年龄、一般健康状况、以及对潜在治疗及其 可能副作用的感觉。由于所有的治疗均可能有一定的副作用，如勃起功能障碍和尿失 禁，因此治疗讨论往往注重于治疗目标和生活方式改变的风险之间的平衡。
如果癌症已扩散出前列腺，治疗选择会发生明显的变化，因此，大多数治疗前 列腺癌的医生使用各种诺模图来预测扩散概率。观察等待、HIFU、放射治疗、冷冻手术 和外科手术一般在癌症仍然局限在前列腺内的男性中进行。激素疗法和化疗常常在疾病 已经扩散出前列腺的患者中进行。但是，也有特例对于一些晚期肿瘤，可使用放射治 疗，对于一些早期肿瘤，可使用激素治疗。如果初始的治疗失败并且癌症进展，也可使 用冷冻疗法、激素疗法、化疗。
在因临床怀疑器官有限生长而接受前列腺癌根治术的前列腺癌患者中，很多人 的手术准备确诊性病理检验显示，局部性扩展肿瘤扩展至器官的边界之外。这些患者有早期局部复发的高风险，就生化复发而言，由于PSA水平不断增高，通常可以检测。在 这种情况下的治疗性选择包括外部放疗和激素治疗；然而，这些治疗方法的价值，特别 是延长患者的长期存活率方面，不能认为已经得到证实。此外，可能的治疗相关并发 症，如尿道狭窄的发展(放疗)、性欲丧失和阳痿、骨质疏松方面的骨骼中钙盐降低的风 险、以及病理性骨折风险明显增加(激素消融)，也必须予以考虑。
在所有前列腺癌中，有90%以上在发现时处于局部性和区域性阶段；肿瘤在此 阶段确诊的患者5年相对存活率接近100%。在过去25年中，所有阶段肿瘤组合在一起 的5年存活率从69%上升至接近90%。根据最新的数据，10年相对存活率为93%，15 年相对存活率为77%。存活率，特别是5年存活率的巨大提升，部分归因于早期诊断和 治疗的改进。但是，在肿瘤扩散至其它组织和器官后，患者的存活率显著下降。
肺癌
2007年美国预计新发病例为21万例，约占确诊癌症病例的15%。男性发病率 显著下降，从1984年的每10万人102例高点，下降到2003年的78.5例。在女性中，这 一发病率在一段长期的增长之后正趋向于平稳。为了治疗之目的，临床上肺癌分为小细 胞肺癌(13% )和非小细胞肺癌(87% )。
在男性和女性中，癌症相关死亡的大多数均为肺癌。据估计，2007年有16.039 万人死亡，约占所有癌症死亡人数的四％。自1987年以来，每年死于肺癌的女性多于乳 腺癌患者。从1991年至2003年，男性的死亡率持续下降，每年约下降1.9%。女性肺 癌死亡率在连续增长几十年后正趋于平稳。肺癌死亡率的这些趋势反映了过去30年吸烟 率的下降。
治疗选择根据癌症的类型(小细胞和非小细胞肺癌)和阶段进行确定，包括手 术、放疗、化疗、靶向生物治疗，如贝伐单抗(Avastin )和埃罗替尼(Tarceva )。对于局部癌，通常选择外科手术治疗。最近的研究表明，手术随后化疗可提高早期非小细胞肺 癌的存活率。由于该疾病在发现时通常已经扩散，因此，常常使用放射和化疗，有时与 手术联合使用。单一化疗或放化疗结合是治疗小细胞肺癌的通常选择；采用这一方案， 有很大比例的患者获得缓解，在一些病例中，缓解为持久缓解。
肺癌的1年相对存活率在1975-1979年期间为37%，至2002年，略上升至 42%,这主要是由于手术技术的改进和组合疗法的使用。然而，所有阶段的肺癌组合在 一起，5年存活率仅为16%。对于疾病在检出时仍为局部性的病例，存活率为49%;但 是仅有16%的肺癌在此早期得到确诊。
表1 2007年美国按性别估计的新发癌症病例和死亡人数(American Cancer Society.Cancer Facts&Figures 2007.Atlanta American Cancer Society ； 2007.)
权利要求
1.一种肽包含选自SEQ ID No.l至SEQ ID No.3的组的一个序列或该序列的与SEQ ID No.l至SEQ ID No.3具有95%同源性的一种变体，或该序列的诱导与所述变异肽发生T 细胞交叉反应的一种变体；其中，所述肽不是人类生存素的全长多肽。
2.根据权利要求1的肽或其变体，其中所述肽或其变体保持着与人类主要组织相容性 复合体(major histocompatibility complex, MHC) I类或II类分子相结合的能力，并且其中 所述肽优选能够刺激CD4或CD8T细胞。
3.根据权利要求1或2的肽，其中所述肽选自具有选自HLA-DR和HLA_A*02的组 的一种特异性HLA亚型的一种肽，并且其中所述肽优选包含其特异性锚氨基酸基序。
4.根据权利要求1至3任一项所述的肽，其中所述肽或其变体的总长度为8至100个 氨基酸，优选为8至30个氨基酸，更优选为8至16个氨基酸，最优选为该肽是由或基本 由根据SEQ ID No.l至SEQ ID No.3的任一氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1至4任一项所述的肽，其中所述肽为融合蛋白，尤其包含HLA-DR 抗原相关不变链(Ii)的N_端氨基酸。
6.根据权利要求1至5任一项所述的一种编码肽的核酸或一种能表达所述核酸的表达 载体。
7.根据权利要求1至5任一项所述的肽、或根据权利要求6所述的药用核酸或表达载体。
8.—种宿主细胞包含根据权利要求6所述的核酸或表达载体，其中所述宿主细胞优选 为抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞或抗原提呈细胞。
9.一种制备根据权利要求1至7任一项所述的肽的方法，该方法包括培养根据权利要 求11所述的表达权利要求8所述核酸的宿主细胞或根据权利要求9的表达载体，以及从 该宿主细胞或其培养基中分离出肽。
10.—种体外制备激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的方法，包括将CTL与载有抗原 的人类I或II类MHC分子进行体外接触，该等分子在合适的抗原提呈细胞表面或人工模 拟构造的抗原提呈细胞表面上表达一段足够的时间从而可以以抗原特异性方式激活所述 CTL，其中所述抗原为权利要求1至5任一项所述的肽。
11.使用根据权利要求1至5任一项所述的一种肽、根据权利要求6所述的一种核酸 或表达载体、根据权利要求8所述的一种细胞或根据权利要求10所述的一种激活细胞毒 性T淋巴细胞进行治疗癌症或制造抗癌药品，其中所述药物优选为疫苗。
12.根据权利要求11所述的使用，其中所述癌症选自星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞 瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、多形性胶质母细胞瘤、 混合型胶质瘤、少突星形细胞瘤、髓母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、生殖 细胞瘤、畸胎瘤、神经节细胞胶质瘤、神经节细胞瘤、中央神经节细胞瘤、原始神经外 胚层肿瘤(PNET，例如髓母细胞瘤、髓上皮瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、管膜 母细胞瘤)、松果体实质肿瘤(例如松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤)、室管膜细胞瘤、 脉络丛肿瘤、来源不明的神经上皮肿瘤(例如大脑胶质瘤病、星形母细胞瘤)或胶质母细 胞瘤、前列腺肿瘤、乳腺癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞 癌、肺癌、中枢神经系统癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、鳞状细胞癌、白血病和髓母 细胞瘤以及其他显示过量表达生存素或神经蛋白聚糖的肿瘤或癌症。
13.使用根据权利要求11或12所述的一种肽，联合至少一种选自由根据SEQID 4 至13以及24的肽构成的组，用以治疗肾癌，或联合至少一种选自由根据SEQ ID 4、8、 11、12和15至24的肽构成的组，用以治疗结肠癌或制造抗结肠癌的药品。
14.一种药盒，包括(a)—个容器，含有根据权利要求1至5任一项所述的一种肽、根据权利要求6所述 的一种核酸或表达载体、根据权利要求8所述的一种细胞或根据权利要求10所述的溶液 或冻干形式的激活细胞毒性T淋巴细胞的药物组合物。(b)可选的第二个容器，其含有冻干粉剂型的稀释剂或重组溶液；(c)可选的至少一种选自由根据SEQID 4至24的肽构成的组的肽，以及(d)可选的使用溶液和/或重组和/或使用冻干粉剂型的说明书。
15.一种抗体，当其与一种相应HLA分子络合时特异性对抗根据ID 1至24的任一序 列的肽，其中该抗体优选为多克隆抗体、单克隆抗体和/或嵌合抗体。
全文摘要
本发明涉及用于免疫治疗方法的肽、核酸和细胞。特别是，本发明涉及癌症的免疫疗法。本发明进一步涉及源自生存素的肿瘤相关细胞毒性T辅助细胞(CTL)肽表位，为单独或与作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物的活性药物成分的其它肿瘤相关肽组合在一起。本发明特别涉及三种新型肽序列及其变体，其源自可用于引发抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物中的人肿瘤HLA I类和II类分子。
文档编号C12N15/12GK102027006SQ200980117564
公开日2011年4月20日 申请日期2009年5月14日 优先权日2008年5月14日
发明者彼得·莱维卓尔斯奇, 托尼·怀申克, 斯蒂芬·斯蒂万诺维奇, 汉斯-宙戈·冉曼思, 赛瑟利·戈泰芬奇斯 申请人:伊玛提克斯生物技术有限公司