专利名称：用于治疗糖尿病的源自人脂肪组织的胰岛素生产性间充质干细胞的制作方法
技术领域：
本发明提供了用于治疗糖尿病的组合物，其包含从人脂肪组织获得的胰岛素生产 性间充质干细胞。本发明还描述了从人脂肪细胞中获得胰岛素生产性间充质干细胞的简便 方法。
背景技术：
糖尿病是一种慢性代谢疾病，其特征是高血糖(即葡萄糖)水平。这是由胰岛素 (一种调节血糖水平的激素)不足或者机体对胰腺β细胞所分泌的胰岛素不应答而引起 的。糖尿病被认为是重要的健康威胁，而且糖尿病的发病率在发达国家和发展中国家 中均迅速升高，几乎正发展成糖尿病的流行。根据WHO的估计，2000年全世界糖尿病患者人 数为一亿七千一百万，预计到2030年将增加到至少三亿六千六百万。预计印度将成为糖尿 病患者数最多的“糖尿病之都”。在大部分国家，糖尿病已成为造成早产症状和死亡的主要原因之一，糖尿病患者 有发生心力衰竭或肾衰竭问题的额外风险。目前，这些患者的可用治疗选择为口服降血糖 剂和重组胰岛素制剂形式的终身药物治疗。尽管进行这些药物治疗并严格控制饮食和生活 方式，他们中的30%仍将发生肾衰竭和/或心脏问题以及较轻微的疾病如神经病、视网膜 病、足部溃疡等。糖尿病也对经济有不利影响。根据WHO估计，有成年糖尿病患者的普通印度家庭 有25%的家庭收入花费在糖尿病治疗上。糖尿病的两种基本类型为i) 1型或胰岛素依赖性此型糖尿病患者不产生或几乎不产生胰岛素，并且需要 每天注射胰岛素来控制血糖水平。尽管如此，这些患者的血糖水平仍非常不稳定，从而引起 并发症。ii) 2型或非胰岛素依赖性糖尿病此型糖尿病患者不能有效利用胰岛素，并且经 常需要口服药物(并在较少的情况下需要胰岛素)以达到好的代谢控制。已经使用多种药物来治疗糖尿病，其中包括胰岛素、磺酰脲类(氯磺丙脲、格列吡 嗪)、氯茴苯酸类(瑞格列奈)、α糖苷酶抑制剂(阿卡波糖)、双胍类(二甲双胍)以及噻 唑烷二酮类(匹格列酮)。这些药物或者通过刺激胰腺β细胞来增强胰岛素分泌，或者延 迟葡萄糖的胃肠道吸收，或者以对2型糖尿病来说至关重要的“胰岛素抗性”作为靶标。尽管有多种抗糖尿病药物可用，但糖尿病并发症的控制和预防仍远不能令人满 意这可能是由于药物的副作用，如意外的低血糖发作，血糖控制低效或者患者顺应性不佳 (特别是在注射胰岛素疗法中)。近期的医学进展表明“干细胞”有从根本上改变人类疾病治疗的潜力。它们可以 为多种医学病症的治疗带来革命，所述病症包括恶性肿瘤、脊髓损伤和退行性疾病、神经性疾病、自身免疫病如系统性红斑狼疮、皮肤病如银屑病等、心脏病如急/慢性心力衰竭，甚 至糖尿病。干细胞被定义为能自我更新并产生有分化命运之后代的细胞。机体不同组织和血 液中濒死细胞/死细胞的更替由这些细胞通过天然机制来调控。干细胞的来源-胚胎，即胚泡-脐带血(UCB)-骨髓(BM)-夕卜周血除这些之外，每个组织都有专门的干细胞类型。现在可以通过细胞培养将干细胞 培养并转化成与各种组织相一致的特化细胞。骨髓来源的干细胞是研究最多的成体干细胞类型。在骨髓中发现的两种主要干细 胞类型是形成血液的“造血干细胞”，以及通常形成骨骼、软骨、肌肉及脂肪的“间质”(间充 质)干细胞(MSC)。近期的研究显示，另外一个可能但尚未利用的干细胞来源可能是“脂肪组织”。初 步的研究显示，从脂肪组织中分离的干细胞可以分化并产生很多细胞类型。也有证据表明， 脂肪组织中存在的成体多能干细胞可具有高度“可塑性”。源自脂肪组织的MSC在所有培养 特征和功能上都与源自骨髓和脐带血的MSC类似。它们易于大量获得，而且可作为骨髓源 性MSC的替代来源而高效培养。遗憾的是直到今天，对分离自脂肪组织的干细胞的研究还 大部分局限在实验室中，并且仍是实验性的。在临床情况下以人脂肪组织作为干细胞来源 只有零星报道。近期用于治疗糖尿病的Edmonton胰岛移植方案的成功激起了对移植胰岛素生 产性细胞的兴趣，但是主要困难在于获得足够的供体胰岛组织。因此正在研究多种在体 外产生胰岛素生产细胞的方案。胚胎干细胞在这方面很有前景，但是用胚胎干细胞治疗 人类疾病的可能性由于因伦理问题产生的争论而仍不明了(Am. J. Physiol Endocrinol Metab284，E259-E266，2003)。力口州大学 Burham 医学研究所禾口 Rebecca and JohnMoores 癌症中心的研究者最近证实，胰腺中的成体干细胞可以被转化成胰岛素生产细胞。这是 β细胞再生疗法可被开发用于治疗糖尿病的第一个证据。据德州大学的研究者报道，可 将源自脐带血的干细胞改造为合成胰岛素(Med J. of Cell Proliferation, June, 2007) 0 Kojima等报道了在糖尿病大鼠的肝、脂肪组织和骨髓中检测到免疫反应性胰岛素原和胰 岛素阳性细胞，这表明在不止一个物种中存在肝外和胸腺外的胰岛素产生，这些发现都提 示了产生用于治疗糖尿病的胰岛素生产细胞的策略(Proc NatlAcad. Sci(USA) 2004,101, 2458-2463)。Karnieli 等(Stem Cells，V25，11，2837-2844，2007)报道了通过遗传操作可 以从人骨髓间充质干细胞产生胰岛素生产细胞。已经描述了用于产生胰岛素分泌性前脂肪细胞干细胞及其衍生细胞的方法，其如 下实现从患者获得脂肪干细胞；培养所述脂肪干细胞并将其与胰岛素基因一起悬于介质 中，并且通过电穿孔转染所述脂肪干细胞(专利WO 200708163)。然而对于分离干细胞和 分化成胰岛素生产细胞还没有被明确接受的方案，而且对于所研究的细胞类型也有很大分 歧；结果并不一致。
Timper等从健康供体中分离了源自人脂肪组织的间充质细胞。在增殖阶段，细胞 表达干细胞标记物巢蛋白(nestin)、ABCG2、SCF、THY-I以及胰腺内分泌转录因子Isl_l。在 3天内通过确定的培养条件诱导细胞分化为胰腺内分泌表型。使用定量PCR，观察到ABCG2 的下调和胰腺发育转录因子Isl-1、Ipf-I和Ngn-3的上调，以及对胰岛激素胰岛素、高血 糖素禾口促生长素抑制素的诱导(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 341,2006，1135-1140)。很明显，从人脂肪组织中分离和分化胰岛素生产性间充质干细胞以及将其施用于 糖尿病患者的方法距标准化还有很远，而且结果并不一致。所尝试的方法是复杂、繁重和昂 贵的，需要精密的仪器。而且在普通临床情况下很难实施。所报道技术的另一个问题是培 养基中使用了胎牛血清(FBQ -这是具有高可变性的不确定组分。它有可能在患者中导致 不良反应。实际上，据报道，当以胎牛血清为MSC培养基组分时，很多接受间充质基质细胞 (MSC)作为细胞疗法的患者产生了抗胎牛血清抗体(Sundin等，Haematologica, V 92,9, 1208-1215,2007)。因此明确需要从人脂肪组织中获得胰岛素生产性间充质干细胞的简单 高效的方法，以及以源自脂肪组织的干细胞为基础的用于治疗糖尿病患者(特别是胰岛素 缺乏型糖尿病患者)的适当治疗组合物。发明目的和
发明内容
本发明的主要目的是提供从人脂肪组织中分离胰岛素生产性间充质干细胞的简 单、高效的方法，以及以这些干细胞为基础的用于治疗糖尿病的治疗组合物。本发明的另外 一个目的是提供从人脂肪组织中分离胰岛素生产性间充质干细胞而无需在增殖或分化培 养基中使用任何异种材料(xenogenic material)的方法。本发明还有另外一个目的是提 供从人脂肪组织中分离胰岛素生产性干细胞的高成本效益的技术。本发明采用未过滤但经离心的脂肪组织提取物，用于在无任何异种材料但含有生 长因子和适当抗生素及抗真菌剂的增殖培养基中培养。避免了细胞的连续传代，而且用合 适的培养基进行分化。在检测无菌性、活力和计数后，输注所分离和培养的胰岛素生产细胞 (任选地与造血细胞一起)，优选输注到胰岛素缺乏型糖尿病患者的门脉循环中。发明详述1.从源自人脂肪组织的间充质干细胞产生胰岛素生产性间充质干细胞从脂肪组 织收集后分离MSC 在获得知情同意后，在局部麻醉下，在脐下左侧做小切口后，从供体腹前壁切除 2-3克脂肪组织。确保止血后缝合。将该脂肪组织收集在含有以下组分的增殖培养基中1. Dulbecco 改良的 eagle 培养基(DMEM, Sigma, USA)(含高葡萄糖)，1450mg/ L-20ml2.20%人白蛋白(Reliance Life Sciences, India)-5ml3.成纤维细胞生长因子-5ng/ml-营养物4. 1 %丙酮酸钠-缓冲剂5.青霉素(200000 单位 /ml) -20 μ 16.链霉素(200000 单位 /ml) -20 μ 17.头孢噻肟(lg/5ml)-10y 1
8.氟康唑，100mg/dl-10 μ 1用刀将脂肪组织切成碎末。然后将切碎的组织转移到加入了 10mg/10ml I型胶原 酶的上述培养基中。将全部培养基内含物在培养皿中处理，在切碎后将其转移到37°C的培 养箱中(其中有设定为100RPM的摇动器)1小时。然后将所有内含物转移到15ml离心管 中，780RPM离心8分钟。将上清液和沉淀用增殖培养基分别培养在IOOcm2和25cm2细胞+ 平板(Sarsted，USA)中，在37°C、5% (X)2下培养10天。每隔一天更换培养基。在用IN磷酸盐缓冲液清洗后，通过胰酶消化(0.25%胰蛋白酶EDTA溶液，用 0.25%胰蛋白酶和0.2% EDTA钠粉末制成，HiMedia，India)收集细胞。检查所收集细 胞的活力、无菌性和细胞计数，对细胞进行流式细胞术分析。进行CD45(Per CP)阴性和 CD90 (PE) /CD73 (PE)阳性测试。再将它们用苏木精和伊红染色，并使用具有如下组成的分化 培养基将其分化为胰岛素表达细胞。1. DMEM (葡萄糖-17. 5mM)，25ml2. DMEM F12 1 1,25ml2.烟酰胺-IOMm-营养物1.活化素A(activin A) :2nM_上调基因表达2. Exendin 4 IOnM-上调基因表达3.五肽胃泌素(Pentagastrin) :10nM_上调基因表达4.肝细胞生长因子(HGF) IOOpM5. B-27, N-2，血清添加剂各10 μ 1_阻止增殖6.青霉素(200000 单位 /ml) -20 μ 1
7.链霉素(200000 单位 /ml) -20 μ 18.头孢噻肟(lg/5ml)-10y 19.氟康唑，100mg/dl-10 μ 1细胞在该培养基中保持3天，然后通过如下技术进行分离。取15ml离心管(Sarsted)并装入3ml聚蔗糖泛影葡胺(FicollHypaque)。吸取全 部培养基及漂浮细胞并使其铺层在聚蔗糖泛影葡胺上。将它们在800RPM离心15分钟。吸 出界面上的白色细胞环，并用IN PBS(HiMedia, India)清洗。将细胞团用等量的分化培养 基稀释，随后在检测无菌性和活力后进行以下测量1.通过免疫荧光测定Pax-6 (正常胰岛细胞发育的关键调节因子)2.通过免疫荧光测定Isl-I (使胰岛素表达上调的基因)3.通过免疫荧光测定Ipf-1/pdx-l (它不仅是β细胞特异性基因表达和功能的调 节因子，还对β祖细胞的自我更新很重要)。4.通过化学发光进行C-肽测定。为进行免疫细胞化学(一种鉴定和研究这些细胞的形态的技术)，将细胞转移到 包被有多聚赖氨酸的玻片上，在含有20%人白蛋白(而不是异种的胎牛血清(FBQ)的 DMEM/F 12培养基中孵育过夜。非特异性结合也通过以20%人白蛋白(而非FBQ孵育来避 免。将细胞与一抗(PaX6、isl-l、ipf-l)孵育，所述抗体将确认它们为胰岛素生产细胞。用 多克隆兔IgG (用于研究试验室中产生的细胞)作为二抗，而不是其他用作二抗的与Alexa fluor-488或罗丹明红偶联的链霉亲和素染料。这些技术只用于染色和研究在实验室中产生的细胞，而不在任何地方用于细胞培养。在检测无菌性、活力和细胞计数后，输注上述从 人脂肪组织分离和培养的胰岛素生产性间充质干细胞，优选输注到胰岛素缺乏型糖尿病患 者的门脉循环中。
权利要求
1.用于从人脂肪组织中分离和分化胰岛素生产性间充质干细胞的方法，其包括以下步骤a)将脂肪组织切成碎末，b)向上述组织中加入1型胶原酶，c)将由上获得的内含物置于培养器里的摇动器上，d)将步骤c获得的全部内含物离心，e)将离心后得到的上清液和沉淀物分别在含有“无异种材料的”增殖培养基的培养皿 中在37°C和(X)2气氛中培养约10天，所述增殖培养基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改进的 fegles培养基)、人白蛋白、成纤维细胞生长因子、(FGF)、丙酮酸钠缓冲剂、抗生素和抗真 菌剂组成，f)更新培养基但不进行连续传代，g)在9-10天结束时通过胰酶消化收集上述细胞，h)检查所收集细胞的活力、无菌性、细胞计数以及CD45阴性、CD90/CD73阳性细胞的流 式细胞术分析，i)使用分化培养基使所有细胞分化成胰岛素表达细胞，所述分化培养基由DMEM-高葡 萄糖、DMEM Fl2、烟酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF、h) B27、N2、血清添加物、抗 生素和抗真菌剂组成，j)在至少3天后，使用常规技术分离步骤(i)的细胞，而后进行I^X-6、IS1-1、Ipf-I/ Pdx-UC-肽、胰岛素的测量、无菌性和活力测定。
2.权利要求1的方法，其中人白蛋白的浓度优选为20%。
3.权利要求1的方法，其中所述成纤维细胞生长因子的浓度优选为5mg/ml
4.权利要求1的方法，其中所用抗生素为青霉素、链霉素与头孢噻肟的组合。
5.权利要求1的方法，其中所用抗真菌剂为氟康唑。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞分离通过以下来实现在离心管中装入聚蔗糖泛 影葡胺，将培养基及漂浮细胞铺层在聚蔗糖泛影葡胺上，离心并吸出白色细胞环，并用缓冲 液清洗。
7.治疗糖尿病的方法，其通过向糖尿病患者施用源自人脂肪组织的胰岛素生产性间充 质干细胞来实现，所述细胞通过包括以下步骤的过程分离和分化；a)将脂肪组织切成碎末，b)在上述组织中加入1型胶原酶，c)将由上获得的内含物置于培养器里的摇动器上，d)将步骤c获得的全部内含物离心，e)将离心后得到的上清液和沉淀物分别在含有“无异种材料的”增殖培养基的培养皿 中在37°C和(X)2气氛中培养约10天，所述增殖培养基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改进的 fegles培养基)、人白蛋白、成纤维细胞生长因子、(FGF)、丙酮酸钠缓冲剂、抗生素和抗真 菌剂组成，f)更新培养基但不进行连续传代，g)在9-10天结束时通过胰酶消化收集上述细胞，h)检查所收集细胞的活力、无菌性、细胞计数并进行CD45阴性、CD90/CD73阳性细胞的流式细胞术分析，i)使用分化培养基使所有细胞分化成胰岛素表达细胞但不进行连续传代，所述分化培 养基由DMEM-高葡萄糖、DMEM F12、烟酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF、h) B27、 N2、血清添加物、抗生素和抗真菌剂组成，j)在至少3天后，使用常规技术分离来自早先步骤的细胞，而后进行I^x-6、Isl-U Ipf-l/pdx-l、C-肽、胰岛素的测量、无菌性和活力测定。
8.权利要求7的方法，其中培养基中所用人白蛋白的浓度优选为20%。
9.权利要求7和8的方法，其中培养基中成纤维细胞生长因子的浓度优选为5mg/ml。
10.权利要求7至9的方法，其中所用抗生素组合由青霉素、链霉素和头孢噻肟组成。
11.权利要求7至10的方法，其中所述细胞分离通过以下来实现在离心管中装入聚 蔗糖泛影葡胺，将培养基及漂浮细胞铺层在聚蔗糖泛影葡胺上，离心并吸出白色细胞环，并 用缓冲液清洗。
12.权利要求7至11的方法，其中所述从脂肪组织中获得的间充质干细胞与造血干细 胞一起施用给患者。
13.权利要求7至12的方法，其中输注所述干细胞，优选输注到患者的门脉循环中。
14.用于治疗糖尿病的治疗组合物，所述组合物包含源自人脂肪组织的胰岛素生产性 间充质干细胞，其任选地与造血干细胞相组合。
15.权利要求14的治疗组合物，其中所述源自脂肪组织的胰岛素生产性间充质干细胞 通过包括以下步骤的过程获得；a)将脂肪组织切成碎末，b)在上述组织中加入1型胶原酶，c)将由上获得的内含物置于培养器里的摇动器上，d)将步骤c获得的全部内含物离心，e)将离心后得到的上清液和沉淀物分别在含有“无异种材料的”增殖培养基的培养皿 中在37°C和(X)2气氛中培养约10天，所述增殖培养基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改进的 fegles培养基)、人白蛋白、成纤维细胞生长因子、(FGF)、丙酮酸钠缓冲剂、抗生素和抗真 菌剂组成，f)更新培养基但不进行连续传代，g)在9-10天结束时通过胰酶消化收集上述细胞，h)检查所收集细胞的活力、无菌性、细胞计数并进行CD45阴性、CD90/CD73阳性细胞的 流式细胞术分析，i)使用分化培养基使所有细胞分化成胰岛素表达细胞，所述分化培养基由DMEM-高葡 萄糖、DMEM Fl2、烟酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF、h) B27、N2、血清添加物、抗 生素和抗真菌剂组成，j)在至少3天后，使用常规技术分离步骤(i)的细胞，而后进行I^X-6、IS1-1、Ipf-I/ pdx-1、C-肽、胰岛素的测量、无菌性和活力测定。
16.权利要求14、权利要求15的治疗组合物，其中培养基中所用人白蛋白的浓度优选 为 20%。
17.权利要求14至16的治疗组合物，其中培养基中成纤维细胞生长因子的浓度优选为5mg/ml
18.权利要求14至17的治疗组合物，其中所用抗生素组合由青霉素、链霉素和头孢噻 肟组成。
19.权利要求14至18的治疗组合物，其中所述细胞分离通过以下来实现在离心管中 装入聚蔗糖泛影葡胺，将培养基及漂浮细胞铺层在聚蔗糖泛影葡胺上，离心并吸出白色细 胞环，并用缓冲液清洗。
20.权利要求14至19的治疗组合物，用于治疗创伤，包括糖尿病创伤。
21.在体外生产胰岛素的方法，其使用通过包括下述步骤的过程从人脂肪组织获得的 胰岛素生产性间充质干细胞a)将脂肪组织切成碎末，b)在上述组织中加入1型胶原酶，c)将由上获得的内含物置于培养器里的摇动器上，d)将步骤c获得的全部内含物离心，e)将离心后得到的上清液和沉淀物分别在含有“无异种材料的”增殖培养基的培养皿 中在37°C和(X)2气氛中培养约10天，所述增殖培养基由高葡萄糖DMEM(Dulbeccos改进的 Eagles培养基)、人白蛋白、成纤维细胞生长因子、(FGF)、丙酮酸钠缓冲剂、抗生素和抗真 菌剂组成，f)更新培养基但不进行连续传代，g)在9-10天结束时通过胰酶消化收集上述细胞，h)检查所收集细胞的活力、无菌性、细胞计数并进行CD45阴性、CD90/CD73阳性细胞的 流式细胞术分析，i)使用分化培养基使所有细胞分化成胰岛素表达细胞，所述分化培养基由以下组成 DMEM-高葡萄糖、DMEM F12、烟酰胺、活化素A、Exendin 4、五肽胃泌素、HGF，j) B27、N2、血清添加物、抗生素和抗真菌剂，但不连续传代，k)在至少3天后，使用常规技术分离步骤(i)的细胞，而后进行I^X-6、IS1-1、Ipf-I/ pdx-1、C-肽、胰岛素的测量、无菌性和活力测定。
22.权利要求21的方法，其中培养基中所用人白蛋白的浓度优选为20%。
23.权利要求21和权利要求22的方法，其中培养基中成纤维细胞生长因子的浓度优选 为 5mg/ml。
24.权利要求21至23的方法，其中所用抗生素组合由青霉素、链霉素和头孢噻肟组成。
25.权利要求21至M的方法，其中所述细胞分离通过以下来实现在离心管中装入聚 蔗糖泛影葡胺，将培养基及漂浮细胞铺层在聚蔗糖泛影葡胺上，离心并吸出白色细胞环，并 用缓冲液清洗。
26.用于治疗糖尿病患者的药物组合物，其包含通过以下过程获得的源自人脂肪组 织的胰岛素生产性间充质干细胞，所述过程基本上利用未过滤但经离心的脂肪组织提取 物-即离心所得沉淀和上清液两者、无异种材料的增殖培养基、定期更新培养基而无需连 续传代或使用明胶包被的培养板、以及合适的分化培养基。
27.权利要求沈的药物组合物，其与造血干细胞相组合用于治疗糖尿病患者。
28.权利要求沈或27的药物组合物用于治疗创伤的用途。
29.权利要求沈或27的药物组合物用于治疗糖尿病创伤的用途。
30.从人脂肪组织中获得用于治疗糖尿病的胰岛素生产性间充质干细胞的方法，其通 过基本如本文所述方法来实现。 全文摘要
本发明提供用于治疗糖尿病患者特别是胰岛素缺乏型糖尿病患者的新治疗组合物，其包含从人脂肪组织获得的胰岛素生产性间充质干细胞以及造血干细胞。本发明还描述了用于从人脂肪组织分离、扩增和分化胰岛素生产性充质干细胞的简单高效的方法。此方法中使用完全无异种材料的培养基和脂肪组织的未过滤提取物；该方法也避免了对细胞进行连续传代。
文档编号C12N5/071GK102066555SQ200980117365
公开日2011年5月18日 申请日期2009年3月13日 优先权日2008年3月15日
发明者H·L·特里维迪, 阿鲁娜·瓦尼卡 申请人:H·L·特里维迪博士移植科学研究所, Smt.G.R.多斯及Smt.K M玛塔肾病研究所及研究中心