犹他游动放线菌及其在制备阿卡波糖中的应用
【专利摘要】本发明公开了一株犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)MYIH97及其应用，该菌种由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2016237，保藏日期为：2016年05月03日。本发明还公开了一种由此菌株发酵制备阿卡波糖的方法。本发明提供的发酵工艺经大生产实践，证明其发酵单位高且杂质较少，大大地降低了后提取的难度，适宜工业化大生产且获得的阿卡波糖产品质量高。CCTCC NO: M 201623720160503
【专利说明】
犹他游动放线菌及其在制备阿卡波糖中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株新型微生物及其用途和应用，尤其涉及一株能代谢产生阿卡波糖 的菌种及其在制备阿卡波糖中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多 坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病 变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。据世界卫生组织预计，到2025年，全球成人糖 尿病患者人数将增至3亿，而中国糖尿病患者人数将达到4000万，未来50年内糖尿病仍将是 中国一个严重的公共卫生问题。临床研究中发现，Π 型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病）占 糖尿病总体人群95%以上，它是以高血糖为特征的一种代谢性疾病，患病率高，起病隐匿， 早期症状不明显。对于Π 型糖尿病的病人，在采用控制饮食的方法不能有效地控制血糖时， 需要口服降糖药物。
[0003] 阿卡波糖是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其作用机制为:竞争性抑制位于小肠的各 种α-葡萄糖苷酶，从而具有抑制多糖及低聚糖等的水解，延缓和减少葡萄糖的生成，控制餐 后血糖浓度的升高。作为临床治疗Π 型糖尿病类药物，阿卡波糖具有作用机制新颖、临床疗 效好、毒副作用小等特点，市场前景广阔。目前国内市场在售的，除了原研公司德国拜耳外， 几乎全为杭州中美华东制药有限公司生产。杭州中美华东制药有限公司也是国内最早生产 阿卡波糖的公司，基本可以代表国内阿卡波糖的最高水平。但依然存在发酵杂质多，产量 低。在大生产上进一步的降低成本，提高产品质量一直是急需解决的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对上述问题，提供一株发酵单位高、能稳定生产且副产物少的 阿卡波糖产生菌。
[0005] 本发明的另一目的是提供该菌株在制备阿卡波糖中的应用，以及具体的发酵制 备方法。
[0006] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0007] 本发明提供的犹他游动放线菌ΜΥΙΗ97,分类命名为Actinoplanes utahensis，由 中国典型培养物保藏中心保藏（简称CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCC Ν0:Μ 2016237,保藏日期为：2016年5月3日。所述的保藏号为：CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株 是成都市郊区土壤中筛选得到的。
[0008] 所述的保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株的菌落特征：菌落近圆形，直径3- 5mm，表面隆起，菌落呈橘黄色，并有水溶性色素产生。
[0009] 根据微生物形态学及国外相关资料的描述，结合保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016237的 菌株的各种培养特征和形态特征，该保藏号为CCTCC NO:M 2016237的菌株应属于犹他游动 放线菌，定名为Actinoplanes utahensis MYIH97。
[0010] 本发明的另一目的是提供该菌株在制备阿卡波糖中的应用。
[0011] 所述的保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株可应用于发酵制备阿卡波糖。该制备方 法包括下列步骤：
[0012] a.菌株采用保藏编号为CCTCC NO:M 2016237的菌株；
[0013] b.按常规方法制备斜面，斜面铲下少量菌苔接入摇瓶种子培养基，250rpm，培养2- 3天，得摇瓶种子液;将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1-0.5 %的接种量接种于种子罐， 120-200rpm，培养2-3天，得罐种子液;将罐种子液按发酵体积的6-15%的接种量接种于发 酵罐培养基，150_200rpm，发酵培养168h，收集发酵液;其中培养温度均为26~30°C。
[0014]其中所述的摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为:每100mL培养基中，碳源 1.2~2.5g，氮源2.5~4.0g，无机盐0.2~0.6g，其余为水;优选为每100mL培养基中，碳源 1.5~2.0g，氮源3.0~3.5g，无机盐0.3~0.5g，其余为水，pH值6.5~7.5。
[0015] 种子罐培养基各组分在培养基中的比例为:每100mL培养基中，碳源2.0~3.5g，氮 源3.5~6.0g，无机盐0.2~0.6g，其余为水;优选为每100mL培养基中，碳源2.5~3.0g，氮源 4.5~5.5g，无机盐0.3~0.5g，其余为水，pH值6.5~7.5。
[0016]发酵培养基各组分在培养基中的比例为:每100mL培养基中，碳源物质5~10g，氮 源物质1. 〇~3.5g，无机盐0.2~2.0g，其余为水，pH值6.5~7.5;优选为每100mL培养基中， 碳源物质7~9g，氮源物质1.5~3.0g，无机盐0.8~1.5g，其余为水，pH值6.5~7.5。
[0017] 其中所述的：碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、玉米淀粉、面粉、可溶性 淀粉、糊精、甘油中的一种或多种;优选麦芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油中的一种或几种。
[0018] 氮源选自蛋白胨、玉米浆粉、酵母粉、酵母浸出粉、黄豆饼粉、豆柏粉、棉籽饼粉、谷 氨酸钠、赖氨酸中的一种或者多种;优选蛋白胨、黄豆饼粉、酵母粉、玉米浆粉、谷氨酸钠中 的一种或几种。
[0019] 无机盐选自硫酸镁、硫酸锰、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化铁、硫 酸亚铁、氯化钙、碳酸钙中的一种或几种;优选磷酸氢二钾、氯化钾、氯化铁、氯化钙、碳酸钙 中的一种或几种。
[0020] 本发明所述的保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株是目前高发酵单位阿卡波糖 的产生菌，发酵性能优良，可用于大规模生产。发酵过程是阿卡波糖生产的重要环节，其发 酵水平与工艺优劣直接相关，本发明提供的发酵工艺经过摇瓶和发酵罐中进行试验，其生 产能力稳定。经检测，用本发明提供的菌种及发酵培养方法制备的阿卡波糖的发酵单位可 高达8.386g/L左右或以上，从而为后续的工业化生产提供了良好的基础。同时本发明的发 酵副产物相对较少，并降低了后提取的难度，从而有利于高品质的阿卡波糖的获得，在应用 于工业化生产上具有优势。
[0021 ]菌株保藏情况:保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC)，地址：中国武汉武 汉大学，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2016237,分类命名为犹他游动放线菌MYIH97 (Actinoplanes utahensis MYIH97)，保藏日期为2016年05月03日。
【附图说明】
[0022] 图1为保藏编号为CCTCC NO:M 2016237的菌落形态；
[0023] 图2为保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌丝形态；
[0024]图3按本申请实施例7制备得到含量HPLC检测图；
[0025] 图4按菌种保藏号为CCTCC N0:M209200菌株制备得到的含量HPLC检测图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例为本发明进行进一步的描述，但不能将方案中所涉及的方法 及技术参数理解为对本发明的限制。
[0027] 实施例1:保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株的培养及生理生化特征和碳氮源利 用情况
[0028] 1、保藏号为CCTCC NO:M 2016237菌株培养的形态学特征
[0029] 将保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株接种于固体培养基，26-30°C培养6-12天，观 察其菌落形态及菌丝形态分别如图1、图2所示。
[0030] CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株在固体培养基上26-30°C培养10天，菌落直径3-4mm，为 橘黄色，边缘为规则圆形，中间隆起，培养前期表面光滑湿润，培养后期表面出现干燥褶皱， 有水溶性色素产生。CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株的菌丝舒展呈网状，不产孢子。
[0031] 2、菌株生理生化特征一一碳、氮源利用
[0032]在基础培养基中加入各种碳、氮源，26~30°C培养，定期进行观察。结果如下表1所 示，碳源利用试验结果显示，该菌株能同化玉米淀粉、糊精、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等， 不能利用半乳糖、D-核糖、肌醇、阿拉伯糖、棉子糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇、D-果糖、山梨 糖等。氮源利用试验结果显示，该菌株能利用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵等无机氮源和黄豆饼 粉、玉米浆、酵母粉、蛋白胨、酪氨酸等有机氮源。
[0033] 表1 CCTCC NO:M 2016237的碳、氮源利用情况 [0034]
[0035]
[0036] +:生长一般;++:生长中等;一:不长
[0037] 3.基因测序
[0038] CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株16sRNA序列与GenBank中保存的数据进行比对，与 Actinoplanes utahensis同源性达99%，根据微生物分子遗传学鉴定原则，鉴定该菌属于 Actinoplanes属的utahensis种，中文名称为犹他游动放线菌。
[0039] 实施例2:碳氮源对发酵效价的影响
[0040] 采用保藏号为CCTCC NO:M 2016237的菌株。
[0041] 1.1碳源对阿卡波糖效价的影响
[0042] 1.1.1不同碳源种类对阿卡波糖合成能力的影响
[0043]发酵培养基中碳源分别采用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、玉米淀粉、面粉、可 溶性淀粉、糊精、甘油10种碳源为唯一碳源，培养基调节pH至7.2,灭菌待用。用接种环从固 体培养基上挑取菌苔接入上述各类碳源发酵培养基中，250r/min转速28 °C培养7天，对发酵 液中的阿卡波糖含量进行HPLC检测。
[0044]表2不同碳源对阿卡波糖产生菌发酵能力的影响
[0045]
[0046]
[0047] 实验结果显示，游动放线菌可以利用以上10种物质产阿卡波糖，其利用能力依次 是麦芽糖，葡萄糖，糊精，蔗糖，甘油，玉米淀粉，乳糖，果糖，面粉和可溶性淀粉，因此碳源优 选麦芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油中的一种或几种，其中以麦芽糖为唯一碳源时产量最 尚。
[0048] 1.1.2不同碳源浓度对阿卡波糖合成能力的影响
[0049] 选择麦芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油中的一种或几种作为碳源，配制成不同总浓 度的碳源的发酵培养基进行实验。结果如表3所示，在一定范围内，阿卡波糖合成能力随着 碳源浓度的增大而增加，当碳源浓度为8%时阿卡波糖产量达到最大值，碳源优选浓度范围 为7%~9%〇
[0050] 表3碳源浓度对阿卡波糖产生菌发酵能力的影响
[0051]
[0052] 1.2氮源对阿卡波糖合成能力的影响
[0053] 1.2.1不同氮源种类对阿卡波糖合成能力的影响
[0054]在优选碳源的基础上，分别采用豆柏粉、棉籽饼粉、黄豆饼粉、玉米浆粉、酵母粉、 酵母浸出粉、蛋白胨、谷氨酸钠和赖氨酸9种氮源为唯一氮源进行筛选实验。用接种环从固 体培养基上挑取菌苔接入上述各类氮源发酵培养基中，250rpm转速28.0 °C培养7天，对发酵 液中的阿卡波糖含量进行HPLC检测。
[0055]表4不同氮源阿卡波糖产生菌发酵能力的影响
[0056]
[0057] 由表4实验结果显示，游动放线菌可以利用以上9种物质，发酵产生阿卡波糖的能 力依次是黄豆饼粉，酵母粉，玉米浆粉，谷氨酸钠，蛋白胨，棉籽饼粉，酵母浸出粉，豆柏粉和 赖氨酸，因此根据发酵单位的高低氮源优选黄豆饼粉、酵母粉、玉米浆粉、谷氨酸钠和蛋白 胨中的一种或几种，其中以黄豆饼粉为唯一氮源时产量最高。
[0058] 1.2.2不同氮源浓度对阿卡波糖合成能力的影响
[0059] 为了探索发酵培养基中氮源浓度对阿卡波糖合成能力的影响，本实例选择黄豆饼 粉、酵母粉、玉米浆粉、谷氨酸钠和蛋白胨中的一种或几种作为氮源，配制成不同总浓度的 氮源的发酵培养基进行实验。结果如表5所示，在一定范围内，阿卡波糖合成能力随着氮源 浓度的增大而增加，氮源浓度为2.0 %时阿卡波糖发酵单位达到最大值，氮源优选浓度范围 为 1.5% ~3.0%〇
[0060] 表5氮源浓度对阿卡波糖产生菌发酵能力的影响
[0061]
[0063]实施例3:菌株发酵放大培养
[0064] 采用保藏号为CCTCC NO:M 2016237的菌株
[0065] 1、摇瓶种子培养
[0066] 培养基：麦芽糖0.7g，乳糖0.2g，面粉0.3g，棉籽饼粉3.0g，赖氨酸1.0g，碳酸钙 0 · 5g;加水 100mL，pH值7 · 0。
[0067] 装液量:500mL三角瓶装100mL培养基
[0068]摇瓶种子培养方法:将斜面挖块接入摇瓶种子培养基中，27.5 °C恒温培养，摇床转 速250rpm，待菌丝长起，有明显挂壁现象时，镜检无杂菌，菌丝呈网状，染色深，将摇瓶种子 培养液接入种子罐中。
[0069] 2、种子罐种子培养基
[0070]培养基:麦芽糖0.35Kg，果糖0.5Kg，可溶性淀粉0.15Kg，酵母浸出粉lKg，棉籽饼粉 0.75Kg，碳酸钙0.25Kg，加水40L至100L种子罐，pH值6.8，经121°C，30min灭菌后培养基体积 约为50L。
[0071 ]种子罐培养方法:按种子罐培养体积0.2% (v/v)接入培养好的摇瓶种子培养液， 27.5°C培养，达到移种条件时移种(镜检菌丝粗壮，染色深，无染菌）。培养过程中控制罐压： 0.0510^，搅拌速度180印111，通气量1:1.3(￥八〇。
[0072] 3、发酵罐培养
[0073]培养基:玉米淀粉9Kg，麦芽糖22.5Kg，果糖13.5g，棉籽饼粉3.6Kg，赖氨酸2.25Kg， 硫酸锰0.45Kg，氯化钠0.45Kg，加水380L至1吨发酵罐，pH值7.2，经121°C，30min灭菌后培养 基体积约为450L。
[0074]发酵罐培养方法：按发酵罐培养基体积11% (v/v)接入培养好的种子罐培养液， 28.0°C培养至发酵结束，发酵终点判断:菌丝染色浅，空泡较多，菌丝有断裂现象。
[0075] 培养过程中控制罐压:0.05MPa，搅拌速度160rpm，通气量1:1.3(V/V)。
[0076] 按照上述的发酵条件和工艺，在1吨罐上进行发酵试验，发酵单位为5.96g/L。
[0077] 实施例4:菌株发酵放大培养
[0078] 采用保藏号为CCTCC NO:M 2016237的菌株
[0079] 1、摇瓶种子培养
[0080]培养基:玉米淀粉5.0g，果糖10.0g，可溶性淀粉10.0g，酵母浸出粉10.0g，豆柏粉 15 · 0g，碳酸钙 5 · 0g;加水 1 OOOrnL，pH值6 · 6。
[0081 ] 装液量:500mL三角瓶装100mL培养基
[0082]摇瓶种子培养方法:将斜面挖块接入摇瓶种子培养基中，27.0°C恒温培养，摇床转 速250rpm，待菌丝长起，有明显挂壁现象时，镜检无杂菌，菌丝呈网状，染色深，将摇瓶种子 培养液接入种子罐中。
[0083] 2、种子罐种子培养基
[0084]培养基：玉米淀粉7.5Kg，乳糖5Kg，面粉5Kg，豆柏粉25Kg，赖氨酸5g，碳酸钙2.5Kg， 加水400L至1吨种子罐，pH值7.2,经121°C，30min灭菌后培养基体积约为500L。
[0085]种子罐培养方法:按种子罐培养体积0.3% (v/v)接入培养好的摇瓶种子培养液， 28.0°C培养，达到移种条件时移种(镜检菌丝粗壮，染色深，无染菌）。培养过程中控制罐压： 0.0510^，搅拌速度180印111，通气量1:1.3(￥八〇。
[0086] 3、发酵罐培养
[0087] 培养基：葡萄糖180Kg，乳糖22.5Kg，面粉22.5Kg，酵母浸出粉45Kg，豆柏粉 112.5Kg，硫酸亚铁22.5Kg，磷酸二氢钾47.25Kg，硫酸镁20.25Kg，加水3.8吨至10吨发酵罐， pH值7.2，经121°C，30min灭菌后培养基体积约为4.5吨。
[0088] 发酵罐培养方法：按发酵罐培养基体积10% (v/v)接入培养好的种子罐培养液， 28.0°C培养至发酵结束，发酵终点判断:菌丝染色浅，空泡较多，菌丝有断裂现象。
[0089] 培养过程中控制罐压:0.05MPa，搅拌速度160rpm，通气量1:1.3(V/V)。
[0090] 按照上述的发酵条件和工艺，在10吨罐上进行发酵试验，发酵单位为5.99g/L。
[0091] 实施例5:菌株发酵放大培养
[0092] 1、摇瓶种子培养
[0093]培养基:麦芽糖1 · 75g，蛋白胨2 · 0g，酵母粉1 · 0g，磷酸氢二钾0 · 05g，碳酸钙0 · 3g; 加水10〇1^，？田直7.2。
[0094] 装液量:500mL三角瓶装100mL培养基
[0095]摇瓶种子培养方法:将斜面挖块接入摇瓶种子培养基中，27.5 °C恒温培养，摇床转 速250rpm，待菌丝长起，有明显挂壁现象，镜检无杂菌，菌丝呈网状，染色深，将摇瓶种子培 养液接入种子罐中。
[0096] 2、种子罐种子培养基
[0097]培养基：麦芽糖0.9Kg，糊精0.4Kg，蛋白胨1.25Kg，酵母粉1. OKg，磷酸氢二钾 0.05Kg，碳酸钙0.15Kg，加水40L至100L种子罐，pH值7.0，经121°C，30min灭菌后培养基体积 约为50L。
[0098]种子罐培养方法:按种子罐培养体积0.2% (v/v)接入培养好的摇瓶种子培养液， 28°C培养，达到移种条件时移种(镜检菌丝粗壮，染色深，无染菌）。培养过程中控制罐压： 0.0510^，搅拌速度160印111，通气量1:1.3(￥八〇。
[0099] 3、发酵罐培养
[0100]培养基：葡萄糖22 · 5Kg，糊精18 · OKg，玉米浆粉4 · 5Kg，酵母粉2 · 25Kg，磷酸氢二钾 1.8Kg，碳酸钙3.6Kg，加水380L至1吨发酵罐，pH值7.2，经121°C，30min灭菌后培养基体积约 为450L。
[0101 ]发酵罐培养方法：按发酵罐培养基体积11 % (v/v)接入培养好的种子罐培养液， 28.5°C培养至发酵结束，发酵终点判断:菌丝染色浅，空泡较多，菌丝有断裂现象。
[0102] 培养过程中控制罐压:0.04MPa，搅拌速度160rpm，通气量1:1.1 (V/V)。
[0103]按照上述的发酵条件和工艺，在1吨罐上进行发酵试验，发酵单位为7.988g/L。
[0104] 实施例6:菌株发酵放大培养
[0105] 1、摇瓶种子培养
[0106] 培养基：葡萄糖20.0g，糊精10.0g，黄豆饼粉60.0g，谷氨酸钠10g，氯化钙2.0g，碳 酸钙4 · 0g;加水2000mL，pH值7 · 2。
[0107] 装液量:500mL三角瓶装100mL培养基
[0108] 摇瓶种子培养方法:将斜面挖块接入摇瓶种子培养基中，28.0 °C恒温培养，摇床转 速250rpm，待菌丝长起，有明显挂壁现象时，镜检无杂菌，菌丝呈网状，染色深，将摇瓶种子 培养液接入种子罐中。
[0109] 2、种子罐种子培养基
[0110] 培养基：葡萄糖13.75Kg，黄豆饼粉27.5Kg，谷氨酸钠2.75Kg，氯化钙0.55Kg，碳酸 钙l.lKg，加水480L至1吨种子罐，pH值7.0,经121°C，30min灭菌后培养基体积约为550L。
[0111] 种子罐培养方法:按种子罐培养体积0.35 % (v/v)接入培养好的摇瓶种子培养液， 28.0°C培养，达到移种条件时移种(镜检菌丝粗壮，染色深，无染菌）。培养过程中控制罐压： 0.0510^，搅拌速度160印111，通气量1:1.3(￥八〇。
[0112] 3、发酵罐培养
[0113]培养基:麦芽糖225Kg，蔗糖90Kg，甘油45Kg，黄豆饼粉81Kg，谷氨酸钠9Kg，氯化钾 18Kg，氯化钙27Kg，碳酸钙22.5Kg，加水4吨至10吨发酵罐，pH值7.2，经121°C，30min灭菌后 培养基体积约为4.5吨。
[0114] 发酵罐培养方法:按发酵罐培养基体积12% (v/v)接入培养好的种子罐培养液，28 °C培养至发酵结束，发酵终点判断:菌丝染色浅，空泡较多，菌丝有断裂现象。
[0115] 培养过程中控制罐压:0.04MPa，搅拌速度160rpm，通气量1:1.1(V/V)。
[0116] 按照上述的发酵条件和工艺，在10吨罐上进行发酵试验，发酵单位为:8.386g/L。
[0117] 实施例7 :菌株发酵放大培养
[0118] 采用保藏号为CCTCC NO:M 2016237的菌株
[0119] 1、摇瓶种子培养
[0120]培养基：蔗糖50.0 g，甘油50.0 g，玉米浆粉165g，碳酸钙25g;加水5000mL，pH值6.8。
[0121] 装液量:500mL三角瓶装100mL培养基
[0122] 摇瓶种子培养方法:将斜面挖块接入摇瓶种子培养基中，28°C恒温培养，摇床转 速250rpm，待菌丝长起，有明显挂壁现象，镜检无杂菌，菌丝呈网状，染色深，将摇瓶种子培 养液接入种子罐中。
[0123] 2、种子罐种子培养基
[0124] 培养基：蔗糖100Kg，甘油50Kg，玉米浆粉240Kg，碳酸钙25Kg，加水4吨至10吨种子 罐，pH值7.0，经121°C，30min灭菌后培养基体积约为5吨。
[0125] 种子罐培养方法:按种子罐培养体积0.2% (v/v)接入培养好的摇瓶种子培养液， 28 °C培养，达到移种条件时移种(镜检菌丝粗壮，染色深，无染菌，菌浓多30 % )。培养过程中 控制罐压:0.04MPa，搅拌速度160rpm，通气量1:1.1(V/V)。
[0126] 3、发酵罐培养
[0127] 培养基：麦芽糖3150Kg，黄豆饼粉1125Kg，蛋白胨225Kg，氯化铁135Kg，碳酸钙 225Kg，加水36吨至60吨发酵罐，pH值7.2，经121°C，30min灭菌后培养基体积约为45吨。
[0128] 发酵罐培养方法:按发酵罐培养基体积11 % (v/v)接入培养好的种子罐培养液，28 °C培养至发酵结束，发酵终点判断:菌丝染色浅，空泡较多，菌丝有断裂现象。
[0129] 培养过程中控制罐压:0.03MPa，搅拌速度150rpm，通气量1:0.9(V/V)。
[0130]按照上述的发酵条件和工艺，在60吨罐上进行发酵试验，发酵单位为6.89g/L。
[0131 ]发酵液进行固液分离，得滤液，经树脂解吸附解析，脱色，浓缩，喷雾干燥得纯阿卡 波糖。本发明所述的菌株由于发酵单位高，提取和纯化的工艺较简单，在大生产上更具有优 势。
[0132] 实施例8:对比研究:阿卡波糖高产菌株与生产菌株发酵单位和产物杂质比较
[0133] 采用本申请的阿卡波糖高产菌株保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株，和目前使 用的菌株，比如菌种保藏号为CCTCC N0:M209200(中国典型培养物保藏中心，保藏日期2009 年2月16日）进行发酵单位和产物杂质比较。
[0134] 两个菌株采用相同的方法和条件进行培养和处理，摇瓶种子、种子罐种子和发酵 培养均按照实施例7中的配比和条件进行，培养后调节发酵液pH至5~6,加助滤剂过滤，滤 液经过脱盐、层析、浓缩后，HPLC检测，图谱如图3、4所示。依据HPLC检测，对本申请CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株与现有菌种的杂质主峰阿卡波糖含量对比如下：
[0135] 表6:CCTCC Ν0:Μ 2016237的菌株和保藏号为CCTCC N0:M209200的菌株发酵产物 的杂质和主峰阿卡波糖含量对比
[0136]
[0137] 从HPLC检测结果来看，本发明的CCTCC Ν0:Μ 2016237菌株发酵不仅发酵单位高， 而且发酵液中的杂质明显低于和少于保藏号为CCTCC N0:M209200的菌株，因此，该发明提 供的阿卡波糖产生菌具有发酵单位高、能稳定生产且副产物少的特性。
【主权项】
1. 一株犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)MYIH97,由中国典型培养物保藏中 心保藏，保藏号为CCTCC N0:M 2016237,保藏日期为:2016年05月03日。2. 如权利要求1所述的保藏号为CCTCC N0:M 2016237的菌株在发酵制备阿卡波糖的应 用。3. 应用权利要求1所述的保藏号为CCTCC N0:M 2016237的菌株发酵制备阿卡波糖的方 法，其特征在于包括下列步骤： a. 发酵菌株采用保藏编号为CCTCC N0:M 2016237的菌株； b. 按常规方法制备斜面，斜面铲下少量菌苔接入摇瓶种子培养基，250rpm，培养2-3天， 得摇瓶种子液； 将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1-0.5 %的接种量接种于种子罐，120-200rpm，培 养2-3天，得罐种子液； 将罐种子液按发酵体积的6-15 %的接种量接种于发酵罐培养基，150-200rpm，发酵培 养168h，收集发酵液； 其中培养温度均为26~30 °C。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤b中摇瓶种子培养基各组分在培养基 中的比例为:每100mL培养基中，碳源1.2~2.5g，氮源2.5~4.0g，无机盐0.2~0.6g，其余为 水;优选为每l〇〇mL培养基中，碳源1.5~2.0g，氮源3.0~3.5g，无机盐0.3~0.5g，其余为 水，pH值6.5~7.5。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤b中种子罐培养基各组分在培养基中 的比例为：每100mL培养基中，碳源2.0~3.5g，氮源3.5~6.0g，无机盐0.2~0.6g，其余为 水;优选为每l〇〇mL培养基中，碳源2.5~3.0g，氮源4.5~5.5g，无机盐0.3~0.5g，其余为 水，pH值6.5~7.5。6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤b中发酵培养基各组分在培养基中的 比例为:每100mL培养基中，碳源5~10g，氮源1.0~3.5g，无机盐0.2~2.0g，其余为水，pH值 6.5~7.5;优选为每10〇111]^培养基中，碳源7~98，氮源1.5~3.(^，无机盐().8~1.58，其余为 水，pH值6.5~7.5。7. 如权利要求3至6任一权利要求所述的方法，其特征在于 所述碳源选自碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、玉米淀粉、面粉、可溶性淀 粉、糊精、甘油中的一种或多种;优选麦芽糖、葡萄糖、糊精、蔗糖、甘油中的一种或几种。8. 如权利要求3至6任一权利要求所述的方法，其特征在于 所述氮源选自蛋白胨、玉米浆粉、酵母粉、酵母浸出粉、黄豆饼粉、豆柏粉、棉籽饼粉、谷 氨酸钠、赖氨酸中的一种或者多种;优选蛋白胨、黄豆饼粉、酵母粉、玉米浆粉、谷氨酸钠中 的一种或几种。9. 如权利要求3至6任一权利要求所述的方法，其特征在于 所述选自硫酸镁、硫酸锰、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化铁、硫酸亚 铁、氯化钙、碳酸钙中的一种或几种;优选磷酸氢二钾、氯化钾、氯化铁、氯化钙、碳酸钙中的 一种或几种。
【文档编号】C12R1/045GK105838645SQ201610292358
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】李娜, 陈晓霞, 何志勇, 徐亚强, 谢海松, 王子宝, 李伟伟
【申请人】杭州华东医药集团新药研究院有限公司, 杭州中美华东制药有限公司, 华东医药股份有限公司