专利名称：一种阿卡波糖的发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种阿卡波糖的发酵方法。
背景技术：
阿卡波糖(acarbose)是含有一个不饱和环多醇的四个单糖构成的寡糖,化学名为:0-4，6-双脱氧-4-[ (IS, 4R, 5S, 6S) 4，5，6-三羟基_3_ (羟甲基)-2-环己烯基_1_氨基]-a -D-吡喃葡糖基-(I，4) -O- a -D-吡喃葡糖基-(I，4) -D-吡喃葡萄糖。阿卡波糖是一种新型口服降糖药，在肠道内竞争性抑制葡萄糖苷水解酶，抑制多糖及蔗糖分解成葡萄糖，减缓糖吸收，显著降低饭后血糖浓度。由于良好的药代动力学特征和低毒性，阿卡波糖是治疗II型糖尿病的一线药物，广泛用于降低餐后高血糖，具有广阔的应用前景。由于阿卡波糖的化学结构比较复杂，目前工业规模的生产主要是通过游动放线菌(Actinoplanes species)发酵获得。采用游动放线菌发酵制备阿卡波糖,在代谢生成阿卡波糖的同时也会产生与阿卡波糖结构类似的副产物，如，阿卡波糖杂质A、阿卡波糖杂质B、阿卡波糖杂质D。其中，欧洲药典明确规定阿卡波糖杂质A的含量应当低于0.6%。因阿卡波糖杂质A是由阿卡波糖直接转化而来，其分子结构与阿卡波糖非常相似，在高效液相检测中，其HPLC的保留时间与阿卡波糖非常接近，导致分离难度极大，通过优化发酵方法以降低杂质A的含量是比较有效的手段。申请号:201210003765.1，发明名称:“低杂质阿卡波糖及其制备方法”的专利申请公开了一种调控游动放线菌Actinoplanes species的微生物代谢制备低杂质阿卡波糖的方法，其是控制微生物发酵中后期发酵液中的溶氧水平8(Γ105%，即在发酵中后期加快搅拌速度、增加空气流量来实现，该方法的发酵周期为168h，制备的发酵液中杂质A含量为0.42%。该方法虽然降低了杂质A的含量，但是该方法后期增加了搅拌速度和通气速度，持续时间长达96h，能耗极大，生产成本大大增加。申请号:201210053220.1，发明名称:“一种制备阿卡波糖的方法”的专利申请公开了一种制备阿卡波糖的方法，其具体步骤为:(I)淀粉液化:将淀粉加水搅拌溶解，配制成2(T40% (w/v)的乳液，调pH到5.5^6.2，加入淀粉质量0.05 0.2%的耐高温α -淀粉酶和0.02 0.08%无水氯化钙，加热到105 110°C，维持5^10分钟，DE值达到1(Γ18时，降温至60°C得液化液；(2)糖化:将步骤(I)获得的液化液，加入所述淀粉质量0.05 0.2%的普鲁兰酶、0.05 0.2%的真菌酶、0.25 0.45%的β -淀粉酶，55飞(TC维持Γ8小时，得淀粉糖化液；(3)灭菌后发酵:步骤(2)获得的淀粉糖化液，直接加入其它营养物质制成阿卡波糖发酵培养基，灭菌后接入阿卡波糖生产菌种游动放线菌进行发酵，发酵过程中控制发酵培养基中总糖含量为6.(Γ12.0% (w/w)，葡萄糖含量不超过2.8%(w/w)，发酵培养5飞天，发酵液经提取制得阿卡波糖。该方法的发酵时间为125小时，制得的发酵液中阿卡波糖浓度为4.lg/L，杂质A含量为0.8%，杂质含量仍然较高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的阿卡波糖发酵方法及其制备得到的阿卡波糖发酵液。本发明阿卡波糖的发酵方法，包括如下步骤:(I)将游动放线菌Actinoplanes species接种至放线菌种子培养基中制备种子液；(2)取步骤(I)制备的种子液，接种至放线菌发酵培养基中发酵，即得阿卡波糖发酵液，所述发酵培养基中加硒，硒元素的浓度为2 21mg/L。所述步骤(I)是取游动放线菌，接种至加硒的放线菌种子培养基中制备种子液，所述培养基中硒元素浓度为0.5-1.5mg/L ；优选地，所述放线菌种子培养基中硒元素浓度为1.5mg/L。所述步骤(2)是:取步骤(I)制备的种子液，接种至加硒的放线菌发酵培养基中发酵，所述培养基中硒元素浓度为0.5-1.5mg/L，在发酵第20-24h时，流加硒元素浓度为100-1000mg/L的硒溶液，流加量为原发酵液体积的1_2%，流加时间为0.5_lh。优选地，所述放线菌发酵培养基中硒元素浓度为1.5mg/L，硒溶液的浓度为1000mg/L，流加量为原发酵液体积的2%，流加时间为0.5h。所述硒为富硒酵母、亚硒酸钠或 者硒酸钠。其中，发酵20_24h时，添加原发酵液体积0.5%_1%糖苷酶活化液，所述糖苷酶活化液包含如下浓度的酶:淀粉酶10-100U/L、糖化酶10-100U/L、胰淀粉酶0-10U/L和普鲁兰酶0-50U/L。优选地，添加原发酵液体积1%糖苷酶活化液，所述糖苷酶活化液包含如下浓度的酶:淀粉酶50U/L、糖化酶50U/L、胰淀粉酶5U/L和普鲁兰酶20U/L。其中，发酵2(T24h时，流加补料培养基1，流加量为原发酵液体积的f 2%，流加时间为0.5^1h,所述补料培养基I包含如下重量配比的成分:麦芽糖10(Γ300份、葡萄糖50^150份、黄豆饼粉5 15份、谷氨酸2 12份、硫酸镁0.2^0.6份、磷酸氢二钾f 2份；发酵36^48h时，流加补料培养基2，流加量为原发酵液体积的10%，流加时间为36-52h，所述补料培养基2包含如下重量配比的成分:糊化醪，以原料淀粉计20(Γ600份、黄豆饼粉1(Γ15份、玉米浆干粉2 15份、谷氨酸2飞份硫酸镁0.2^0.6份和磷酸氢二钾f 2份。优选地，流加量为原发酵液体积2%，流加时间为0.5h，所述补料培养基I包含如下重量配比的成分:麦芽糖100份、葡萄糖50份、黄豆饼粉5份、谷氨酸12份、硫酸镁0.6份和磷酸氢二钾1.8份；流加量为原发酵液体积的10%，流加时间为48h，所述补料培养基2包含如下重量配比的成分:糊化醪，以原料淀粉计600份、黄豆饼粉12份、玉米浆干粉15份、谷氨酸2.5份、硫酸镁0.5份和磷酸氢二钾1.0份。其中，所述放线菌种子培养基包含如下重量配比的成分:甘油0.5^2.0份、葡萄糖10^20份、黄豆饼粉5 15份、玉米浆f 2份和碳酸钙0.5^1份。其中，所述放线菌发酵培养基包含如下重量配比的成分:葡萄糖2(Γ40份、黄豆饼粉1(Γ15份、玉米浆干粉I飞份、谷氨酸0.5^1.5份、硫酸镁0.2^0.6份、磷酸氢二钾f 2份、氯化钾0.Γ0.5份、氯化铁0.05、.1份和碳酸钙2 4份。其中，步骤(2)所述发酵的条件为:培养温度28 32°C，pH值6.5 7.2，通气量
0.3 1.5vvm，时间 92 101h。本发明发酵方法通过在发酵培养基中加入硒的方式，制备得到阿卡波糖含量为4.43g/L，杂质A含量为0.78%的发酵液，发酵周期为138h，阿卡波糖含量提高，阿卡波糖杂质A含量显著降低，发酵周期缩短，并且，含硒物质的价格低廉，因而生产成本较低。本发明优选的技术方案还采用了补加培养基、加入糖苷酶活化液的方式进一步提高发酵液的品质和缩短发酵周期，制得的发酵液中阿卡波糖含量平均高达5.53g/L，杂质A含量平均低至0.21%，发酵周期为92 101h ;本发明最优的技术方案制得的发酵液中阿卡波糖含量高达5.81g/L,杂质A含量仅0.19%,发酵周期为92h，显著优于现有技术的发酵方法。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施例方式菌种:游动放线菌SE50/110 菌株(Actinoplanes sp.SE50/110),保藏号为ATCC31044，购买。
糊化醪:按照本领域常规方法制备，如，毕金峰等，“玉米淀粉酶法生产高麦芽糖浆研究”，郑州工程学院学报，2004年9月第25卷第3期记载的方法。实施例1本发明阿卡波糖的制备方法
(I)种子培养:用接种环从斜面上挑取2环菌苔至摇瓶培养基中，将摇瓶置于28-32°C的恒温摇床中105-300rpm振荡培养；24h后将摇瓶培养基无菌操作转移至已灭菌冷却的种子罐培养基中，搅拌200rpm，通气量为0.15vvm，温度维持28_32°C，培养24h ；摇瓶种子培养基成分及制备方法如下:甘油0.5g/L、葡萄糖10g/L、黄豆饼粉5g/L、玉米浆lg/L、碳酸钙0.5g/L、纯化水适量；添加富硒酵母粉lg/L(亦可用其他含硒物质代替，保证硒元素含量0.5mg/L);用2mol/L的硫酸或氢氧化钠溶液调节pH6.5 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；种子罐培养基成分及制备方法如下:甘油0.5g/L、葡萄糖10g/L、黄豆饼粉5g/L、玉米浆lg/L、碳酸钙0.5g/L、纯化水适量；添加富硒酵母粉lg/L (亦可用其他含硒物质代替，保证硒元素含量0.5mg/L);用2mol/L的硫酸调节pH6.5 ;纯蒸汽121/C灭菌30min ；(2)发酵培养:将培养好的种子液经已灭菌消毒的管道转移至已灭菌冷却的发酵培养基中，搅拌300rpm，通气量为0.5vvm，温度维持28_32°C，培养；发酵培养基成分及制备方法如下:葡萄糖20g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆干粉L Og/L、谷氨酸0.5g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、氯化钾0.lg/L、氯化铁0.05g/L、碳酸钙2.0g/L、纯化水适量；添加富硒酵母lg/U硒元素含量0.5mg/L);用2mol/L的硫酸调节pH6.5 ;纯蒸汽121/C灭菌30min。(3)糖苷酶诱导:发酵培养至20h时，用蠕动泵向发酵培养基中添加无菌的糖苷酶活化液，持续流加0.5h，总流加体积控制在发酵培养基总体积的0.5% ；糖苷酶活化液成分及制备方法如下:淀粉酶10U/L;糖化酶10U/L;无菌纯化水适量；在超净台操作区溶解后先用
0.45 μ m滤膜过滤，再用0.22 μ m滤膜过滤至补料容器内，保温25°C ；
(4)补料培养基I流加:在糖苷酶诱导的同时往发酵罐内流加补料培养基I ;补料培养基I流加时间为0.5h，流加总量为原发酵液体积的1% ；补料培养基I成分及制备方法如下:麦芽糖300g/L、葡萄糖150g/L、黄豆饼粉15g/L、谷氨酸10g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、纯化水适量；添加富硒酵母(保证硒元素含量100mg/L);用2mol/L的氢氧化钠溶液调节ρΗ7.0 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(5)补料培养基2流加:在发酵开始后的36h开始流加补料培养基2，流加时间控制在52h，补料培养基2总量为原发酵液体积的10% ； 补料培养基2成分及制备方法如下:糊化醪(淀粉原始含量为600g/L)、黄豆饼粉15g/L、玉米浆干粉5.0g/L、谷氨酸5g/L、硫酸镁0.6g/L、磷酸氢二钾2.0g/L ;调节pH7.0 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(6)分析放罐:补料培养基2流加完毕后，继续培养8小时后放罐；取样分析阿卡波糖含量为5.63g/L及杂质A含量为0.16%。发酵周期为96h。实施例2本发明阿卡波糖的制备方法(I)种子培养:用接种环从斜面上挑取I环菌苔至摇瓶培养基中，将摇瓶置于28-32°C的恒温摇床中250rpm振荡培养；28h后将摇瓶培养基无菌操作转移至已灭菌冷却的种子罐培养基中，搅拌300rpm，通气量为0.3vvm，温度维持28_32°C，培养20h ；摇瓶种子培养基成分及制备方法:甘油1.0g/L、葡萄糖12.5g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆1.5g/L、碳酸钙lg/L、纯化水适量；添加富硒酵母粉l_3g/L (亦可用其他含硒物质代替，保证硒元素含量1.0mg/L);用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH7.5 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；种子罐培养基:甘油1.0g/L、葡萄糖12.5g/L、黄豆饼粉15g/L、、玉米浆1.5g/L、碳酸钙lg/L、纯化水适量；添加富硒酵母粉l_3g/L (亦可用其他含硒物质代替，保证硒元素含量1.0mg/L);用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH7.5 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(2)发酵培养:将培养好的种子液经已灭菌消毒的管道转移至已灭菌冷却的发酵培养基中，搅拌500rpm，通气量为0.3vvm，温度维持28_32°C，培养。发酵培养基成分及制备如下:葡萄糖40g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆干粉2.5g/L、谷氨酸lg/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、氯化钾0.2g/L、氯化铁0.lg/L、碳酸钙3.0g/L、纯化水适量；添加亚硒酸钠(保证硒元素含量lmg/L);用2mol/L的硫酸调节pH6.8 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(3)糖苷酶诱导:发酵培养至20h后，用蠕动泵以适宜转数向发酵培养基中添加无菌的糖苷酶活化液，持续流加lh，总流加体积控制在发酵培养基总体积的0.8% ；糖苷酶活化液成分及制备如下:淀粉酶100U/L;糖化酶100U/L;胰淀粉酶10U/L;普鲁兰酶50U/L;无菌纯化水适量；在超净台操作区溶解后先用0.45 μ m滤膜过滤，再用0.22 μ m滤膜过滤至补料容器内，保温65°C ；(4)补料培养 基I流加:在糖苷酶诱导的同时往发酵罐内流加补料培养基I ;补料培养基I流加时间为lh，流加总量为原发酵液体积的2% ；补料培养基I成分及制备方法如下:
麦芽糖200g/L、葡萄糖100g/L、黄豆饼粉10g/L、谷氨酸2g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、纯化水适量；添加硒酸钠(保证硒元素含量300mg/L);用2mol/L的氢氧化钠溶液调节PH6.7 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(5)补料培养基2流加:在发酵开始后的48h开始流加补料培养基2，流加时间控制在36h，补料培养基2总量为原发酵液体积的10% ；补料培养基2成分及制备方法如下:糊化醪适量(淀粉原始含量为200g/L)、黄豆饼粉10g/L、玉米浆干粉2.0g/L、谷氨酸2g/L、硫酸镁0.2g/L、磷酸氢二钾1.0g/L ;调节pH7.0 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(6)分析放罐:补料培养基2流加完毕后，继续培养10小时后放罐；取样分析阿卡波糖含量为5.12g/L及杂质A含量为0.23%。发酵周期为94h。实施例3本发明阿卡波糖的制备方法(I)种子培养:用接种环从斜面上挑取3环菌苔至摇瓶培养基中，将摇瓶置于28-32°C的恒温摇床中280rpm振荡培养；24h后将摇瓶培养基无菌操作转移至已灭菌冷却的种子罐培养基中，搅拌300rpm，通气量为0.3vvm，温度维持28_32°C，培养20h ；摇瓶种子培养基成分及制备方法:甘油2.0g/L、葡萄糖20g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆2g/L、碳酸钙lg/L、纯化水适量；添加富硒酵母粉l_3g/L (亦可用其他含硒物质代替，保证硒元素含量1.5mg/L);用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.0 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；种子罐培养基成分及制备方 法:甘油2.0g/L、葡萄糖20g/L、黄豆饼粉15g/L、、玉米浆2g/L、碳酸钙lg/L、纯化水适量；添加富硒酵母粉l_3g/L (亦可用其他含硒物质代替，保证硒元素含量1.5mg/L);用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.0 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(2)发酵培养:将培养好的种子液经已灭菌消毒的管道转移至已灭菌冷却的发酵培养基中，搅拌600rpm，通气量为1.0vvm，温度维持28_32°C，培养。发酵培养基成分及制备方法如下:葡萄糖20g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆干粉5.0g/L、谷氨酸1.5g/L、硫酸镁0.6g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、氯化钾0.4g/L、氯化铁0.lg/L、碳酸钙4.0g/L、纯化水适量；添加富硒酵母(保证硒元素含量1.5mg/L);用2mol/L的硫酸调节pH6.6 ;纯蒸汽121/C灭菌30min ；(3)糖苷酶诱导:发酵培养至20h后，用蠕动泵以适宜转数向发酵培养基中添加无菌的糖苷酶活化液，持续流加0.5h，总流加体积控制在发酵培养基总体积的1% ；糖苷酶活化液成分及制备如下:淀粉酶50U/L;糖化酶50U/L;胰淀粉酶5U/L;普鲁兰酶20U/L;无菌纯化水适量；在超净台操作区溶解后先用0.45 μ m滤膜过滤，再用0.22 μ m滤膜过滤至补料容器内，保温45 0C ；(4)补料培养基I流加:在糖苷酶诱导的同时往发酵罐内流加补料培养基I ;补料培养基I流加时间为0.5h，流加总量为原发酵液体积的2% ；补料培养基I成分及制备如下:麦芽糖100g/L、葡萄糖50g/L、黄豆饼粉5g/L、谷氨酸12g/L、硫酸镁0.6g/L、磷酸氢二钾1.8g/L、纯化水适量；添加富硒酵母(保证硒元素含量1000mg/L);用2mol/L的氢氧化钠溶液调节PH6.7 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(5)补料培养基2流加:在发酵开始后的36h开始流加补料培养基2，流加时间控制在48h，补料培养基2总量为原发酵液体积的10% ； 补料培养基2成分及制备如下:糊化醪适量(淀粉原始含量为600g/L);黄豆饼粉12g/L ;玉米浆干粉15.0g/L ;谷氨酸2.5g/L ;硫酸镁0.5g/L ;磷酸氢二钾1.0g/L ;调节ρΗ6.9 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(6)分析放罐:补料培养基2流加完毕后，继续培养8小时后放罐；取样分析阿卡波糖含量为5.8lg/L及杂质A含量为0.19%。发酵周期92h。实施例4本发明阿卡波糖的制备方法(I)种子培养:用接种环从斜面上挑取2环菌苔至摇瓶培养基中，将摇瓶置于28-32°C的恒温摇床中180rpm振荡培养；24h后将摇瓶培养基无菌操作转移至已灭菌冷却的种子罐培养基中，搅拌250rpm，通气量为0.2vvm，温度维持28_32°C，培养23h ；摇瓶种子培养基成分及制备方法:甘油1.0g/L、葡萄糖15g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆1.5g/L、碳酸钙0.5g/L、纯化水适量；添加富硒酵母粉l_3g/L(亦可用其他含硒物质代替，保证硒元素含量1.0mg/L);用2mol/L的硫酸溶液调节pH6.8 ;纯蒸汽121/C灭菌30min ；种子罐培养基成分及制备方法:甘油1.0g/L、葡萄糖15g/L、黄豆饼粉10g/L、玉米浆1.5g/L、碳酸钙0.5g/L、纯化水适量；添加富硒酵母粉l_3g/L (亦可用其他含硒物质代替，保证硒元素含量1.0mg/L);用2mol/L的硫酸溶液调节pH6.8 ;纯蒸汽121/C灭菌30min ；(2)发酵培养:将培养好的种子液经已灭菌消毒的管道转移至已灭菌冷却的发酵培养基中，搅拌800rpm，通气量为0.3vvm，温度维持28_32°C，培养。发酵培养基成分及制备方法如下:葡萄糖30g/L、黄豆饼粉15g/L、玉米浆干粉3.5g/L、谷氨酸L 0g/L、硫酸镁0.4g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、氯化钾0.25g/L、氯化铁0.075g/L、碳酸钙3.5g/L、、纯化水适量；添加富硒酵母(保证硒元素含量1.2mg/L);用2mol/L的硫酸调节pH6.5 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(3)糖苷酶诱导:发酵培养至20h后，用蠕动泵以适宜转数向发酵培养基中添加无菌的糖苷酶活化液，持续流加0.7h，总流加体积控制在发酵培养基总体积的1% ；糖苷酶活化液成分及制备方法如下:淀粉酶30U/L;糖化酶1100U/L;胰淀粉酶1U/L;普鲁兰酶50U/L;无菌纯化水适量；在超净台操作区溶解后先用0.45 μ m滤膜过滤，再用0.22 μ m滤膜过滤至补料容器内，保温50°C ；(4)补料培养基I流加:在糖苷酶诱导的同时往发酵罐内流加补料培养基I ;补料培养基I流加时间为0.5h，流加总量为原发酵液体积的1.8% ；补料培养基I成分及制备如下:麦芽糖250g/L、葡萄糖120g/L、黄豆饼粉7.5g/L、谷氨酸8g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸氢二钾1.2g/L、纯化水适量；添加富硒酵母(保证硒元素含量1000mg/L);用2mol/L的氢氧化钠溶液调节PH6.9 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(5)补料培养基2流加:在发酵开始后的43h开始流加补料培养基2，流加时间控制在46h，补料培养基2总量为原发酵液体积的10% ；补料培养基2成分及制备如下:糊化醪适量(淀粉原始含量为400g/L);黄豆饼粉12g/L ;玉米浆干粉10g/L ;谷氨酸3.5g/L ;硫酸镁0.45g/L ;磷酸氢二钾1.75g/L ;调节ρΗ6.8 ;纯蒸汽121°C灭菌30min ；(6)分析放罐:补料培养基2流加完毕后，继续培养12小时后放罐；取样分析阿卡波糖含量为5.57g/L及杂质A含量为0.29%。发酵周期101h。对比试验I1、实验方法按照传统方法制备阿卡波糖，所有培养基参照实施例1中种子培养基、发酵培养基及补料培养基I和2进行配制，均不添加硒。2、实验结果发酵96h取样分析阿卡波糖含量为2.86g/L及杂质A含量为0.28% ;发酵168h放罐，取样分析阿卡波糖含量为4.26g/L及杂质A含量为1.32%。而实施例1中发酵周期为96h，阿卡波糖含量为5.63g/L，杂质A含量0.16%。对比可以看出，发酵时间相同时(发酵96h时)，本发明发酵方法阿卡波糖含量是对比方法的1.97倍，杂质A的含量是对比方法的57.1% ;发酵结束的终产物相比，本发明方法制备得到的发酵液中阿卡波糖含量提高了 32.16%，杂质A含量降低了 87.88%，发酵周期也缩短了 42.86%ο对比试验21、实验方法用接种环从斜面上挑取2环菌苔至ATCC mediumll05培养基中，将摇瓶置于28-32°C的恒温摇床中180rpm振荡培养24h ;分别以10%接种量转移至加硒组、不加硒组中发酵培养基中，维持温度在28-32°C，通气量1.0vvm。ATCC mediumll05培养基:蔗糖30.0g、蛋白胨2.0g、酪蛋白水解物1.0g、K2HPO4.3Η201.0g, KC10.5g, MgSO4.7Η200.5g, FeSO4.7Η200.Ig,纯化水 1.0L,调节 pH 为 7.2 ;ATCC mediumll05改良培养基(不加硒组):向ATCC mediumll05中添加麦芽糖3g/L ;糊化醪适量(淀粉原始含量为60g/L)，调节pH7.2。ATCC mediumll05改良培养基(加硒组):向ATCC mediumll05改良培养基(不加硒组)添加硒元素，硒元素浓度为10mg/L。菌种:游动放线菌(Actinoplanessp.) ATCC31044。2、实验结果不加硒组，发酵至96h取样分析阿卡波糖含量为2.25g/L,杂质A含量为0.5% ;继续发酵至168h后放罐，分析阿卡波糖含量为3.75g/L，杂质A含量为1.46% ；加硒组发酵至96小时取样分析阿卡波糖含量为2.91g/L,杂质A含量为0.18，发酵至136h结束，放罐后分析阿卡波糖含量为4.43g/L,杂质A含量为0.78%。对比可以看出，发酵时间相同时(发酵96h时)，本发明发酵方法阿卡波糖含量是对比方法的1.29倍，杂质A的含量是对比方法的36% ;发酵结束的终产物相比，本发明方法制备得到的发酵液中阿卡波糖含量提高了 18.13%，杂质A含量降低了 46.58%，发酵周期也缩短了 19.05%。 综上，本发明在发酵培养基中添加硒元素的方法，可以显著降低阿卡波糖杂质A的含量，提高阿卡波糖含量，缩短发酵周期，添加糖苷酶活化液和流加补料培养基的方式可以进一步优化发酵方法，提高发酵终产物的质量和缩短发酵周期，降低生产成本。
权利要求
1.一种阿卡波糖的发酵方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)将游动放线菌Actinoplanesspecies接种至放线菌种子培养基中制备种子液； (2)取步骤(I)制备的种子液，接种至放线菌发酵培养基中发酵，即得阿卡波糖发酵液，所述发酵培养基中加硒，硒元素的浓度为2 2 lmg/L。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于:所述步骤(I)是取游动放线菌，接种至加硒的放线菌种子培养基中制备种子液，所述培养基中硒元素浓度为0.5-1.5mg/L。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于:所述步骤(2)是:取步骤(I)制备的种子液，接种至加硒的放线菌发酵培养基中发酵，所述培养基中硒元素浓度为0.5-1.5mg/L，在发酵第20-24h时，流加硒元素浓度为100-1000mg/L的硒溶液，流加量为原发酵液体积的1_2%，流加时间为0.5-lh。
4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于:所述放线菌发酵培养基中硒元素浓度为1.5mg/L，硒溶液的浓度为1000mg/L，流加量为原发酵液体积的2%，流加时间为0.5h。
5.根据权利要求Γ4任意一项所述的发酵方法，其特征在于:所述硒为富硒酵母、亚硒酸钠或者硒酸钠。
6.根据权利要求Γ4任意一项所述的发酵方法，其特征在于:发酵20-24h时，添加原发酵液体积0.5%-1%的糖苷酶活化液，所述糖苷酶活化液包含如下浓度的酶:淀粉酶10-100U/L、糖化酶10-100U/L、胰淀粉酶0-10U/L和普鲁兰酶0-50U/L。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于:添加原发酵液体积1%的糖苷酶活化液，所述糖苷酶活化液包含如下浓度的酶:淀粉酶50U/L、糖化酶50U/L、胰淀粉酶5U/L和普鲁兰酶20U/L。
8.根据权利要求Γ4任意一项所述的发酵方法，其特征在于: 发酵2(T24h时流加补料培养基1，流加量为原发酵液体积的Γ2%，流加时间为0.5 lh，所述补料培养基I包含如下重量配比的成分:麦芽糖10(Γ300份、葡萄糖5(Γ150份、黄豆饼粉5 15份、谷氨酸2 12份、硫酸镁0.2^0.6份和磷酸氢二钾f 2份； 发酵36 48h时流加补料培养基2，流加量为原发酵液体积的10%，流加时间为36-52h，所述补料培养基2包含如下重量配比的成分:糊化醪，以原料淀粉计20(Γ600份、黄豆饼粉1(Γ15份、玉米浆干粉2 15g份、谷氨酸2飞份、硫酸镁0.2^0.6份和磷酸氢二钾f 2份。
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于: 流加量为原发酵液体积的2%，流加时间为0.5h，所述补料培养基I包含如下重量配比的成分:麦芽糖100份、葡萄糖50份、黄豆饼粉5份、谷氨酸12份、硫酸镁0.6份和磷酸氢二钾1.8份； 流加量为原发酵液体积的10%，流加时间为48h，所述补料培养基2包含如下重量配比的成分:糊化醪，以原料淀粉计600份、黄豆饼粉12份、玉米浆干粉15份、谷氨酸2.5份、硫酸镁0.5份和磷酸氢二钾1.0份。
10.根据权利要求Γ4任意一项所述的发酵方法，其特征在于: 所述放线菌种子培养基是ATCC mediumll05培养基或者是包含如下重量配比成分的培养基:甘油0.5^2.0份、葡萄糖1(Γ20份、黄豆饼粉5 15份、玉米浆f 2份和碳酸钙0.5^1份； 所述放线菌发酵培养基包含如下重量配比的成分:葡萄糖2(Γ40份、黄豆饼粉1(Γ15份、玉米浆干粉I飞份、谷氨酸0.5^1.5份、硫酸镁0.2^0.6份、磷酸氢二钾f 2份、氯化钾.0.0.4份、氯化铁0.05、.1份和碳酸钙2 4份；或者，蔗糖30份、蛋白胨2份、酪蛋白水解物 I 份、K2HPO4.3H201 份、KC10.5 份、MgSO4.7Η200.5 份、FeSO4.7Η200.I 份、麦芽糖 3 份和糊化醪，其以原料淀粉计60份； 步骤(2)所述发 酵的条件为:培养温度28 32°C，pH值6.5^7.2，通气量0.3^1.5vvm,时间 92 101h。
全文摘要
本发明公开了一种阿卡波糖的发酵方法，包括如下步骤(1)取游动放线菌Actinoplanes species，接种至放线菌种子培养基中制备种子液；(2)取步骤(1)制备的种子液，接种至放线菌发酵培养基中发酵，即得阿卡波糖发酵液，所述发酵培养基中加硒，硒元素的浓度为2~21mg/L。本发明发酵方法提高了阿卡波糖的产量，显著降低阿卡波糖杂质A的含量，缩短了发酵周期。
文档编号C12R1/045GK103088089SQ20131000962
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者杨军, 杨秋艳, 程志鹏, 梁隆, 王利春, 沈鑫 申请人:伊犁川宁生物技术有限公司