一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法。
【背景技术】
[0002] 阿卡波糖(Acarbose)是一种从放线菌中分离得到的由四个单糖构成的寡糖，对小 肠壁细胞刷状缘的α-葡萄糖苷酶具有竞争性抑制作用，能阻碍肠道内的多糖和低聚糖的水 解，从而减少小肠对单糖的吸收，达到降低餐后血糖浓度的目的，是II型糖尿病的常用药物 之一。
[0003] 2015版中国药典增收了阿卡波糖的质量标准，其含量测定的方法为高效液相色谱 法，与欧洲药典中收录的方法一致。该方法采用氨基色谱柱，紫外检测器，以乙腈-磷酸盐缓 冲液(75:25)为流动相，在2mL · mirT1的流速，210nm检测波长，35°C柱温的条件下进行测定。 但采用这种方法进行测定无法实现阿卡波糖(其结构式为下式I)与杂质A(其结构式为下式 II)的完全分离，因此只能采用峰谷比进行限定，并且存在有关物质干扰大、及柱流失严重 等问题。
[0005] 目前国内外关于阿卡波糖的检测方法有HPLC-UV、HPLC-ELSD、HPLC-RID及CE法。 Xie等将C18水相柱用于阿卡波糖的含量测定，但流动相中需添加离子对试剂;HPLC-ELSD/ RID法主要用于阿卡波糖原料药或发酵液中无生色团杂质（葡萄糖、麦芽糖）的分离。 B. Lachmann等利用CE法对阿卡波糖及其代谢物进行了分析研究。这些方法主要是针对于阿 卡波糖或阿卡波糖代谢物等，并未很好地解决阿卡波糖及其杂质分离效果差、有关物质干 扰大、及柱流失严重等问题。
[0006] 现有阿卡波糖检测方法中阿卡波糖无法与杂质A实现完全分离，不能更好地控制 阿卡波糖的产品质量;且现有检测方法流速快、运行时间长、试剂消耗量大；以及氨基柱键 合相易流失，色谱柱寿命短，给分析工作带来不便，检测成本高等一系列问题。因此，迫切需 要一种分离度良好、柱稳定性高的测定阿卡波糖及其杂质的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种准确度高、柱稳定性好的高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法， 实现了阿卡波糖与杂质A的完全分离，从而可以更好地控制产品质量。
[0008] 本发明提供了一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，采用如下色谱条件：
[0009] 色谱柱：XBridge Amide柱（waters,4.6mmX250mm,3·5μηι);
[0010] 流动相:有机相-水相；
[0011] 流速：1.0-1.4mL/min;
[0012] 检测波长：210nm;
[0013] 柱温：60-70°C;
[0014] 进样量：10-20yL;
[0015] 检测器采用紫外检测器；
[0016] 所述流动相中的有机相为乙腈，所述流动相中含有乙酸铵，乙酸铵浓度范围为5-10mM，pH 范围为 5.0-10.0;
[0017]所述流动相中有机相-水相的体积比例为75:25-80:20。
[0018]所述流动相优选为预混流动相，即提前将乙腈、水和乙酸铵缓冲液按比例混合均 匀后使用。与在先混合缓冲盐相比，预混流动相可以避免高浓度时乙腈盐析出，重现性好， 可以更好地减少基线噪音和溶剂峰。
[0019] 本发明提供的一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，色谱条件优选为:流动 相中有机相-水相的体积比例为75:25;流动相中乙酸铵浓度为10mM，pH为9.0;流速:1.2mL/ min，柱温:65 °C，进样体积：20yL。
[0020] 本发明提供的一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，其特征为：
[0021] (1)称取适量的阿卡波糖标准品溶解于流动相中，得阿卡波糖标准品溶液备用；
[0022] (2)称取适量的阿卡波糖样品溶解于流动相中，得阿卡波糖样品溶液备用；
[0023] (3)取阿卡波糖标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述色谱条件 进行高效液相色谱分析。
[0024]本发明选用的色谱柱为XBridge Amide色谱柱，使用了化学稳定的、三键键合式的 酰胺官能团，其选择性与氨基柱相近，且基于亚乙基桥杂化颗粒技术，色谱柱耐受性更强， PH2-11条件下均可以检测，极端pH条件下最高柱温可达90°C，相对于现有方法中规定的氨 基键合相的稳定性更高，柱流失减少，寿命更长。
[0025]本发明提供的高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，与现有方法相比，具有明显 的优点：实现了阿卡波糖与杂质A的完全分离，并且多分离出一种未知杂质，更好的实现阿 卡波糖的质量控制，提高了分析的准确性;各杂质的专属性、线性及范围、回收率、精密度、 耐用性等试验均良好;所选色谱柱柱稳定性好;且流动相配制简单、检测成本低。
【附图说明】
[0026] 图1为杂质A与阿卡波糖对照品混合液色谱图；其中，1-阿卡波糖，4-杂质A;
[0027] 图2为峰鉴别阿卡波糖标准品色谱图；其中，1-阿卡波糖，2-杂质D，3_杂质B，4_杂 质A，5-新杂质，6-杂质C，7-杂质E，8-杂质F，9-杂质G;
[0028] 图3为EDQM提供的峰鉴别阿卡波糖标准品色谱图；
[0029] 图4为实施例1的阿卡波糖供试品色谱图；其中，1-阿卡波糖，4-杂质A，5_新杂质；
[0030] 图5为对比例1的阿卡波糖供试品色谱图；其中，1-阿卡波糖，4-杂质A。
【具体实施方式】
[0031] 本发明一种高效液相色谱法检测阿卡波糖的方法，步骤包括:配置阿卡波糖标准 品溶液备用;配置阿卡波糖样品溶液备用;取阿卡波糖标准品溶液和样品溶液，注入高效液 相色谱仪，进行高效液相色谱分析。
[0032] 其中，高效液相色谱分析中的色谱条件的选择，对本发明提高分析的准确性而言 是重要的。尤其是本发明将XBridge Amide柱作为高效液相色谱法检测阿卡波糖的色谱柱， 较之现有的高效液相色谱法检测阿卡波糖的氨基柱效果好。具体而言，色谱条件为：色谱 柱：XBridge Amide柱(waters，4·6mmX 250mm，3· 5μηι);流动相组成：乙臆-水（75: 25，v/v)， 含10mM乙酸铵缓冲盐(pH 9.0);所用紫外检测器的检测波长:210nm;流速：1.2mL/min;柱 温:65°C;进样体积:20yL。本发明通过前期大量实验摸索，综合考虑阿卡波糖的保留时间及 与杂质的分离情况，最终确定流动相中乙腈-水的体积比为75:25-80:20，优选流动相中乙 腈-水的体积比为75: 25。选用L934正交表，考察流动相pH、柱温、盐浓度和流速4个高效液相 色谱方法条件参数，具体如下：
[0033] 因素 A:流动相pH。考察酸性、中性和碱性条件对阿卡波糖峰型及保留的影响，故设 定以下水平:①3.0②6.8③9.0。
[0034]因素 B:柱温。预实验中35°C条件下阿卡波糖存在双峰现象，考虑到糖类α、β异构体 间的转化率随温度变化而变化，提高温度可使分裂峰合并为单峰。故考察的水平为①45°C ②55°C ③65°C。
[0035] 因素 C:流动相中的盐浓度。为得到良好的峰型和保留作用，在流动相中添加缓冲 盐，结合所用色谱柱性质，优选乙酸铵。考察水平为①5mM②10mM③20mM。
[0036] 因素 D:流速。流速不仅影响着保留时间，也与化合物间的分离情况有关。设定以下 水平考察:①1.0mL/min ②1.2mL/min ③1.4mL/min。
[0037] 每个试验条件下进样顺序分别如下：
[0038] (1)空白（流动相）
[0039] (2)杂质A与阿卡波糖对照品混合液
[0040] (3)峰鉴别阿卡波糖标准品溶液
[0041]优劣判断因素 :①可分离的杂质个数η;②阿卡波糖色谱峰的拖尾因子T;③杂质A 与主峰的分离度R。
[0042] 表1列出了正交试验的因素与水平组合及相应的试验数据，按照主峰拖尾因子越 接近1.0越好、杂质个数越多越好、杂质A与主峰分离度越大越好的原则，对它们分别按单指 标进行极差分析，计算结果如表2所示。
[0043]表1方法条件参数的正交试验结果
[0044]
[0045] 备注:试验序号1条件下，阿卡波糖峰为双峰，主峰拖尾因子以"一一"表示
[0046] 表2极差分析表
[0047]
[0048] 根据表2和表3的结果显示，对于主峰拖尾因子而言，因素主次顺序为:D>A(B)> C，优选方案为:A3B3C3D1;
[0049]对于杂质个数而言，因素主次顺序为:A>B(D)>C，优选方案为：A3B2C1(C2)D1 (D2);
[0050] 对于杂质A与主峰分离度而言，因素主次顺序为：A>D>C>B，优选方案为： A3B2C2D1。
[0051] 由于对于不同指标而言，因素主次、水平优劣差异较大，确定整体最优因素水平， 有一定难度，因此综合各指标的优选方案初步确定整体较优组合，通过再次试验，确定最优 组合。其中因素 A选定水平3;因素 B可选水平2或3;因素 C在三项指标中影响均较小，选定中 间值水平2;因素 D可选水平1或2。故综合平衡因素水平初步确定的较优组合为A3B3C2D1、 A3B2C2D1、A3B3C2D2或A3B2C2D2。
[0052] 为了确定最优组合，对四种可能的组合进行再次试验，具体结果见表3数据所示。
[0053] 表3组合筛选再试验结果
[0055] 表3显示，四种条件下，主峰均有良好的对称性，从杂质A与主峰分离度来看， A3B3C2D1、A3B3C2D2 优于 A3B2C2DUA3B2C2D2,而 A3B3C2D2 的保留时间要比 A3B3C2D1 的更短 一些，所以选定的最优组合为A3B3C2D2。故本发明最优选的色谱条件参数为:pH 9.0，柱温 65°C，盐浓度为 10mM，流速 1.2mL/min。
[0056] 本发明色谱条件中色谱柱和流动相的配合使用，更好的实现阿卡波糖的质量控 制，提高了分析的准确性。
[0057] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但是本发明的保护范围并不仅限于实 施例。
[0058]在下面的各实施例中，所用仪器的信息如下：
[0059] 高效液相色谱仪系统：型号：岛津LC-20A，包括LC-20AT栗;DGU-20A脱气机;SIL-20A自动进样器;CTO-lOASvp柱温箱；SPD-20A紫外检测器;Lab solution色谱工作站；
[0060] Waters XBridge Amide色谱柱：规格4.6mmX250mm,3·5μηι粒径；
[0061 ]万分之一电子天平:AR1140型，Ohaus Corp.Brook，NJ，USA;
[0062] 十万分之一电子天平:MS105Du型，METTLER TOLEDO;
[0063] 电子pH计:pH Meter PHS-3C型，上海精科实业有限公司；
[0064] 超声波清洗器:SK250HP型，无锡建仪实验器材有限公司。
[0065]在下面的实施例中，所用的各试剂信息如下：
[0066] 阿卡波糖对照品：中国食品药品检定研究所，批号：100808-201203，含量95.8% ;
[0067] 峰鉴别阿卡波糖标准品：ACARB0SE FOR PEAK IDENTIFICATION CRS(20mg，含有A、 B、C、D、E、F