一种薁磺酸钠有关物质的RT‑HPLC检测方法与流程

本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种薁磺酸钠有关物质的反向高效液相色谱检测方法。

背景技术：

在药物分析中所称的“有关物质(related substances)”是指在原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质，也可能是制剂在生产、贮藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。有关物质的种类与药物的合成路线和制剂工艺密切相关，药物在合成和制剂过程中的任何一个因素的改变都可能导致其有关物质的种类不同，因而有关物质的检测和控制过程相对复杂。有关物质的检测是控制药品质量的重要指标。

薁磺酸钠(Sodium Azulene Sulfonate)，又名呱仑酸钠，系自菊科植物花中提取的一种化学物质，近年研究发现其具有下述作用：抑制多种致炎物质引起的炎症，且作用较为持久；通过局部直接作用抑制炎性细胞释放组胺；增加粘膜内前列腺素E2的合成，促进肉芽形成和上皮细胞新生；降低胃蛋白酶的活性。

薁磺酸钠，化学名为1,4-二甲基-7-异丙基薁-3-磺酸钠，其结构式如下：

薁磺酸钠有关物质如下：愈创薁、杂质A、杂质B、杂质C，其中愈创薁，为薁磺酸钠合成工艺的起始物料；杂质A是薁磺酸钠同分异构体；杂质B、杂质C是氧化降解杂质，上述杂质结构见表1。

表1薁磺酸钠各杂质名称及结构

国内外已公开的关于薁磺酸钠的药品标准中仅对有关物质的总含量进行了限定，而并未限定任何单一杂质的含量。日本药局方外医药品成分规格(1989)对原料药有收载，对样品中的有关物质愈创薁采用加正己烷过滤，滤液用光度法测定透过率的方法测定，灵敏度低。薁磺酸钠作为原料药应用于不同制剂时，需要检测其相关杂质的含量，判断磺酸钠原料药是否合格，是否需要采取相关手段进行控制。现有文献报道的方法无法分离上述杂质，更无法确定其的具体含量。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种薁磺酸钠有关物质的RT-HPLC检测方法，通过用苯基硅烷反相色谱柱，调整适当的洗脱梯度，解决了薁磺酸钠特征峰与其异构体、氧化杂质特征峰分离的问题，实现了对薁磺酸钠原料药质量的控制，且此方法灵敏度高，专属性强，操作简单。

本发明的薁磺酸钠有关物质RT-HPLC的检测方法，包括以下步骤：

a)配置分析溶液

b)色谱条件

色谱柱为反相色谱柱，以酸或磷酸盐水相溶液与有机相的混合液为流动相，所述水相溶液为弱酸性，所述的有机相选自甲醇；采用梯度洗脱方法，所述梯度洗脱方法流动相中水相体积比例按0、8～12、39～44、48～53、55～58min时间点，水相体积比为95-98％、85-90％、85-90％、30-40％、25-30％进行梯度洗脱；

c)上机测定

取步骤a)制成的分析溶液5-30μl注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱图。

优选方案，所述步骤a)样品分析溶液配制遵循以下要求：用甲醇-磷酸盐水溶液溶解样品，制成分析溶液，所述的甲醇-磷酸盐水溶液中有机相体积百分比大于50％。所述步骤b)色谱条件中，设定高效液相流速为0.8-1.2ml/min；柱温为25-50℃，采用检测波长为220-300nm紫外检测器；

在一些实施例中，所述反相色谱柱的填充剂为苯基硅烷键合硅胶色谱柱或十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱或八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，优选为苯基硅烷键合硅胶色谱柱。

在一些实施例中，所述反相色谱柱的规格为：柱长介于100mm至300mm，色谱柱内径介于1mm至10mm，粒径介于1μm至10μm，优选为规格为4.6mm×250mm，5μm的苯基硅烷键合硅胶色谱柱。

在一些实施例中，所述磷酸盐溶液的浓度为0.001-0.05mol/L、pH 2.0-4.0，优选磷酸盐溶液的浓度为0.02mol/L、pH 2.7-3.5。

在一些实施例中，所述磷酸盐为磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中之一，优选磷酸二氢钾。

在一些实施例中，所述A相为磷酸盐溶液-甲醇，所述磷酸盐溶液-甲醇的体积比为10:90-80:20，优选体积比为80:20。

优选方案为：步骤a)用甲醇-磷酸盐水溶液溶解样品，制成分析溶液，所述的甲醇-磷酸盐水溶液中有机相体积百分比大于50％；步骤b)为所述梯度洗脱条件为反相色谱柱为柱长250mm、直径4.6mm、填料粒径5μm的苯基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相为以0.02mol/L、pH 3.0磷酸二氢钾溶液-甲醇为A相，流动相中A相-甲醇比例按0、10、40、50、58min时间点，A相体积比为97％、88％、85％、35％、30％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温30℃，检测波长245nm；步骤c)取步骤a)制成的分析溶液注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，并记录色谱。

在一些实施例中，所述样品为薁磺酸钠或其相关制剂。所述薁磺酸钠相关制剂为片剂、颗粒剂。

上述方法分析可用于分离样品中杂质A、杂质B、杂质C、愈创薁、薁磺酸钠。

本发明能够有效的测定薁磺酸钠溶液中各种相关杂质的存在，尤其实现了谱图中薁磺酸钠特征峰与薁磺酸钠同分异构体特征峰及其相关起始物料、氧化杂质特征峰的分离。各个杂质的分离度均大于1.5，其中薁磺酸钠与其同分异构体分离度达到3.5，拖尾因子2.5以下，理论塔板数均在8000以上。本技术发明一种检测薁磺酸钠有关物质方法，该检测方法简单、快捷、灵敏度高、准确度高。

上述方法的检测可以确保产品的质量可控。

附图说明

图1、实施例1流动相条件的色谱图；

图2、实施例2流动相条件的色谱图；

图3、实施例3梯度洗涤的色谱图。

图4、实施例4梯度洗涤的色谱图。

图5、实施例5梯度洗涤的色谱图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例一

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：SUPELCOSILLC-DP(4.6mm×250mm，5μm)的苯基硅烷键合硅胶色谱柱

配置0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)为A相，流动相中A相-甲醇的比例按0、5、15、40、45、46、52min时间点，A相体积比为88％、88％、60％、25％、25％、88％、88％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温30℃，检测波长245nm；

(2)实验步骤

分别取薁磺酸钠对照品、杂质A、杂质B、杂质C及愈创薁对照品各适量，用溶剂[0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(30:70)]制成每ml含薁磺酸钠0.5mg、其他各杂质各含5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图1，可以看出该条件下薁磺酸钠主峰和其同分异构体杂质A峰未能完全基线分离。

实施例二

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：SUPELCOSILLC-DP(4.6mm×250mm，5μm)的苯基硅烷键合硅胶色谱柱

配置0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)为A相，流动相中A相-甲醇的比例按0、5、15、45、50、51、55min时间点，A相体积比为88％、88％、70％、40％、25％、88％、88％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温30℃，检测波长245nm；

(2)实验步骤

分别取薁磺酸钠对照品、杂质A、杂质B、杂质C及愈创薁对照品各适量，用溶剂[0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(30:70)]制成每ml含薁磺酸钠0.5mg、其他各杂质各含5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图2，可以看出该条件下薁磺酸钠主峰和其同分异构体杂质A峰仍未能完全基线分离。

实施例三

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：SUPELCOSILLC-DP(4.6mm×250mm，5μm)的苯基硅烷键合硅胶色谱柱

配置0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇为A相，其中水相与甲醇相体积比为80:20，流动相中A相-甲醇的比例按0、10、40、50、58、58.1、63min时间点，A相体积比为97％、88％、85％、35％、30％、97％、97％进行梯度洗脱，流速1.0ml/min；柱温30℃，检测波长245nm；

(2)实验步骤

分别取薁磺酸钠对照品、杂质A、杂质B、杂质C及愈创薁对照品各适量，用溶剂[0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(30:70)]制成每ml含薁磺酸钠0.5mg、其他各杂质各含5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图3及表1所示，可以看出该条件下各峰分离度均能到达有效分离，其中薁磺酸钠主峰和其同分异构体杂质A峰完全分离，分离度为3.05，各峰理论塔板数均大于8000。

表1实施例3色谱结果表

实施例四

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：SUPELCOSILLC-DP(4.6mm×250mm，5μm)的苯基硅烷键合硅胶色谱柱

配置0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至2.8)-甲醇为A相，其中水相与甲醇相体积比为80:20，流动相中A相-甲醇的比例按0、10、40、50、58、58.1、63min时间点，A相体积比为97％、88％、85％、35％、30％、97％、97％进行梯度洗脱，流速0.8ml/min；柱温30℃，检测波长245nm；

(2)实验步骤

分别取薁磺酸钠对照品、杂质A、杂质B、杂质C及愈创薁对照品各适量，用溶剂[0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(30:70)]制成每ml含薁磺酸钠0.5mg、其他各杂质各含5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图4。

实施例五

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站；

色谱柱：SUPELCOSILLC-DP(4.6mm×250mm，5μm)的苯基硅烷键合硅胶色谱柱

配置0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.2)-甲醇为A相，其中水相与甲醇相体积比为80:20，流动相中A相-甲醇的比例按0、10、40、50、58、58.1、63min时间点，A相体积比为97％、88％、85％、35％、30％、97％、97％进行梯度洗脱，流速1.2ml/min；柱温30℃，检测波长245nm；

(2)实验步骤

分别取薁磺酸钠对照品、杂质A、杂质B、杂质C及愈创薁对照品各适量，用溶剂[0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(30:70)]制成每ml含薁磺酸钠0.5mg、其他各杂质各含5μg的系统适用性溶液，作为分析溶液；

取上述分析溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图5。