一种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质组学的技术领域，涉及一种治疗性单克隆抗体药物贝伐珠单抗 (Bevac i zumab)的药代动力学质谱分析方法。
【背景技术】
[0002]单克隆抗体药物是以γ型免疫球蛋白（Immunoglobulin G)结构为基础的一类具 有特殊治疗效果的蛋白质药物，已成功应用于癌症、自身免疫疾病、病毒感染和中枢神经紊 乱等多种疾病的临床治疗。同传统的小分子药物或中药制剂相比，单克隆抗体药物有着明 确的药理活性和优异的药动学性质；单克隆抗体在体内代谢程度较低，可在体液中长期保 持较高浓度，血清消除半衰期平均长达数周至数月。因此，及时建立规范可靠的分析方法并 开展单克隆抗体药物药代动力学研究对于支持单克隆抗体药物研发具有十分重要的意义。 目前，蛋白类药物药代动力学研究多采用酶联免疫吸附方法（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)和放射性免疫标记方法（radioimmunoassay，RIA)。其中 ELISA因其较高灵敏度和适合批量测定等优点，已成为最为常用的蛋白多肽类药物生物样 品分析方法。然而，在单克隆抗体药动学实验中，ELISA方法定量范围较窄(通常为一至两个 数量级），不能对不同形态的单抗（即，单克隆抗体)药物进行同时分析，且存在开发周期长 (半年至数年），成本高(数十万至百万/目标药物），无法区分内源性蛋白的干扰等问题，大 大影响了ELISA定量的可靠性和实用性。对于RIA方法而言，有些放射性标记分子的目标抗 体会表现出与原型药物不同的吸收，分布和代谢特征；另外含有放射性标记的单克隆抗体 通常只能稳定存在2~3周，无法适应中长期单克隆抗体药代动力学研究。因此建立规范可 靠的分析方法对单克隆抗体药物研发具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是，克服现有的蛋白类药物药代动力学分析方法影响定 量的可靠性和实用性的缺点，建立一种单克隆抗体药物Bevacizumab的药代动力学质谱分 析方法。
[0004] 本发明采取的技术方案是，选取经胰酶水解Bevacizumab获得的特异性肽段，其中 特异性是指肽段只由Bevacizumab经胰酶水解产生，其他蛋白质及蛋白质类药物经胰酶水 解并不能产生该肽段。基于液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)技术，利用平行反应监测(PRM) 模式对特异性肽段进行扫描分析，建立特异性肽段稳定、可靠的LC/MS/MS定量方法。采取上 述方法即可实现利用正常肽段定量Bevacizumab水平。正常肽段即是待测肽段。
[0005] 本发明的具体技术方案如下所述。
[0006] -种单克隆抗体药物的药代动力学质谱分析方法，所述的单克隆抗体药物为贝伐 珠单抗(Be vac i zumab);按如下7步骤进行血衆样品中单抗浓度的测定；
[0007] (1)血浆样品的还原：于聚乙烯管中加入2yL大鼠的血浆样品，加入96yL含有变性 剂的pH缓冲液，涡流混匀;加入2yL还原剂，涡流混匀;60°C孵育1小时，得到反应液；
[0008] (2)半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25 °(：避光孵育40min;
[0009] (3)血浆样品的胰酶消化:经半胱氨酸封闭的反应液中加入700yL消化缓冲液，涡 流混合，再加入3yL胰酶溶液，涡流混合，37 °C孵育12~16h得到血浆样品酶解液，加入5yL甲 酸终止反应；
[0010] ⑷内标的引入:于酶解液中加入1〇此稳定同位素标记的内标肽段，祸流混勾，得 到血浆样品的反应液；
[0011] (5)血浆反应液的固相萃取:于固相萃取柱中加入lmL乙腈溶液，至液体自然流完； 于固相萃取柱中加入lmL淋洗溶液，至液体自然流完;取血浆样品的反应液，至液体自然流 完;于固相萃取柱中加入lmL淋洗溶液，至液体自然流完，3遍洗;于固相萃取柱中加入lmL洗 脱溶液，至液体自然流完，得血浆样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
[0012] (6)血浆样品的浓缩复溶：将血浆样品洗脱液真空离心蒸干，加入1 OOyLO . 1 %甲 酸，涡流混匀，得到血浆样品的复溶液；
[0013] (7)血浆样品的质谱分析:取血浆样品复溶液2yL进行液相色谱-串联质谱分析，记 录色谱图，将所选的特异性肽段峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线y = 〇.000239987+ 0.0684449x，其中，X为特异性肽段峰面积与内标峰面积比值，y为以ng/yL为单位的单抗浓 度，求得肽段浓度，此肽段浓度即为对应血浆样品中Bevacizumab浓度。
[0014] 所述的标准曲线y = 0.000239987+0.0684449X，建立过程有标准系列溶液的配置 和大鼠血楽标准曲线样品的制备；
[0015] 所述的单抗标准系列溶液的配置，是利用去离子水将单抗标准溶液储备液(25yg/ μυ 分别稀释至5、10、40、100、500、1000、1200ng/yL;
[0016] 所述的大鼠血浆标准曲线样品的制备，有如下7步骤，
[0017] (1)大鼠血浆标准曲线样品的还原：于聚乙烯管中分别加入2yL上述步骤中的单抗 标准系列溶液;加入2yL大鼠的空白血浆，涡流混匀;加入94yL含有变性剂的pH缓冲液，涡流 混匀;加入2yL还原剂，祸流混匀;60 °C孵育lh，得到反应液；
[0018] (2)半胱氨酸的封闭：于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；25 °(：避光孵育40min;
[0019] (3)大鼠血浆标准曲线样品的胰酶消化:经半胱氨酸封闭的反应液中加入700yL消 化缓冲液，涡流混合，再加入3yL胰酶溶液，涡流混合，37°C孵育12~16h得到单抗大鼠血浆 标准曲线样品酶解液，后加入5yL甲酸终止反应；
[0020] (4)内标的引入:于单抗大鼠血浆标准曲线样品酶解液中加入10yL稳定同位素标 记的内标肽段，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液；
[0021] (5)单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液的固相萃取:于固相萃取柱中加入lmL乙腈 溶液，至液体自然流完;于固相萃取柱中加入lmL淋洗溶液，至液体自然流完;取步骤(4)得 到的单抗大鼠血浆标准曲线样品反应液加入到固相萃取柱中，至液体自然流完;于固相萃 取柱中加入lmL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗;于固相萃取柱中加入lmL洗脱溶液，至 液体自然流完，得单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱液，置于聚乙烯管中；
[0022] (6)单抗大鼠血浆标准曲线样品的浓缩、复溶:将单抗大鼠血浆标准曲线样品洗脱 液真空离心蒸干，加入lOOyL 0.1 %甲酸，涡流混匀，得到单抗大鼠血浆标准曲线样品复溶 液；
[0023] (7)单抗大鼠血浆标准曲线样品的质谱分析：
[0024] 取2yL单抗大鼠血浆标准曲线样品复溶液进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱 图，以初始单抗标准系列溶液中单抗浓度为横坐标，所选的酶解后特异性肽段峰面积与内 标峰面积比值为纵坐标，用加权W=l/x 2最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程， 即为标准曲线。
[0025] 本发明的治疗性单克隆抗体药物的质谱分析方法，所述的含有变性剂的pH缓冲 液，是含有8M尿素的50mM HEPES缓冲溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液）；所述的还原剂， 是1M的二硫苏糖醇溶液;所述的半胱氨酸封闭剂，是固体碘乙酰胺试剂;所述的消化缓冲 液，是50mM的HEPES缓冲溶液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液）；所述的胰酶溶液，是lmg/mL 的胰酶水溶液;所述的淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液;所述的洗脱溶 液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸=80/20/0.1的溶液。
[0026] 在大鼠血浆标准曲线制备及血浆样品单抗浓度测定过程中，
[0027]色谱条件为：美国赛默飞世尔公司Ultimate 3000系列高效液相色谱系统；色谱 柱：自制peptide C18毛细管色谱柱，15cmX75ym I.D.，5μηι粒径;流动相：甲酸体积百分数 占0.1 %的水和甲酸体积百分数占0.1 %的乙腈，梯度洗脱;流速300nL/min;进样量2yL; [0028]质谱条件为:Q-Exactive Orbitrap四级杆-轨道讲液相色谱-串联质谱仪，配有纳 升级电喷雾离子化源和Xcalib