ur 2.1数据处理软件;离子源:纳升级电喷雾离子化源;正离 子方式检测；扫描方式为平行反应监测;全扫分辨率为70000，目标扫描分辨率为35000，最 大注入时间为200ms。
[0029] 本发明的一种治疗性单克隆抗体药物的质谱分析方法的色谱条件中，所述的梯度 洗脱程序，过程见表1，
[0030] 表1梯度洗脱程序
[0032]其中A是甲酸体积百分数占0.1%的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1%的乙腈溶 液。
[0033]本发明的优势在于：
[0034] 1、对单抗的酶解特异性肽段进行分析和定量，具有高通量、灵敏度高、重现性好等 特点。2、本发明所用试剂及药品较现有技术更廉价易得，且配制方法简单，利于方法推广。 3、本发明的样品处理过程和定量方法简单易行，不仅适用于本发明中所述的单抗药物 Bevacizumab，对其他蛋白类药物和多肽药物的定性和定量研究也具有指导借鉴意义。
【附图说明】
[0035] 图1是单抗酶解后特异性肽段标准品的典型色谱图。
[0036] 图2是合成的稳定同位素的内标肽段的典型色谱图。
[0037] 图3是实施例1得到的血浆样品中特异性肽段的典型色谱图。
[0038] 图4是实施例1得到的血浆样品中内标肽段的典型色谱图。
[0039 ]图5是实施例1得到的大鼠血衆样品中单抗药物Be vac i zumab的药时曲线。
【具体实施方式】
[0040]实施例1:大鼠血浆样品中单抗药物的分析 [0041 ]第一部分:大鼠静脉给药 [0042] A、大鼠静脉给药过程
[0043] (1)选取体重为200g±10g-只雄性大鼠，自由饮食；
[0044] (2)购买市售单克隆抗体药物1^￥3(^2111]^13注射液，浓度为2511^/1]11^
[0045] (3)按照临床给药剂量折算，采用静脉注射方式按50mg/kg给药量给予大鼠单克隆 抗体药物；
[0046] B、大鼠血浆样品的制备
[0047] 分别选择不同的时间点（0，30min，lh，2h，4h，8h，12h，24h，32h)，自静脉采集大鼠 全血，在13000g下离心分离血清5min，-80°C冰箱保存。
[0048]第二部分:大鼠血衆样品中单抗药物Be vac i zumab的含量测定 [0049] A、血浆样品预处理 [0050] (1)血浆样品的还原，
[00511于聚乙烯管中加入2yL大鼠的血浆样品，
[0052]加入96yL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀，
[0053] 加入2yL还原剂，涡流混匀，
[0054] 60 °C孵育1小时，得到反应液；
[0055] (2)半胱氨酸的封闭，
[0056]于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；
[0057] 25Γ 孵育 40min;
[0058] (3)血浆样品的胰酶消化，
[0059]经半胱氨酸封闭的反应液中加入700yL消化缓冲液，涡流混合，再加入3yL胰酶溶 液，祸流混合，37 °C孵育12~16h得到血浆样品酶解液，加入5yL甲酸终止反应（图3是本实施 例得到的血浆样品中特异性肽段的典型色谱图，与图1给出的单抗酶解后特异性肽段标准 品的典型色谱图相同）；
[0060] (4)内标的引入
[0061] 于酶解液中加入10yL稳定同位素标记的内标肽段，涡流混匀，得到血浆样品的反 应液（图4是本实施例得到的血浆样品中内标肽段的典型色谱图，与图2合成的稳定同位素 的内标肽段的典型色谱图相同）；
[0062] (5)血浆反应液的固相萃取，
[0063] 于固相萃取柱中加入lmL乙腈溶液，至液体自然流完，
[0064] 于固相萃取柱中加入lmL淋洗溶液，至液体自然流完，
[0065] 取血浆样品的反应液，至液体自然流完，
[0066]于固相萃取柱中加入lmL淋洗溶液，至液体自然流完，三遍洗，
[0067]于固相萃取柱中加入lmL洗脱溶液，至液体自然流完，得血浆样品洗脱液，置于聚 乙烯管中；
[0068] (6)血浆样品的浓缩、复溶，
[0069] 将上述步骤中得到的血浆样品洗脱液真空离心蒸干，加入100yL 0.1%甲酸，涡流 混匀，得到血浆样品的复溶液。
[0070] (7)血浆样品的质谱分析，
[0071] 取血浆样品复溶液2yL进行液相色谱-串联质谱分析，记录色谱图，将所选的特异 性肽段峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线(参见实施例2)，求得肽段浓度，此肽段浓度 即为对应血楽样品中Be vac i zumab浓度。
[0072] 上述步骤中涉及溶液配方如下：
[0073]含有变性剂的pH缓冲液，是含有8M尿素的50mM HEPES缓冲溶液；
[0074] 还原剂，是1M的二硫苏糖醇溶液；
[0075]半胱氨酸封闭剂，是固体碘乙酰胺试剂；
[0076] 消化缓冲液，是50mM的HEPES缓冲溶液；
[0077] 胰酶溶液，是lmg/mL的胰酶水溶液；
[0078]淋洗溶液，是按体积比水/三氟乙酸=100/0.1的溶液；
[0079]洗脱溶液，是按体积比乙腈/水/三氟乙酸= 80/20/0.1的溶液。
[0080] B、血浆样品中单抗药物含量测定
[0081] 分别取经由A步骤处理后不同时间点复溶液2yL进行LC/MS/MS分析，记录色谱图， 血浆样品酶解后特异性肽段典型色谱图如图3,血浆样品酶解后内标肽段典型色谱图如图 4，将特异性肽段峰面积与内标肽段峰面积的比值代入标准曲线，求得肽段浓度，即为血浆 样品中单抗药物浓度，得到的大鼠血衆样品中单抗药物Bevac i zumab的药时曲线如图5。 [0082] 上述步骤中涉及单克隆抗体Bevacizumab特异性肽段及内标肽段测定的条件如 下：
[0083] 1、色谱条件为:美国赛默飞世尔公司Ultimate 3000系列高效液相色谱系统;色谱 柱：自制peptide C18毛细管色谱柱，15cmX75ym I.D.，5μηι粒径;流动相：甲酸体积百分数 占 0.1 %的水和甲酸体积百分数占 0.1 %的乙腈，梯度洗脱;流速300nL/min;进样量2yL;
[0084]所述的梯度洗脱，其程序可参见表1。
[0085] 2、质谱条件为:Q-Exactive Orbitrap四级杆-轨道阱液相色谱-串联质谱仪，配有 纳升级电喷雾离子化源和Xcalibur 2.1数据处理软件;离子源:纳升级电喷雾离子化源;正 离子方式检测；扫描方式为平行反应监测;全扫分辨率为70000，目标扫描分辨率为35000， 最大注入时间为200ms。
[0086]表3肽段平行反应监测设定值
[0088] 本发明所述的一种单克隆抗体药物的质谱分析方法线性关系良好、准确度高、重 现性好而且灵敏、可靠，可用于上述单克隆抗体药物Bevacizumab的药代动力学分析测定。
[0089] 实施例2大鼠血浆标准曲线样品制备
[0090] 首先配置单抗标准系列溶液:利用去离子水将单抗标准溶液储备液(25yg/yL)分 别稀释至 5、10、40、100、500、1000、1200ngAiL。
[0091 ]再制备大鼠血浆标准曲线样品:分下列7步进行，
[0092] (1)大鼠血浆标准曲线样品的还原，
[0093]于聚乙烯管中分别加入2yL单抗标准系列溶液，
[0094]加入2yL大鼠的空白血浆，涡流混匀，
[0095]加入94yL含有变性剂的pH缓冲液，涡流混匀，
[0096] 加入2yL还原剂，涡流混匀，
[0097] 60°C孵育lh，得到反应液；
[0098] (2)半胱氨酸的封闭，
[0099]于反应液中加入0.75mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀；
[0100] 25Γ 避光孵育 40min;
[0101] (3)大鼠血浆标准曲线样品的胰酶消化，
[0102] 经半胱氨酸封闭的反应液中加入700yL消化缓冲液，涡流混合，再加入3yL胰酶溶 液，涡流混合，37°C孵育12~16h得到单抗大鼠血浆标准曲线样品的酶解液，后加入5yL甲酸