一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法
【专利摘要】本发明涉及生物医疗【技术领域】，提供了一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法，包括配制37.6μg/ml的丙戊酸钠标准溶液、多种浓度丙戊酸钠工作液、配制50.2μg/ml的环己烷羧酸内标溶液、空白标样、正常人血液标样、病人血液标样，放入色谱仪里绘制色谱图，根据色谱图判断病人血液里面是否含有丙戊酸钠；然后色谱仪根据正常人血液标样色谱图绘制丙戊酸钠标准曲线，再根据病人血液标样色谱图的丙戊酸钠峰值、环己烷羧酸内标溶液的峰值、丙戊酸钠标准曲线计算出病人血液中丙戊酸钠的含量。本发明有效解决了色谱图中杂峰多、灵敏度低、精确度低、成本高、不能绘制出丙戊酸钠标准曲线的问题。
【专利说明】一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医疗【技术领域】，特别涉及一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法。
【背景技术】
[0002]丙戊酸钠是临床常用的广谱抗癫痫、治疗情感性精神障碍的药物，尤其对单纯失神发作、全身性强直、陈挛发作、肌陈挛发作疗效显著，对单纯部分性发作、复杂部分性发作具有显著疗效，有效血药浓度范围为50-100 ii g/mlo但丙戊酸钠体内过程和疗效个体差异大，剂量与血药浓度的相关性不稳定，且血药浓度过高易引起恶心、呕吐及肝功能损害等不良反应，因而通过检测血药浓度来调整剂量，是确保疗效和用药安全的必要手段。
[0003]目前，测定体内丙戊酸钠血药浓度最常用的方法为荧光偏振免疫法，需要采用专用的试剂盒，价格昂贵，也不能分离和排除丙戊酸钠代谢产物和内源性杂质的干扰，造成测量精度低的问题。
[0004]因此，生物医疗【技术领域】急需一种杂峰少、灵敏度高、精确度高、成本低廉、能够绘制出丙戊酸钠标准曲线的高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术测定丙戊酸钠血药浓度价格贵、精度低的缺陷，本发明提供一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法，技术方案如下:
[0006]一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法，其特征在于，包含以下步骤:
[0007]第一步，配制37.6 u g/ml的的丙戊酸钠标准溶液；
[0008]首先，称取分析纯丙戊酸钠37.6mg，放入50mL容量瓶中，然后将0.2mol/l的分析纯氨水倒入装有丙戊酸钠的容量瓶中，稀释至50ml刻度为止，摇匀；
[0009]第二步，稀释丙戊酸钠标准溶液，制成丙戊酸钠工作液；
[0010]从第一步中的50ml丙戊酸钠标准溶液容量瓶中，分别取出200 装入8个容量瓶中，向这8个容量瓶中倒入0.2mol/l的分析纯氨水，将丙戊酸钠标准溶液分别稀释成浓度为 18.80,37.60,56.40,75.20,94.00,112.80,127.84、150.40 u g/ml 的丙戊酸钠工作液备用;
[0011]第三步，配制50.2 y g/ml的的环己烷羧酸内标溶液；
[0012]首先，称取分析纯环己烷羧酸37.6mg，放入50mL容量瓶中，然后将0.2mol/l的分析纯氨水倒入装有环己烷羧酸的容量瓶中，稀释至50ml刻度为止，摇匀；
[0013]第四步，配制5.016mg/ml衍生化试剂，并放置于冰箱中贮存；
[0014]首先，称取分析纯W-溴苯乙酮125.4mg，放入25mL容量瓶中，然后将色谱纯乙腈倒入装有W-溴苯乙酮的容量瓶中，稀释至25ml刻度为止，摇匀，放置于冰箱中贮存；
[0015]第五步，配制IOOOml流动相；[0016]首先将750ml分析纯甲醇倒入IOOOml的容量瓶中，然后向装有甲醇的容量瓶中倒入250ml去离子水，摇匀；
[0017]第六步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，作为空白标样；
[0018]第七步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 μ I环己烷羧酸内标溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样I ;
[0019]第八步，取200μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取200 μ I丙戊酸钠标准溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样2 ；
[0020]第九步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 μ I环己烷羧酸内标溶液和200 μ I丙戊酸钠标准溶液,依次倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样3 ；
[0021]第十步，分别取200 μ I正常人的血清加入8支IOml具塞抽提管中，然后这8支具塞抽提管中分别加入30 μ I环己烷羧酸内标溶液和200 μ I的18.80,37.60,56.40,75.20、94.00,112.80,127.84、150.40 μ g/ml 的丙戊酸钠工作液，作为标样 4、5、6、7、8、9、10、11 ；
[0022]第十一步，取200 μ I病人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 μ I环己烷羧酸内标溶液，倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样12 ；
[0023]第十二步，首先分别向空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中加入200 μ I的lmol/1硫酸，摇匀后再分别加入4ml色谱纯正己烷，都漩涡混匀5分钟，静置5分钟后，分别进行3000r/min的离心运动10分钟；
[0024]第十三步，分别从离心后的空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中移取
2ml上清液至13支洁净的IOml具塞抽提管中，分别向13支具塞抽提管中加入40 μ I衍生化试剂、20 μ I分析纯三乙胺，漩涡混匀后，放置于63°C水浴衍生10分钟，然后在氮气流下
蒸发至完全干燥；
[0025]第十四步，首先将取出的残留物分别用300μ I流动相漩涡混匀、溶解，然后将溶解物分别吸入13支尖底离心管中，进行4000r/min离心运动10分钟；
[0026]第十五步，分别从13支尖底离心管中取出15 μ 1，放入13支试管中，再将13支试管放入色谱仪中进行光谱测量，得出13张色谱图；
[0027]第十六步，根据空白标样、标样1、标样2、标样3的比较可以判断出环己烷羧酸内标溶液的峰，丙戊酸钠标准溶液的峰；进一步地，根据标样3的色谱图可以判断出标样12中是否含有丙戊酸钠产生的峰，随即判断出病人血液中是否含有丙戊酸钠；进一步地，色谱仪根据标样4、5、6、7、8、9、10、11的色谱图，绘制出丙戊酸钠标准曲线，色谱仪根据标样12的丙戊酸钠峰值、环己烷羧酸峰值与丙戊酸钠标准曲线，可以计算出病人血液内的丙戊酸钠含量。
[0028]进一步地，一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠的方法，其中，空白标样的色谱图为一条接近于平滑的直线。
[0029]进一步地，一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠的方法，其中，丙戊酸钠的出峰时间为10.67±0.55分。
[0030]进一步地，一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠的方法，其中，丙戊酸钠标准曲线的斜率为0.9994 ± 0.0005。
[0031]本发明的有益效果是:[0032]1.本发明能够绘制出丙戊酸钠标准曲线，与病人的丙戊酸钠色谱图相比较，可以计算出病人血液中丙戊酸钠的含量。
[0033]2.本发明使用的实验仪器少、操作简单、灵敏度高、精确度高。
[0034]3.本发明采用色谱仪生成的色谱图杂峰少，具有更好的辨识度。
[0035]4.本发明检测成本低廉，提高了经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]下面结合附图和【具体实施方式】来详细说明本发明:
[0037]图1是本发明的空白标样产生的色谱图。
[0038]图2是本发明的标样I产生的色谱图。
[0039]图3是本发明的标样2产生的色谱图。
[0040]图4是本发明的标样3产生的色谱图。
[0041]图5是本发明的标样12产生的色谱图。
[0042]图6是本发明根据标样4、5、6、7、8、9、10、11绘制出的丙戊酸钠标准曲线。
【具体实施方式】
[0043]为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
[0044]本发明的具体实施步骤如下:
[0045]第一步，配制37.6 μ g/ml的的丙戊酸钠标准溶液；
[0046]首先，称取分析纯丙戊酸钠37.6mg，放入50mL容量瓶中，然后将0.2mol/l的分析纯氨水倒入装有丙戊酸钠的容量瓶中，稀释至50ml刻度为止，摇匀；
[0047]第二步，稀释丙戊酸钠标准溶液，制成丙戊酸钠工作液；
[0048]从第一步中的50ml丙戊酸钠标准溶液容量瓶中，分别取出200 μ I装入8个容量瓶中，向这8个容量瓶中倒入0.2mol/l的分析纯氨水，将丙戊酸钠标准溶液分别稀释成浓度为 18.80,37.60,56.40,75.20,94.00,112.80,127.84、150.40 μ g/ml 的丙戊酸钠工作液备用;
[0049]第三步，配制50.2 μ g/ml的的环己烷羧酸内标溶液；
[0050]首先，称取分析纯环己烷羧酸37.6mg，放入50mL容量瓶中，然后将0.2mol/l的分析纯氨水倒入装有环己烷羧酸的容量瓶中，稀释至50ml刻度为止，摇匀；
[0051]第四步，配制5.016mg/ml衍生化试剂，并放置于冰箱中贮存；
[0052]首先，称取分析纯W-溴苯乙酮125.4mg，放入25mL容量瓶中，然后将色谱纯乙腈倒入装有W-溴苯乙酮的容量瓶中，稀释至25ml刻度为止，摇匀，放置于冰箱中贮存；
[0053]第五步,配制IOOOml流动相；
[0054]首先将750ml分析纯甲醇倒入IOOOml的容量瓶中，然后向装有甲醇的容量瓶中倒入250ml去离子水，摇匀；
[0055]第六步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，作为空白标样；
[0056]第七步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 μ I环己烷羧酸内标溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样I ;[0057]第八步，取200iU正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取200 丙戊酸钠标准溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样2 ；
[0058]第九步，取200 U I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 μl环己烷羧酸内标溶液和200 ii I丙戊酸钠标准溶液,依次倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样3 ；
[0059]第十步，分别取200 ill正常人的血清加入8支IOml具塞抽提管中，然后这8支具塞抽提管中分别加入30 u I环己烷羧酸内标溶液和200 u I的18.80,37.60,56.40,75.20、94.00,112.80,127.84、150.40 u g/ml 的丙戊酸钠工作液，作为标样 4、5、6、7、8、9、10、11 ；
[0060]第十一步，取200 ill病人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 ill环己烷羧酸内标溶液，倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样12 ；
[0061]第十二步，首先分别向空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中加入200 u I的lmol/1硫酸，摇匀后再分别加入4ml色谱纯正己烷，都漩涡混匀5分钟，静置5分钟后，分别进行3000r/min的离心运动10分钟；
[0062]第十三步，分别从离心后的空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中移取
2ml上清液至13支洁净的IOml具塞抽提管中，分别向13支具塞抽提管中加入40 U I衍生化试剂、20 Ul分析纯三乙胺，漩涡混匀后，放置于63°C水浴衍生10分钟，然后在氮气流下
蒸发至完全干燥；
[0063]第十四步，首先将取出的残留物分别用300iU流动相漩涡混匀、溶解，然后将溶解物分别吸入13支尖底离心管中，进行4000r/min离心运动10分钟；
[0064]第十五步，分别从13支尖底离心管中取出15 iil，放入13支试管中，再将13支试管放入色谱仪中进行光谱测量，得出13张色谱图；
[0065]第十六步，根据空白标样、标样1、标样2、标样3的比较可以判断出环己烷羧酸内标溶液的峰值，丙戊酸钠标准溶液的峰值；进一步地，根据标样3的色谱图可以判断出标样12中是否含有丙戊酸钠；图1是本发明的空白标样产生的色谱图，为一条空白的直线；图2是本发明的标样I产生的色谱图，101为环己烷羧酸内标溶液产生的峰；图3是本发明的标样2产生的色谱图，102为丙戊酸钠标准溶液产生的峰；图4是本发明的标样3产生的色谱图，既含有101环己烷羧酸内标溶液产生的峰，又含有102丙戊酸钠溶液产生的峰；进一步地，根据标样3的色谱图可以判断出标样12中是否含有丙戊酸钠产生的峰，随即判断出病人血液中是否含有丙戊酸钠；进一步地，色谱仪根据标样4、5、6、7、8、9、10、11的色谱图，绘制出图6，图6是本发明的丙戊酸钠标准曲线，图5是本发明的标样12产生的色谱图，色谱仪根据根据图5中标样12的丙戊酸钠峰值、环己烷羧酸峰值与图6中丙戊酸钠标准曲线，可以计算出病人血液内的丙戊酸钠含量。
[0066]图1中空白标样的色谱图为一条接近于平滑的直线。
[0067]丙戍酸钠的出峰时间为10.67 ±0.55分。
[0068]丙戊酸钠标准曲线的斜率为0.9994 ±0.0005。
[0069]下面举例几组具体实施例，说明病人血液内的丙戊酸钠含量的测试:
[0070]实施例一:在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出环己烷羧酸内标溶液在保留时间为5.749时的峰以及病人血液内的丙戊酸钠在保留时间为10.639时的峰，根据图6中丙戊酸钠的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的丙戊酸钠含量为39.23637ng/ul。
[0071]实施例二:在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出环己烷羧酸内标溶液在保留时间为5.743时的峰以及病人血液内的丙戊酸钠在保留时间为10.671时的峰，根据图6中丙戊酸钠的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的丙戊酸钠含量为64.77381ng/ul。
[0072]实施例三:在以吸光度为纵坐标，时间为横坐标的色谱图上得出环己烷羧酸内标溶液在保留时间为5.752时的峰以及病人血液内的丙戊酸钠在保留时间为10.658时的峰，根据图6中丙戊酸钠的标准曲线，仪器自动计算出病人血液内的丙戊酸钠含量为118.66935ng/ul。
[0073]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
【权利要求】
1.本发明的一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法，其特征在于，包含以下步骤: 第一步，配制37.6 μ g/ml的的丙戊酸钠标准溶液； 首先，称取分析纯丙戊酸钠37.6mg，放入50mL容量瓶中，然后将0.2mol/l的分析纯氨水倒入装有丙戊酸钠的容量瓶中，稀释至50ml刻度为止，摇匀； 第二步，稀释丙戊酸钠标准溶液，制成丙戊酸钠工作液； 从第一步中的50ml丙戊酸钠标准溶液容量瓶中，分别取出200 μ I装入8个容量瓶中，向这8个容量瓶中倒入0.2mol/l的分析纯氨水，将丙戊酸钠标准溶液分别稀释成浓度为 18.80,37.60,56.40,75.20,94.00,112.80,127.84、150.40 μ g/ml 的丙戊酸钠工作液备用； 第三步，配制50.2 μ g/ml的的环己烷羧酸内标溶液； 首先，称取分析纯环己烷羧酸37.6mg，放入50mL容量瓶中，然后将0.2mol/l的分析纯氨水倒入装有环己烷羧酸的容量瓶中，稀释至50ml刻度为止，摇匀； 第四步，配制5.016mg/ml衍生化试剂，并放置于冰箱中贮存； 首先，称取分析纯W-溴苯乙酮125.4mg，放入25mL容量瓶中，然后将色谱纯乙腈倒入装有W-溴苯乙酮的容量瓶中，稀释至25ml刻度为止，摇匀，放置于冰箱中贮存； 第五步，配制IOOOml流动相； 首先将750ml分析纯甲醇倒入IOOOml的容量瓶中，然后向装有甲醇的容量瓶中倒入.250ml去离子水，摇匀； 第六步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，作为空白标样； 第七步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 μ I环己烷羧酸内标溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样I ; 第八步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取200 μ I丙戊酸钠标准溶液，倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样2 ； 第九步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 μ I环己烷羧酸内标溶液和200 μ I丙戊酸钠标准溶液,依次倒入装有正常人血清的具塞抽提管中，作为标样3 ；第十步，分别取200 μ I正常人的血清加入8支IOml具塞抽提管中，然后这8支具塞抽提管中分别加入30 μ I环己烷羧酸内标溶液和200 μ I的18.80,37.60,56.40,75.20、.94.00,112.80,127.84,150.40 μ g/ml 的丙戊酸钠工作液，作为标样 4、5、6、7、8、9、10、11 ；第十一步，取200 μ I病人的血清加入IOml具塞抽提管中，然后量取30 μ I环己烷羧酸内标溶液，倒入装有病人血清的具塞抽提管中，作为标样12 ； 第十二步，首先分别向空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中加入200μ I的lmol/1硫酸，摇匀后再分别加入4ml色谱纯正己烷，都漩涡混匀5分钟，静置5分钟后，分别进行3000r/min的离心运动10分钟； 第十三步，分别从离心后的空白标样、标样1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中移取2ml上清液至13支洁净的IOml具塞抽提管中，分别向13支具塞抽提管中加入40 μ I衍生化试齐!Κ20μ I分析纯三乙胺，漩涡混匀后，放置于63°C水浴衍生10分钟，然后在氮气流下蒸发至完全干燥；第十四步，首先将取出的残留物分别用300μ I流动相漩涡混匀、溶解，然后将溶解物分别吸入13支尖底离心管中，进行4000r/min离心运动10分钟； 第十五步，分别从13支尖底离心管中取出15 μ 1，放入13支试管中，再将13支试管放入色谱仪中进行光谱测量，得出13张色谱图； 第十六步，根据空白标样、标样1、标样2、标样3的比较可以判断出环己烷羧酸内标溶液的峰值，丙戊酸钠标准溶液的峰值；进一步地，根据标样3的色谱图可以判断出标样12中是否含有丙戊酸钠产生的峰，随即判断出病人血液中是否含有丙戊酸钠；进一步地，色谱仪根据标样4、5、6、7、8、9、10、11的色谱图，绘制出丙戊酸钠标准曲线，色谱仪根据标样12的丙戊酸钠峰值、环己烷羧酸峰值与丙戊酸钠标准曲线，可以计算出病人血液内的丙戊酸钠含量。
2.如权利要求1所述的一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠的方法，其特征在于，该空白标样的色谱图为一条接近于平滑的直线。
3.如权利要求1所述的一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠的方法，其特征在于，丙戊酸钠的出峰时间为?ο.67±0. 55分。
4.如权利要求1所述的一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠的方法，其特征在于，丙戊酸钠标准曲线的斜率为0.9994±0.0005。
【文档编号】G01N30/88GK103454369SQ201310407728
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】冯娟, 甄燕 申请人:上海兰卫临床检验有限公司