专利名称：用于诊断与治疗目的的微小rna(mirna)和下游靶标的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断、预防和/或治疗纤维变性和其它疾病的微小 RNA(miRNA)、特别是miR_21及其下游靶标的领域。本发明还涉及用于治疗纤维变性 的组合物、方法和用途。这类方法包括调节和抑制患有纤维变性的受治疗者的miRNA活 性。
发明背景
微小RNA是一大类小的非编码RNA，它控制多种生物过程，包括由调节互补的 靶mRNA的表达而导致主要的信号转导途径(Ambros，2004)。在各种疾病实体中微小 RNA的失调是由基因组改变(Mi等，2007)、差异性表达或者在某些情况下将微小RNA 功能改变成为肿瘤抑制物或癌基因的病毒感染所引起的。最近在一系列精细的遗传学研 究中，微小RNA涉及不同心脏功能的调节(Care等，2007; Yang等，2007)。虽然这些 研究有助于勾画出微小RNA在心脏生理学、生长和形态发生中的作用，但是对微小RNA 在体内疾病途径中的详尽分子机制的了解不多。研究表明，单链寡核苷酸微小RNA拮 抗剂在体外和体内使内源微小RNA沉默，因而对靶mRNA和蛋白质水平及代谢产生作用 (Kruetzfeldt等，2005 ； :Esau等，2006)。这些研究结果表明微小RNA拮抗剂的应用在体 内证实了微小RNA的功能，或许更重要的是成为新的治疗方式。
发明_既述
本发明涉及微小RNA的启动子区(promoter region)、微小RNA、特别是miR-21的用途、以及用于诊断及用于制备治疗和/或预防纤维变性和/或纤维变性相关疾病的 药物的相关成分。另外，本发明涉及针对miR-21的靶标的各种反义寡核苷酸。还包括 miR-21、启动子区和miR-21的靶标缺陷型细胞及其敲除生物。最后，本发明涉及用于 诊断纤维变性和/或纤维变性相关疾病的方法以及筛选用于治疗纤维变性和/或纤维变性 相关疾病的有药物活性的化合物的方法。
本文提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变 性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成 并且具有与miRNA互补的核苷碱基(nucleobase)序列。
本文提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者；给予受治疗者 包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡 核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补。
本文提供的方法包括给予有发生纤维变性风险的受治疗者包含修饰寡核苷酸的 化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miRNA或其前体互补的 核苷碱基序列，从而预防纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是肝纤维变性。在 某些实施方案中，纤维变性是肺纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是皮肤纤维变 性。在某些实施方案中，纤维变性是年龄相关性纤维变性。在某些实施方案中，纤维变 性是心脏纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是肾纤维变性。在某些实施方案中， 纤维变性是脾纤维变性。11
本文提供的方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷 酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miRNA或其前体互 补的核苷碱基序列，其中受治疗者患有至少一种心脏疾病或病症。
本发明提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中受治疗 者患有至少一种心脏疾病或病症；并且给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述 修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或 其前体互补。
在某些实施方案中，心脏疾病或病症选自心脏肥大、高血压性心力衰竭、舒张 性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心脏相关性贮积病、心肌病、缩窄性心包炎、冠状动脉 疾病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、右心衰竭、心律失常、心肌炎相关性纤维变性和 心脏瓣膜疾病。
在某些实施方案中，心肌病选自扩张型心肌病、梗阻性肥厚型心肌病、无梗阻 肥厚型心肌病、限制性心肌病、致心律失常性右室心肌病和糖尿病性心肌病。
在某些实施方案中，心脏瓣膜疾病选自二尖瓣狭窄、主动脉瓣狭窄、三尖瓣狭 窄和肺动脉瓣狭窄。
在某些实施方案中，心脏瓣膜疾病选自二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣闭锁不全、 三尖瓣闭锁不全和肺动脉瓣闭锁不全。
在某些实施方案中，本文提供的方法还包括给予一种或多种另外的药物。
在某些实施方案中，给药改善心脏重量增加、左心室扩张或缩短分数的减低 (impairment of fractional shortening) ο
在某些实施方案中，给药防止心脏重量增加、左心室扩张或缩短分数的减低。
在某些实施方案中，给药改善心脏功能。
在某些实施方案中，给药包括静脉内给药、皮下给药、动脉内给药或心脏内给 药。
本文提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变 性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成 并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，其中受治疗者患有至少一种肝脏疾病 或病症。
本文提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中受治疗者 患有至少一种肝脏疾病或病症；并且给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修 饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其 前体互补。在某些实施方案中，至少一种肝脏疾病或病症是慢性肝损伤。在某些实施方 案中，至少一种肝脏疾病或病症是肝炎病毒感染。在某些实施方案中，肝炎感染是丙型 肝炎感染。在某些实施方案中，至少一种肝脏疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎。在某 些实施方案中，给药包括静脉内给药或皮下给药。在某些实施方案中，至少一种肝脏疾 病或病症是肝硬化。在某些实施方案中，给药改善肝功能。
本文提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变 性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成 并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，其中受治疗者患有至少一种肺部疾病或病症。
本文提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中受治疗者 患有至少一种肺部疾病或病症；并且给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修 饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其 前体互补。在某些实施方案中，至少另一种肺部疾病或病症是慢性阻塞性肺部疾病。在 某些实施方案中，给药包括经肺给药。
本文提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变 性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成 并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，其中受治疗者患有至少另一种疾病或 病症。
本发明提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中受治疗 者患有至少另一种疾病或病症；并且给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修 饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其 前体互补。在某些实施方案中，至少另一种疾病或病症是肺动脉高压。在某些实施方 案中，至少另一种疾病或病症是血管相关性疾病。在某些实施方案中，血管相关性疾病 选自动脉僵硬(arterial stiffoess)、mediasclerosis和动脉硬化。在某些实施方案中，至少 另一种疾病或病症是肠硬化。在某些实施方案中，至少另一种疾病或病症是全身性硬皮 病。在某些实施方案中，至少另一种疾病或病症选自腹膜后纤维变性、增生性纤维变性 (proliferative fibrosis) >增殖性纤维变性(neoplastic fibrosis)、肾源性系统性纤维变性、充 血性纤维变性(injection fibrosis)、纵隔纤维变性、骨髓纤维变性、输精管切除术后疼痛 综合征、类风湿性关节炎。
在某些实施方案中，给药改善纤维变性。在某些实施方案中，给药减缓纤维变 性进一步发展。在某些实施方案中，给药终止纤维变性进一步进展。在某些实施方案 中，给药减轻纤维变性。在某些实施方案中，给药减少胶原含量。
本文提供用于治疗纤维增生性疾病的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有 纤维增生性疾病的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个 连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补，从而治疗纤 维增生性疾病。
在某些实施方案中，给药包括静脉内给药、皮下给药、经肺给药、动脉内给药 或心脏内给药。
本文提供用于抑制成纤维细胞增殖的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含 由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基 序列与miRNA或其前体互补，从而抑制成纤维细胞增殖。
本文提供用于刺激成纤维细胞凋亡的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含 由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基 序列与miR-21或其前体互补，从而刺激成纤维细胞凋亡。
本文提供增加成纤维细胞中的Spmuty 1蛋白的方法，所述方法包括使成纤维细 胞与包含由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中修饰寡核苷酸的 核苷碱基序列与miRNA或其前体互补，从而刺激Sprcmty 1蛋白表达。
本文提供用于抑制微小RNA的组合物。在某些实施方案中，miRNA是 miR-21。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与同miR-21或其前体有至少80%同 一性的核苷碱基序列互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miR-21具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miR-21前体具有如SEQ ID NO: 11 所示的核苷碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成。在某些实施方案 中，修饰寡核苷酸由12个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由13个连 接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由14个连接核苷组成。在某些实施方 案中，修饰寡核苷酸由15-M个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由15 个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由16个连接核苷组成。在某些实 施方案中，修饰寡核苷酸由17个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由 18个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由19个连接核苷组成。在某些 实施方案中，修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由 21个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由22个连接核苷组成。在某些 实施方案中，修饰寡核苷酸由23个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由 24个连接核苷组成。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱 基序列的错配不多于2个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21 或其前体的核苷碱基序列的错配不多于1个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷 碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱基序列无错配。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ IDNO : 12的核苷 碱基序列的至少15个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列 包含SEQ ID NO: 12的核苷碱基序列的至少16个连续核苷碱基。在某些实施方案中， 修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少17个连续核苷 碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQID NO: 12的核苷碱 基序列的至少18个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包 含SEQ ID NO: 12的核苷碱基序列的至少19个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修 饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少20个连续核苷碱 基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO: 12的核苷碱基 序列的至少21个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少22个连续核苷碱基。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列由SEQ ID NO: 12的核苷碱 基序列组成。
在某些实施方案中，化合物包含与配体缀合的修饰寡核苷酸。在某些实施方案 中具有以下结构(III)
(5，)QxQz1 (Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L (3，)
(III)
其中
每个Q独立地为2’ -O-甲基修饰核苷；
权利要求
1.一种用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受 治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具 有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列。
2.—种方法，所述方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者；和给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接 核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
3.一种预防纤维变性的方法，所述方法包括给予有发生纤维变性风险的受治疗者 包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与 miR-21或其前体互补的核苷碱基序列。
4.权利要求1、2或3的方法，其中所述纤维变性是肝纤维变性、心脏纤维变性、肾 纤维变性、肺纤维变性、皮肤纤维变性、年龄相关性纤维变性或脾纤维变性。
5.一种方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核 苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miR-21或其前体 互补的核苷碱基序列，其中所述受治疗者患有至少一种心脏疾病或病症。
6.—种方法，所述方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中所述受治疗者患有至少一种心脏疾 病或病症；和给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接 核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
7.权利要求5或6的方法，其中所述心脏疾病或病症选自心脏肥大、高血压性心力衰 竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心脏相关性贮积病、心肌病、缩窄性心包炎、 冠状动脉疾病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、右心衰竭、心律失常、心肌炎相关性纤 维变性和心脏瓣膜疾病。
8.权利要求7的方法，其中所述心肌病选自扩张型心肌病、梗阻性肥厚型心肌病、无 梗阻肥厚型心肌病、限制性心肌病、致心律失常性右室心肌病和糖尿病性心肌病。
9.权利要求7的方法，其中所述心脏瓣膜疾病选自二尖瓣狭窄、主动脉瓣狭窄、三尖 瓣狭窄和肺动脉瓣狭窄。
10.权利要求7的方法，其中所述心脏瓣膜疾病选自二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣闭锁 不全、三尖瓣闭锁不全和肺动脉瓣闭锁不全。
11.权利要求5-10中任一项的方法，所述方法包括给予一种或多种另外的药物。
12.权利要求11的方法，其中一种或多种另外的药物选自利尿药、inotropes、地 高辛、血管扩张药、血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻滞药 (ARB)、钙通道阻滞药、硝酸异山梨酯、胼屈嗪、硝酸盐、胼屈嗪、β-阻滞药和利尿纳 肽。
13.权利要求5-11中任一项的方法，其中所述给药包括静脉内给药、皮下给药、动脉 内给药或心脏内给药。
14.权利要求5-13中任一项的方法，其中所述给药改善心脏重量增加、左心室扩张或 缩短分数的减低。
15.权利要求5-14中任一项的方法，其中所述给药防止心脏重量增加、左心室扩张或 缩短分数的减低。
16.权利要求5-15中任一项的方法，其中所述给药改善心脏功能。
17.一种用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受 治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具 有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列，其中所述受治疗者患有至少一种肝脏疾病或 病症。
18.—种方法，所述方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中所述受治疗者患有至少一种肝脏疾 病或病症；和给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接 核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
19.权利要求17或18的方法，其中至少一种肝脏疾病或病症是慢性肝损伤。
20.权利要求17或18的方法，其中至少一种肝脏疾病或病症是肝炎病毒感染。
21.权利要求20的方法，其中所述肝炎感染是丙型肝炎感染。
22.权利要求17或18的方法，其中至少一种肝脏疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎。
23.权利要求17或18的方法，其中至少一种肝脏疾病或病症是肝硬化。
24.权利要求17-23中任一项的方法，其中所述给药包括静脉内给药或皮下给药。
25.权利要求17-24中任一项的方法，其中所述给药改善肝功能。
26.一种用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受 治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具 有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列，其中所述受治疗者患有至少一种肺部疾病或 病症。
27.—种方法，所述方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中所述受治疗者患有至少一种肺部疾 病或病症；和给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接 核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
28.权利要求26或27的方法，其中至少另一种肺部疾病或病症是慢性阻塞性肺部疾病。
29.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述给药包括经肺给药。
30.一种用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受 治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具 有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列，其中所述受治疗者患有至少另一种疾病或病症。
31.—种方法，所述方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中所述受治疗者患有至少其它的疾病 或病症；和给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接 核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
32.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症是肺动脉高压。
33.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症是血管相关性疾病。
34.权利要求33的方法，其中所述血管相关性疾病选自动脉僵硬、mediasclerosis和动 脉硬化。
35.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症是肠硬化。
36.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症是全身性硬皮病。
37.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症选自腹膜后纤维变性、增 生性纤维变性、增殖性纤维变性、肾源性系统性纤维变性、充血性纤维变性、纵隔纤维 变性、骨髓纤维变性、输精管切除术后疼痛综合征、类风湿性关节炎。
38.权利要求33-37中任一项的方法，其中所述给药包括静脉内给药、皮下给药、动 脉内给药、心脏内给药或经肺给药。
39.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药改善纤维变性。
40.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药减缓纤维变性进一步发展。
41.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药终止纤维变性进一步发展。
42.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药减轻纤维变性。
43.一种用于治疗纤维增生性疾病的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维增 生性疾病的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核 苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补，从而治疗纤维 增生性疾病。
44.一种用于抑制成纤维细胞增殖的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含由 12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基 序列与miR-21或其前体互补，从而抑制成纤维细胞增殖。
45.—种用于刺激成纤维细胞凋亡的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含由 12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基 序列与miR-21或其前体互补，从而刺激成纤维细胞凋亡。
46.一种用于在成纤维细胞中增加Spmutyl蛋白的方法，所述方法包括使成纤维细胞 与包含由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中所述修饰寡核苷酸 的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补，从而刺激Spmutyl蛋白表达。
47.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成。
48.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由12、13或14个连接核 苷组成。
49.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由15-24个连接核苷组成。
50.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由15、16、17、18、19、 20、21、22、23或24个连接核苷组成。
51.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱基序列的错配不多于2个。
52.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21 或其前体的核苷碱基序列的错配不多于1个。
53.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21 或其前体的核苷碱基序列无错配。
54.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19 个、至少20个、至少21个或至少22个连续核苷碱基。
55.上述权利要求中任一项的方法，其中所述化合物包含与配体缀合的修饰寡核苷酸。
56.上述权利要求中任一项的方法，其中所述配体是胆固醇。
57.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷间键合是修饰核苷间键合。
58.上述权利要求中任一项的方法，其中每个核苷间键合都是修饰核苷间键合。
59.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷间键合为硫代磷酸酯核苷间键合。
60.上述权利要求中任一项的方法，其中每个核苷间键合都是硫代磷酸酯核苷间键合。
61.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰糖。
62.上述权利要求中任一项的方法，其中众多核苷的每一个都包含修饰糖。
63.上述权利要求中任一项的方法，其中每个核苷都包含修饰糖。
64.上述权利要求中任一项的方法，其中每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。
65.上述权利要求中任一项的方法，其中众多核苷的每一个都包含2’-O-甲氧基乙 基糖，且众多核苷的每一个都包含2’ -氟糖。
66.权利要求61-63中任一项的方法，其中每个修饰糖独立选自2’-O-甲氧基乙基 糖、2’ -氟糖、2’ -O-甲基糖或二环糖部分。
67.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰核苷碱基。
68.权利要求67的方法，其中所述修饰核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。
69.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷包含胞嘧啶，其中所述胞嘧啶 是5-甲基胞嘧啶。
70.权利要求69的方法，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
71.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQID NO 1的核苷碱基序列有至少90%互补性或至少95%互补性。
72.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQID NO 1的核苷碱基序列有100%互补性。
73.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQID NO 1的核苷碱基序列具有全长互补性。
74.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQID NO 11的核苷碱基序列有至少90%互补性或至少95%互补性。
75.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQIDNO 11的核苷碱基序列有100%互补性。
76.上述权利要求中任一项的方法，其中所述miR-21核苷碱基序列由SEQID NO 1 的核苷碱基序列组成。
77.上述权利要求中任一项的方法，其中所述前体核苷碱基序列由SEQID NO: 11的 核苷碱基序列组成。
78.上述权利要求中任一项的方法，其中把包含修饰寡核苷酸的化合物制成药物组合物。
79.上述权利要求中任一项的方法，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。
80.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸是单链修饰寡核苷酸。
81.上述权利要求中任一项的方法，其中所述给药减少胶原含量。
82.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸是反义寡核苷酸。
83.与miR-21互补的反义寡核苷酸在制备用于治疗和/或预防纤维变性的药物中的用途。
84.一种用于治疗和/或预防纤维变性的与miR-21互补的反义寡核苷酸。
85.与miR-21互补的反义寡核苷酸在制备用于诊断纤维变性的药物中的用途。
86.一种用于诊断纤维变性的与miR-21互补的反义寡核苷酸。
87.一种用于诊断纤维变性的方法，所述方法包括以下步骤a.提供假定患有纤维变性的患者的样品；b.测定miR-21的表达；其中与对照样品相比miR-21水平升高，说明了纤维变性或其诱因。
88.一种用于筛选有药物活性的用于治疗和/或预防纤维变性或其诱因的化合物的方 法，所述方法包括以下步骤a.提供含有miR-21的样品；b.使候选物质与样品接触；c.测定候选物质对样品的作用；其中miR-21的改变表明有药物活性的化合物。
89.—种用于诊断、预防和/或治疗纤维变性的微小RNA(miRNA)的启动子区，所述 启动子区包含钙/cAMP反应元件蛋白(CREB)和/或血清应答因子(SRF)结合位点的修 饰，其中miRNA是miR-21，且纤维变性定义为作为修复或反应性过程的器官或组织中过 量纤维性结缔组织的形成或发展。
90.权利要求89的启动子区，其中miRNA是SEQIDNO 1。
91.权利要求89或90的启动子区，其中所述修饰选自点突变、截短、缺失和倒置。
92.前述权利要求中任一项的启动子区，其中所述启动子区选自SEQIDNO:2 SEQ ID NO 4。
93.一种miR-21缺陷型细胞，其中所述细胞包含权利要求89的启动子区。
94.一种化合物，所述化合物包含与配体缀合的修饰寡核苷酸，其中所述化合物具有 以下结构(III)(5，WxQz1 (Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L (3，) (III)其中每个Q独立地为2’ -修饰核苷；
95.权利要求94的化合物，其中Rd为胆固醇。
96.权利要求94或95的化合物，其中ζ1、ζ2、ζ3和ζ4中的每一个为 A
97.权利要求94的化合物，其中R1为-CH2ORb。
98.权利要求97的化合物，其中R9为0H。
99.权利要求98的化合物，其中R1和R9为反式。
100.权利要求94的化合物，其中R9为OH。
101.权利要求100的化合物，其中R1和R3为反式。
102.权利要求94的化合物，其中R3为-CH2ORb。
103.权利要求102的化合物，其中R1为OH。
104.权利要求103的化合物，其中R1和R3为反式。
105.权利要求102的化合物，其中R9为OH。
106.权利要求102的化合物，其中R3和R9为反式。
107.权利要求94的化合物，其中R9为CH2ORb。
108.权利要求107的化合物，其中R1为OH。
109.权利要求108的化合物，其中R1和R9为反式。
110.权利要求94的化合物，其中X为NC(O)R7。
111.权利要求110的化合物，其中R7为-CH2(CH2) 3CH2NHC (O) Rd。
112.上述权利要求中任一项的化合物，其中每个2’-修饰核苷独立选自2’ -O-甲 氧基乙基核苷、2’ -氟核苷、2’ -O-甲基核苷或二环核苷。
113.上述权利要求中任一项的化合物，其中每个2’-修饰核苷都是2’ -O-甲氧基 乙基核苷。
114.上述权利要求中任一项的化合物，其中每个2’-修饰核苷都是2’ -O-甲基核苷。
115.上述权利要求中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含修饰核苷碱基。
116.权利要求115的化合物，其中所述修饰核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。
117.上述权利要求中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含胞嘧啶，其中所述胞 嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
118.权利要求117的化合物，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
119.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与 SEQ ID NO 11的核苷碱基序列有至少95%互补性。
120.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与 SEQ ID NO 11的核苷碱基序列有100%互补性。
121.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 15-23。
122.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 16。
123.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 17。
124.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 18。
125.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 19。
126.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 20。
127.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 21。
128.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 22。
129.上述权利要求中任一项的化合物，其中η= 23。
130.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少15个连续核苷碱基。
131.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少16个连续核苷碱基。
132.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少17个连续核苷碱基。
133.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少18个连续核苷碱基。
134.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少19个连续核苷碱基。
135.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少20个连续核苷碱基。
136.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少21个连续核苷碱基。
137.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列的至少22个连续核苷碱基。
138.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列由 SEQ ID NO 12的核苷碱基序列组成。
139.—种包含以下结构(III)的化合物(
全文摘要
本发明涉及微小RNA的启动子区、微小RNA、特别是miR-21的用途、以及用于诊断的相关成分和用于制备治疗和/或预防纤维变性和/或纤维变性相关疾病的药物的相关成分。另外，本发明涉及针对miR-21的靶标的反义寡核苷酸。还包括miR-21缺陷型细胞、启动子区和miR-21的靶标及其敲除生物。最后，本发明涉及用于诊断纤维变性和/或纤维变性相关疾病的方法以及用于筛选用于治疗纤维变性和/或纤维变性相关疾病的有药物活性的化合物的方法。本发明还涉及用于治疗、改善和/或预防纤维变性的组合物。在某些实施方案中，所述组合物调节用于治疗、改善和/或预防纤维变性的miRNA的活性。在某些实施方案中，组合物抑制用于治疗、改善和/或预防纤维变性的miR-21的活性。
文档编号C12N15/113GK102027113SQ200980115916
公开日2011年4月20日 申请日期2009年2月26日 优先权日2008年2月27日
发明者C·格罗斯, J·鲍尔萨赫斯, S·恩格尔哈德特, T·图姆 申请人:朱利叶斯·马克西米利安-维尔茨堡大学