用于治疗糖尿病的包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于预防或治疗糖尿病的组合物，包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物，以及用于治疗糖尿病的治疗方法，并且更具体地，长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的同时施用抑制由胰岛素治疗引起的体重增加，和由促胰岛素肽治疗引起的呕吐和恶心，并且减小胰岛素的所需剂量，从而显著地改善药物顺应性。此外，通过将胰岛素或促胰岛素肽与免疫球蛋白Fc区经由非肽基连接体连接制备本发明的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物中的每一个，由此显示改善的体内功效持续时间和稳定性。
【专利说明】用于治疗糖尿病的包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素
肽缀合物的组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于预防或治疗糖尿病的包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物，以及用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括施用所述组合物的步骤。
【背景技术】
[0002]胰岛素是由胰腺的P细胞分泌的肽，并且在控制机体中的血糖水平方面发挥重要作用。代谢性疾病，糖尿病与由胰岛素的分泌或功能异常引起的血糖水平升高有夫。I型糖尿病由因胰腺不能产生胰岛素所引起的血糖水平升高导致，以及2型糖尿病由因胰岛素的分泌或功能异常引起的血糖水平升高导致。患有2型糖尿病的患者通常采用具有化学物质作为主要成分的ロ服降血糖药剂治疗，并且在一些情况下，给予胰岛素，而患有I型糖尿病的患者需要膜岛素治疗。
[0003]最常见的胰岛素疗法包括在餐前和/或餐后注射胰岛素。目前，可注射胰岛素是可获得的，并且一般来说，以皮下注射液给予。施用方法取决于其作用时程而变化。胰岛素注射显示出比ロ服施用更快速的降血糖效应，并且当不可能进行ロ服施用时其可以被安全地使用。此外，对于胰岛素使用没有剂量限制。然而，长期一天三次使用胰岛素可以导致ー些不利之处，诸如对针的厌恶、操纵注射设备的难度、低血糖症和体重増加。由于长期使用胰岛素引起的体重増加可能増加心血管疾病的风险和胰岛素抗性。同时，做出了许多努力通过保持胰岛素肽药物被机体吸收后的长期高水平以使功效最大化。例如，已经开发出了长效胰岛素制剂诸如兰德仕(Lantus)(甘精胰岛素(Insulin glargine) ；SanofiAventis)和诺和平(Levemir)(地特膜岛素(Insulin detemir) ；Novo Nordisk),并且它们是可购买得到的。不像胰岛素NPH(中效低精蛋白胰岛素)，这些长效药物減少睡眠期间的低血糖症的风险，并且特别地诺和平与稍微较少的体重増加有关。然而，这些药物制剂也是不利的，因为它们必需一天一次或两次给予。
[0004]同吋，ー种促胰岛素肽，胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)，是由回肠和结肠的L-细胞分泌的肠降血糖素。胰高血糖素样肽-1的作用是以葡萄糖依赖的方式增加胰岛素释放从而防止低血糖症发作。由于这种性质，其作为用于2型糖尿病的潜在治疗而受到关注。然而，使用GLP-1作为治疗药剂的主要障碍是其在血浆中小于2分钟的极其短的半衰期。目前，exendin-4作为胰高血糖素样肽_1受体激动剂是可购买得到的，并且其是从吉拉毒蜥的唾液腺纯化的胰高血糖素样肽-1类似物。exendin-4对DPP IV(二肽基肽酶-4)有抗性，并且比胰高血糖素样肽-1具有更高的生理活性。因此,其体内半衰期为2-4小时，比胰高血糖素样肽-1的半衰期长(US5，424，286)。然而，采用仅增加对DPP IV的抗性的方法，生理活性不能被充分地维持，并且例如，在可购买得到的exendin-4 (艾塞那肽(exenatide))的情况下，其需要一天两次注射给患者，并且艾塞那肽治疗的患者仍然经历不良事件诸如恶心和呕吐。
[0005]为了解决上述问题，本发明人提出了长效肽缀合物，其通过将生理活性多肽和免疫球蛋白Fe区经由作为连接体的非肽基聚合物通过共价键连接来制备，从而維持所述蛋白药物的活性并且同时改善其稳定性(韩国专利号10-0725315)。具体来说，他们发现长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物中的每ー种均发挥出显著增加的体内功效(韩国专利申请号 10-2008-0001479 和 10-2010-0054068)。
[0006]然而，当以保持稳定血糖水平的量注射胰岛素或exendin-4时仍然存在体重增カロ、或恶心和呕吐的问题。因此，存在着开发在使用较低剂量的药物和较不频繁的使用药物的条件下对糖尿病表现出优异疗效的治疗方法的迫切需求。
【发明内容】
[0007]技术问题
[0008]本发明人已经做出了许多努力来开发用于糖尿病的治疗药剂，其具有长效治疗功效并且同时降低了不良事件诸如恶心和呕吐。他们尝试进行长效exendin-4缀合物和长效胰岛素缀合物的同时施用，其同时刺激胰高血糖素样肽-1受体和胰岛素受体。结果，他们发现长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的同时施用改善了体内功效持续时间和稳定性，并且显著地减小了药物的剂量，产生了稳定的血糖水平。另外，他们发现其改善了由胰高血糖·素样肽-1激动剂和exendin-4或其衍生物诱发的不良事件诸如呕吐和恶心，并且使用长效exendin-4缀合物減少了由使用胰岛素所导致的体重増加，从而完成了本发明。
[0009]解决问题的技术方案
[0010]本发明的目的是提供ー种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物。
[0011]本发明的另一目的是提供一种预防或治疗糖尿病的方法，该方法包括向患有糖尿病或处于患糖尿病的风险中的受试者施用所述组合物的步骤。
[0012]本发明的另一目的是提供ー种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽。
[0013]本发明的另一目的是提供ー种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括胰岛素和长效促胰岛素肽缀合物。
[0014]本发明的有利效果
[0015]本发明的长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物对糖尿病显示出优异的疗效,并且特别地,其同时施用同时刺激胰岛素受体和胰高血糖素样肽-1受体以改善其体内功效持续时间和稳定性，并且显著地减少药物的所需剂量和稳定地将血糖控制在稳定水平，导致改善低血糖症和体重増加。另外，其抑制恶心和呕吐并且作为用于糖尿病的治疗药剂具有改善的药物顺应性。特别地，其具有显著改善的稳定性和体内功效持续时间，允许减少治疗频率，有利于患者便利。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是示出在向STZ(链脲霉素)诱发的糖尿病小鼠同时施用长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物后7天时期的血糖水平变化的图；
[0017]图2是示出向db/db小鼠同时施用长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物后空腹血糖变化(A FBG)的图(按照 Dunnet's MC 检验 *P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001)；和
[0018]图3是示出向db/db小鼠同时施用长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物后体重变化(A Bff)的图(按照 Dunnet's MC 检验 *P〈0.05，**P〈0.01，_P〈0.001)。
【具体实施方式】
[0019]在ー个方面，本发明提供了用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物。本发明的组合物特征在于长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的同时施用。
[0020]如在本文中使用，术语“长效胰岛素缀合物”是指经由非肽基连接体与免疫球蛋白Fe区连接的胰岛素。
[0021]本发明的长效胰岛素缀合物与天然胰岛素相比具有改善的体内功效持续时间，并且该长效胰岛素缀合物可以包括通过天然胰岛素的氨基酸序列的修饰、置換、添加或缺失而制备的胰岛素、与生物可降解聚合物诸如聚乙二醇(PEG)缀合的胰岛素、与长效蛋白诸如白蛋白或免疫球蛋白缀合的胰岛素、与具有结合体内白蛋白的能力的脂肪酸缀合的胰岛素、或包封在生物可降解的纳米粒子中的胰岛素，但是长效胰岛素缀合物的类型不限于此。
[0022]如在本文中使用，术语“胰岛素”是指响应于血液中升高的葡萄糖水平由胰腺分泌的肽，其摄取肝、肌肉或脂肪组织中的葡萄糖并且将其转变成糖原，并且停止利用脂肪作为能量来源，并且因此控制血糖水平。该肽包括天然胰岛素、基础胰岛素、胰岛素激动剂、其前体、衍生物、片段及其变体。`
[0023]术语“天然胰岛素”是由胰腺分泌以促进葡萄糖吸收并抑制脂肪分解并且因此起控制血糖水平的作用的激素。胰岛素由没有调节血糖水平的功能的前体——已知为胰岛素原——通过加工而形成。胰岛素的氨基酸序列如下:
[0024]a 链:
[0025]Gly-1le-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-1le-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID N0.1)
[0026]^ 链:
[0027]Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CyS-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID N0.2)
[0028]术语“基础胰岛素”是指管理正常每天血糖波动的肽，例如诺和平、甘精胰岛素、德谷胰岛素(Deglude)等。
[0029]术语“胰岛素激动剂”是指结合至胰岛素受体以显示与胰岛素相等的生物活性的化合物，其与胰岛素的结构无关。
[0030]术语“胰岛素变体”是具有ー个或多个与天然胰岛素不同的氨基酸序列的肽，并且是指保留了控制体内血糖水平的功能的肽，且其可以通过在天然胰岛素的部分氨基酸序列中置換、添加、缺失和修饰中的任一种或通过其组合进行制备。
[0031]术语“胰岛素衍生物”是指与天然胰岛素具有至少80%氨基酸序列同源性的肽，其氨基酸残基上的一些基团可以被化学取代(例如，a -甲基化、a-羟基化)、缺失(例如，脱氨基)或修饰(例如，N-甲基化)，并且该衍生物具有调节体内血糖水平的功能。[0032]术语“胰岛素片段”是指在天然胰岛素的N-末端或C-末端处添加或缺失ー个或多个氨基酸的片段，其中可以添加非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)，并且该片段具有调节体内血糖水平的功能。
[0033]用于胰岛素的激动剂、衍生物、片段和变体的每ー种制备方法可以单独或组合使用。例如，本发明包括具有ー个或多个与天然肽不同的氨基酸和N-末端氨基酸残基的脱氨基并且具有调节体内血糖水平的功能的肽。
[0034]在具体实施方案中，本发明中使用的胰岛素可以通过重组技术制备，并且也可以使用固相合成法合成。[0035]此外，本发明中使用的胰岛素的特征在于将非肽基聚合物连接至胰岛素的P链的氨基末端。此非肽基聚合物可以用作本发明中的连接体。该非肽基聚合物作为连接体连接，从而保持胰岛素的活性并改善胰岛素的稳定性。
[0036]如在本文中使用，术语“非肽基聚合物”是指包括彼此通过除肽键以外的任何共价键连接的两个或多个重复单元的生物相容性聚合物。在本发明中，非肽基聚合物可以与非肽基连接体互換使用。
[0037]在本发明中有用的非肽基聚合物可以选自:生物可降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合，并且优选地生物可降解聚合物可以是聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基こ醚、聚乳酸(PLA)或聚乳酸こ醇酸(PLGA)，且更优选地是聚乙二醇(PEG)。另外，本领域中已知的其衍生物和通过本领域中的已知方法容易制备的衍生物可以包括在本发明的范围内。
[0038]在通过常规框内融合法获得的融合蛋白中使用的肽连接体的缺点在于其在体内容易被蛋白水解酶裂解，并且因此不能如期望的那样获得通过载体増加活性药物的血清半衰期的充分效应。然而，在本发明中，对蛋白水解酶具有抗性的聚合物可以用来将肽的血清半衰期保持与载体的半衰期相似。因此，可以使用任何非肽基聚合物而没有限制，只要其是具有上述功能的聚合物即可，即，对体内蛋白水解酶具有抗性的聚合物。该非肽基聚合物的分子量在1-1OOkDa的范围内，并且优选为l_20kDa。本发明的与免疫球蛋白Fe区连接的非肽基聚合物可以是ー种聚合物或不同类型的聚合物的組合。
[0039]在本发明中使用的非肽基聚合物具有能够结合至免疫球蛋白Fe区和蛋白药物的反应基团。该非肽基聚合物在两个末端均具有反应基团，所述反应基团优选地选自:反应性醛、丙醛、丁醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基丙酸酷、羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基羧甲基或琥珀酰亚胺基碳酸酷。具体地，当非肽基聚合物在其两个末端均具有反应性醛基时，其在两个末端有效地连接生理活性多肽和免疫球蛋白，具有最小的非特异性反应。通过醛键的还原性烷基化生成的最终产物比通过酰胺键连接的产物稳定得多。醛反应基团在低PH下选择性地结合至N-末端，并且在高pH诸如9.0下结合至赖氨酸残基以形成共价键。非肽基聚合物的两个末端处的反应基团可以相同或不同。例如，非肽基聚合物可以在一端具有马来酰亚胺基团，而在另一端具有醛基、丙醛基或丁醛基。当使用在其两个末端具有反应性羟基的聚乙二醇作为非肽基聚合物时，羟基可以通过已知的化学反应被活化成各种反应基团，或可以使用具有可购买得到的修饰的反应基团的聚乙二醇以制备本发明的长效胰岛素缀合物。优选地，非肽基聚合物可以连接于胰岛素的P链的N-末端处。[0040]本发明的胰岛素可以用非肽基聚合物修饰。
[0041]实际上，用于防止低血糖症和改善功效的持续时间的PEG(聚乙二醇)修饰使得生理活性肽的效价非常低。然而，在使用免疫球蛋白片段开发长效胰岛素缀合物中这个缺点变成了优点。因此，PEG修饰的胰岛素可以经由非肽基聚合物连接至免疫球蛋白Fe区。在胰岛素修饰中使用的非肽基聚合物可以选自:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基こ醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合，并且优选地是聚乙二醇。在PEG修饰的胰岛素中的PEG修饰的特征在于PEG选择性地结合至胰岛素的a链的N-末端或结合至胰岛素的P链的特定赖氨酸残基。PEG修饰胰岛素优选地包括在其末端的反应性醛基和琥珀酰基基团，并且更优选地包括反应性琥珀酰基基团。
[0042]本发明的长效胰岛素缀合物的制备方法和功效详细地描述在韩国专利申请号2010-0054068、2010-0054067和2011-0030868中。在本发明的一个实施例中，在免疫球蛋白Fe区的N-末端处进行单聚乙二醇化，并用其修饰胰岛素的P链位置I处的苯丙氨酸以制备长效胰岛素缀合物(实施例1)。
[0043]如在本文中使用，术语“长效促胰岛素肽缀合物”是指经由非肽基连接体与免疫球蛋白Fe区连接的促胰岛素肽。
[0044]在本发明中，“促胰岛素肽”是指保留了释放胰岛素的功能并且刺激胰腺P细胞中胰岛素的合成或表达的肽。 优选地，促胰岛素肽是GLP (胰高血糖素样肽)-Uexendin-3或exendin-4，但不限于此。促胰岛素肽包括天然促胰岛素肽、其前体、其激动剂、其衍生物、其片段及其变体。
[0045]本发明的促胰岛素肽衍生物可以包括脱氨基组氨酰基衍生物——其中促胰岛素肽的N-末端氨基被去除、(6-羟基咪唑并丙酰基衍生物——其中氨基被羟基取代、二甲基组氨酰基衍生物——其中氨基被两个甲基修饰、P-羧基咪唑并丙酰基衍生物——其中N-末端氨基被羧基取代、或咪唑并こ酰基衍生物——其中N-末端组氨酸残基的a碳被去除以仅保留咪唑并こ酰基并且因此移除了氨基的正电荷，并且其他N-末端氨基修饰的衍生物包括在本发明的范围内。
[0046]在本发明中，促胰岛素肽衍生物更优选是具有化学修饰的N-末端氨基(或胺)基团或氨基酸残基的exendin-4衍生物,甚至更优选地通过移除或取代exendin-4的N-末端Hisl残基的a碳中存在的a氨基或者通过移除或取代a碳制备的exendin_4衍生物。还更优选地，移除N-末端氨基的脱氨基组氨酰基-exendin-4 (DA-Exendin-4)、通过用羟基取代氨基制备的0 -羟基咪唑并丙基-exendin-4 (HY-exendin-4)、通过用羧基取代氨基制备的P -羧基咪唑并丙基-exendin-4 (CX-exendin-4)、通过用两个甲基残基修饰氨基制备的二甲基-组氨酰基-61611(1;[11-4(011-61611(1;[11-4)、或移除1^-末端组氨酸残基的a碳的咪唑并こ酸基-exendin-4 (CA-exendin-4)。
[0047]GLP-1是由小肠分泌的激素，并且通常促进胰岛素的生物合成和分泌、抑制胰高血糖素分泌并且促进细胞摄取葡萄糖。在小肠中，胰高血糖素前体分解成三种肽，即，胰高血糖素、GLP-1和GLP-2。在此，GLP-1是指GLP-1 (1_37)，其最初为没有促胰岛素功能的形式，但其然后被加工并转变成活化的GLP-1 (7-37)形式的GLP-1。GLP-1 (7_37)氨基酸的序列如下:[0048]GLP-1 (7-37)
[0049]HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAff LVKGR G (SEQ ID N0.3)
[0050]术语“GLP-1衍生物”是指表现出与GLP-1具有至少80%氨基酸序列同源性的肽，可以是化学修饰的形式，并且表现出与GLP-1至少相等或更多的促胰岛素功能。 [0051]术语“GLP-1片段”是指其中在天然GLP-1的N-末端或C-末端处添加或缺失ー个或多个氨基酸的形式，其中添加的氨基酸可能是非天然氨基酸(例如，D-型氨基酸)。
[0052]术语“GLP-1变体”是指具有促胰岛素功能的肽，其具有ー个或多个与天然GLP-1不同的氨基酸序列。
[0053]Exendin-3和exendin-4是由39个氨基酸组成的促胰岛素肽,其与GLP-1具有53%氨基酸序列同源性。Exendin-3和exendin-4的氨基酸序列如下:
[0054]Exendin-3
[0055]HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEff LKNGG PSSGA PPPS (SEQ ID N0.4)
[0056]Exendin-4
[0057]HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEff LKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID N0.5)
[0058]术语“exendin激动剂”是指在体内与受体反应并且具有与exendin相等的生物活性的化合物。
[0059]术语“exendin衍生物”是指与天然exendin具有至少80%氨基酸序列同源性的肽，其氨基酸残基上的一些基团被化学取代(例如，a -甲基化、a -羟基化)、去除(例如，脱氨基)或修饰(例如，N-甲基化)，并且具有促胰岛素功能。
[0060]术语“exendin片段”是指在天然exendin的N-末端或C-末端处添加或缺失ー个或多个氨基酸的片段，其中可以添加非天然氨基酸(例如，D-型氨基酸)，并且具有促胰岛素功能。
[0061]术语“exendin变体”是指具有至少ー个与天然exendin不同的氨基酸序列的肽，其具有促胰岛素功能，并且exendin变体包括用丝氨酸或精氨酸在exendin-4的位置12处置换赖氨酸制备的肽。
[0062]用于exendin激动剂、衍生物、片段和变体的每ー种制备方法可以单独或组合使用。例如，本发明包括促胰岛素肽，其具有氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少ー个与天然促胰岛素肽的氨基酸不同的氨基酸，以及具有在N-末端处被脱氨基的氨基酸残基。
[0063]在具体实施方案中，在本发明中使用的天然促胰岛素肽和修饰的促胰岛素肽可以使用固相合成方法合成，并且包括天然促胰岛素肽的大多数天然肽可以通过重组技术生产。
[0064]在本发明中使用的长效促胰岛素肽缀合物是指经由非肽基连接体与免疫球蛋白片段诸如免疫球蛋白Fe连接的促胰岛素肽。非肽基连接体与上述的相同。长效促胰岛素肽缀合物是如在长效胰岛素缀合物中使用免疫球蛋白片段的缀合物，并且保持了促胰岛素肽的常规体内活性，诸如促进胰岛素的合成和分泌、食欲控制、体重减轻、P细胞对血液中葡萄糖的敏感性増加、促进3细胞増殖、延缓胃排空和胰高血糖素抑制，并且进一步显著地増加促胰岛素肽的血液半衰期，并且随之增加肽的体内功效持续效应。因此，其在糖尿病和肥胖症的治疗中是有用的。
[0065]长效促胰岛素肽缀合物的类型和制备方法详细地描述在韩国专利申请号2008-001479,2008-0069234 和 2010-0047019 中。
[0066]在本发明的一个实施例中，咪唑并こ酰基exendin_4(CA exendin-4)的赖氨酸(Lys)用PEG修饰,并且PEG修饰的exendin-4与免疫球蛋白Fe连接以制备长效exendin-4缀合物(实施例2)。
[0067]在本发明中使用的胰岛素和促胰岛素肽使用非肽基聚合物作为连接体与载体物质连接。在本发明中有用的载体物质可以选自免疫球蛋白Fe区、白蛋白、转铁蛋白和PEG，并且优选免疫球蛋白Fe区。
[0068]本发明的长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽缀合物中的每ー个通过将胰岛素或促胰岛素肽经由非肽基连接体与免疫球蛋白Fe区连接进行制备，由此显示持续性和稳定性。在本发明中，免疫球蛋白Fe可以与免疫球蛋白片段互換使用。
[0069]此外，Fe片段就具有Fe 片段的络合物的制备、纯化和产率而言是有益的，因为其相对于整个免疫球蛋白分子具有小的分子量。此外，由于因抗体间氨基酸序列的差异而表现出高度不均一性的Fab区被移除，Fe片段具有大大增加的物质均一性和低的诱导血清抗原性的可能性。
[0070]如在本文中使用，术语“免疫球蛋白Fe区”是指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)——不包括重链和轻链的可变区、免疫球蛋白的重链恒定区
I(CHl)和轻链恒定区I(CLl)的蛋白。其还可以包括重链恒定区处的铰链区。此外，本发明的免疫球蛋白Fe区可以含有部分或全部的Fe区，包括重链恒定区I (CHl)和/或轻链恒定区I (CLl)，不包括重链和轻链的可变区，只要其具有与天然蛋白基本相似或更好的生理功能即可。此外，免疫球蛋白Fe区可以是CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对长的部分缺失的片段。即，本发明的免疫球蛋白Fe区可以包括1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2) CHl结构域和CH2结构域，3) CHl结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5) —个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的一部分)的组合，和6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。
[0071]本发明的免疫球蛋白Fe区包括天然氨基酸序列，及其序列衍生物(突变体)。氨基酸序列衍生物是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守置换或其组合引起的与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fe中，在位置214至238、297至299、318至322或327至331处，已知在结合中重要的氨基酸残基可以用作修饰的合适靶标。
[0072]此外，其他多种衍生物是可能的，包括其中能够形成二硫键的区域缺失，或在天然Fe形式的N末端处去除特定的氨基酸残基或向其添加甲硫氨酸残基的衍生物。此外，为了去除效应器功能，缺失可以发生在补体结合位点，诸如Clq-结合位点和ADCC (抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)位点。制备免疫球蛋白Fe区的此类序列衍生物的技术公开在W097/34631 和 W096/32478 中。
[0073]蛋白和肽中的氨基酸交换在本领域中是已知的，其通常不改变蛋白或肽的活性(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979)。最常发生的交换是双方向的 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。另外，如果需要，Fe区可以通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、こ酰化、酰胺化等被修饰。[0074]上述的Fe衍生物是具有与本发明的Fe区相同的生物活性或改善的结构稳定性，例如针对热、pH等的衍生物。
[0075]另外，这些Fe区可以从分离自人和其他动物的天然形式获得，所述动物包括奶牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠，或可以是获得自转化的动物细胞或微生物的其重组体或衍生物。在此，它们可以通过从人或动物有机体分离整个免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理它们而从天然免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化为Fab和Fe区，并且胃蛋白酶处理导致产生pF’ c和F(ab)2片段。这些片段可以进行例如尺寸排阻色谱以分离Fe或pF’ C。优选地，人源Fe区是从微生物获得的重组体免疫球蛋白Fe区。
[0076]另外，本发明的免疫球蛋白Fe区可以以具有天然糖链的形式，与天然形式相比具有増加的糖链的形式或与天然形式相比具有減少的糖链的形式，或可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fe糖链的增加、減少或去除可以通过本领域中公知的方法来实现，诸如化学方法、酶学方法和使用微生物的基因工程方法。从Fe区去除糖链导致与第一补体成分Cl的Clq部分的结合亲和カ急剧下降，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用或补体依赖的细胞毒作用的减少或丧失，从而不会在体内诱导不必要的免疫应答。就此而言，去糖基化或无糖基化形式的免疫球蛋白Fe区可以更适合于本发明的作为药物载体的目的。 [0077]如在本文中使用，术语“去糖基化”是指从Fe区通过酶法去除糖部分，并且术语“无糖基化”是指通过原核生物，优选大肠杆菌以无糖基化的形式生产Fe区。
[0078]同时，免疫球蛋白Fe区可以来源于人或其他动物，包括奶牛、山羊、猪、小鼠、免、仓鼠、大鼠和豚鼠，并且优选来源于人。
[0079]另外，免疫球蛋白Fe区可以是来源于IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fe区，或通过其组合或其杂合体制造的Fe区。优选地，其来源于IgG或IgM，两者是人血液中最丰富的蛋白，并且最优选来源于IgG，已知其增强配体结合蛋白的半衰期。
[0080]另ー方面，如在本文中使用，术语“组合”是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fe区的多肽与不同来源的单链多肽连接以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以由两个或多个选自IgG Fe、IgA Fe、IgM Fe、IgD Fe和IgE Fe片段的片段形成。
[0081]如在本文中使用，术语“杂合体”是指编码不同来源的两个或多个免疫球蛋白Fe区的序列存在于单链免疫球蛋白Fe区中。在本发明中，多种类型的杂合体是可能的。即，杂合结构域可以由 1-4 个选自 IgG Fe、IgM Fe、IgA Fe、IgE Fe 和 IgD Fe 的 CH1、CH2、CH3和CH4的结构域构成，并且可以包括铰链区。
[0082]另ー方面，IgG分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明包括其组合和杂合体。优选IgG2和IgG4亚类，并且最优选IgG4的Fe区，其很少具有效应器功能诸如CDC(补体依赖的细胞毒作用)。
[0083]即，作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fe区是人IgG4源的非糖基化Fe区。人源的Fe区比非人源的Fe区更优选，非人源的Fe区可能充当人身体中的抗原并且导致不期望的免疫应答，诸如产生针对该抗原的新抗体。
[0084]本发明的组合物特征在于长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的同时施用。
[0085]当进行本发明的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的同时施用时，长效胰岛素缀合物充当胰岛素受体并且同时长效促胰岛素肽缀合物充当胰高血糖素样肽-1受体，使得与其単一施用相比，血糖水平降低并保持稳定的血糖水平。缀合物的同时施用的作用是减少可以被胰岛素的単一施用诱发的低血糖症和体重増加的风险，并且由于促胰岛素肽的作用还减少总胰岛素的剂量。同时施用的优点还在于促胰岛素肽诸如exendin-4的剂量也可以减小从而防止不利的影响诸如由exendin-4的单ー施用引起的恶心和呕吐。长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的使用显著地増加了血液半衰期和体内功效持续时间，使得減少治疗频率以改善遭受每天注射的慢性患者的生活质量。因此，其对于糖尿病的治疗是非常有用的。此外，本发明的药物组合物显示了优异的体内功效持续时间和效价，并且在同时施用时可以大大地减少剂量。
[0086]长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物可以同时、序贯或逆序施用，并且可以以有效剂量的适宜组合同时施用。优选地，长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物可以单独地保存在单个容器中，并且然后同时、序贯或逆序施用。
[0087]此外，用于本发明的同时施用的组合物可以以用于糖尿病的治疗试剂盒的形式，其包括处于单一容器中的或分开地处于单个容器中的长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物。所述试剂盒可以包括药学上可接受的载体和说明书手册。
[0088]在本发明的ー个具体实施例中，在向STZ (链脲霉素)诱发的糖尿病小鼠同时施用长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物后检查血糖水平变化。結果，与単一施用相比，缀合物的同时施用显示稳定模式的血糖水平(图1)。比较在2型糖尿病的小鼠模型中一周一次同时施用长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物前后的空腹血糖水平。结果，与単一施用相比，同时施用显示优异的血糖水平改善(图2)。另外，没有观察到由胰岛素治疗引起的体重増加，这表明同时施用減少了由于胰岛素引起的体重増加的副作用(图3)。
[0089]如在本文中使用，术语“糖尿病”是指由胰岛素的分泌或功能异常导致的代谢性疾病。执行本发明的组合物对受试者的同时施用以控制血糖水平，从而治疗糖尿病。
[0090]如在本文中使用，术语“预防”是指通过同时施用本发明的组合物限制或阻止糖尿病的发生的所有行为，并且术语“治疗”是指通过同时施用本发明的组合物将糖尿病的症状变好或有利地改变的所有行为。治疗糖尿病可以应用于可能患有糖尿病的任何哺乳动物，并且其实例包括人和灵长类以及家畜诸如牛、猪、绵羊、马、狗、和猫，而没有限制，并且优选是人。
[0091]如在本文中使用，术语“施用”是指将预定量的物质通过特定的合适方法引入患者。组合物可以经由任一常用途径施用，只要其能够到达期望的组织。考虑多种施用模式，包括腹膜内、静脉内、肌肉、皮下、皮内、ロ服、局部、鼻内、肺内和直肠内，但本发明不限于这些列举的施用模式。然而，由于在ロ服施用时肽被消化，用于ロ服施用的组合物的活性成分应当被包衣或配制以保护免于在胃中的降解。优选地，多聚体可以以可注射的形式施用。另外，药物组合物可以使用能够将活性成分输送至靶细胞中的特定设备施用。
[0092]此外，本发明的药物组合物可以由数个相关因素确定，包括待治疗疾病的类型、施用途径、患者的年龄、性別、体重和疾病严重性，以及用作活性成分的药物的类型。
[0093]此外，本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的载体。如在本文中使用，术语“药学上可接受的载体”是指对有机体不导致显著的刺激并且不会消除施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。对于ロ服施用，药学上可接受的载体可以包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和风味剂。对于可注射制剂，药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、防腐剤、止痛剂、增溶剤、等渗剂和稳定剂。对于局部施用的制剂，药学上可接受的载体可以包括基质(base)、赋形剂、润滑剂和防腐剤。本发明的药物组合物可以与上述的药学上可接受的载体组合配制成多种剂型。例如，对于ロ服施用，药物组合物可以被配制成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆或薄片(wafer)。对于可注射制剂，药物组合物可以被配制成单位剂型，诸如多剂量容器或作为单剂量剂型的安瓿。药物组合物也可以被配制成为溶液、混悬剂、片剂、丸剤、胶囊和长效制剂。
[0094]另ー方面，适合于药物制剂的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酷、滑石、硬脂酸镁和矿物油。另外，药物制剂可以进ー步包括填料、抗凝剂、润滑剂、保湿剂、风味剂和杀菌剂。
[0095]在另ー个方面，本发明提供了预防或治疗糖尿病的方法，包括向患有糖尿病或处于患糖尿病的风险中的受试者施用包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物的步骤。
[0096]所述施用步骤可以通过同时施用所述长效胰岛素缀合物和所述长效促胰岛素肽缀合物进行，但不限于同时、序贯或逆序地施用，并且以有效剂量的适宜组合同时施用长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物。
[0097]即使一周施用一次，本发明的包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物两者的组合物显示出优异的血糖水平的改善并且不导致体重増加的副作用，并且因此可以用于糖尿病的预防或治疗。
[0098]在另ー个方面，本发明提供了用于预防或治疗糖尿病的包括长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽的药物组合物。
[0099]长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽与上述相同。长效胰岛素缀合物可以与促胰岛素肽诸如GLP-1激动剂(例如，艾塞那肽、利拉鲁肽(Liraglutide)或利西拉肽(Lixisenatide))同时施用。
[0100]在另ー个方面，本发明提供了用于预防或治疗糖尿病的包括胰岛素和长效促胰岛素肽缀合物的药物组合物。
[0101]胰岛素和长效促胰岛素肽缀合物与上述相同。长效促胰岛素肽缀合物可以与胰岛素诸如天然胰岛素、胰岛素衍生物或基础胰岛素同时施用。
[0102]实施本发明的方式
[0103]下文中，将參照下面的实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于例证性目的，并且本发明不意欲限于此。
[0104]实施例1:长效胰岛素缀合物的制备
[0105]用5K PropionALD (3) PEG (具有三个丙醛基的PEG，N0F，日本)聚乙二醇化免疫球蛋白Fe区的N-末端，免疫球蛋白Fe区和PEG以1:2的摩尔比在4°C反应4.5h，免疫球蛋白Fe浓度为10mg/mL。此时，反应在IOOmM磷酸钾(pH6.0)中进行，并向其添加还原剂20mMSCB (NaCNBH3) o使用SOURCE 15Q (GE Healthcare)纯化柱将单聚乙二醇化的免疫球蛋白Fe从反应混合物中纯化。
[0106]为了制备在胰岛素的P链的位置I处的苯丙氨酸(BlF)具有90%或更多修饰的胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fe缀合物，单聚乙二醇化的免疫球蛋白Fe和胰岛素以4:1的摩尔比制备，并且总蛋白浓度为20mg/mL，并且在4°C与彼此反应20h。IOOmM磷酸钾(pH6.0)用作反应溶液，并且向其添加作为还原剂的20mM SCB0在终止反应后，使用Sourcel5Q纯化柱进行反应混合物的初步纯化。然后，使用SourCe15ISO纯化柱进行第二次纯化以获得胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fe缀合物。
[0107]实施例2:长效exendin-4缀合物的制备
[0108]使用咪唑并こ酸基exendin-4 (CA exendin-4, AP, USA)使3? 4k PropionALD (2)PEG与CA exendin-4的赖氨酸(Lys)反应。在两个Lys异构体峰之间,最后一个异构体峰(Lys27的位置异构体)——其具有更多反应并且容易与N-末端异构体峰区分——用于偶联反应。
[0109]以肽:免疫球蛋白Fe为1:8的摩尔比在4°C下进行反应20h，并且蛋白的总浓度为60mg/mL。在IOOmM K-P (pH6.0)的溶液中进行反应，并且加入20mM SCB作为还原剂。偶联反应溶液通过两个纯化柱进行纯化。首先，SOURCE Q (XK16mL, Amersham Biosciences)用于去除大量的没有參与偶联反应的免疫球蛋白Fe。使用具有盐梯度的20mM Tris (pH7.5)和IM NaCl，具有相对弱的结合力的免疫球蛋白Fe被较早洗脱，并且然后洗脱exendin-4-免疫球蛋白Fe。通过该首次纯化程序，在一定程度上去除了免疫球蛋白Fe，但由于免疫球蛋白Fe和exendin-4-免疫球蛋白Fe在离子交換柱中具有与彼此相似的结合力，它们不能被完全地彼此分开。因此，利用两种物质中的每ー种的疏水性进行第二次纯化。使用在SOURCEISO (HR 16mL, Amersham Biosciences)中的 20mM Tris (pH7.5)和 1.5M 硫酸铵，偶联第一次纯化的样品，并且通过逐渐降低硫酸铵的浓度洗脱该样品。在HIC柱中，具有弱结合力的免疫球蛋白Fe被较早洗脱，并且然后具有强结合力的exendin-4-免疫球蛋白Fe样品被洗脱。由于它们具有显著不同的疏水性，因此它们可以比在离子交換柱中更容易地彼此分开。
[0110]柱:SOURCEQ(XK16mL, Amersham Biosciences)
[0111]流速:2.0mL/min
[0112]梯度:A0->25%70minB(A:20mM Tris pH7.5, B:A+1M NaCl)
[0113]柱:SOURCEISO(HR16mL, Amersham Biosciences)
[0114]流速:7.0mL/min
[0115]梯度:B100— 0%60min B(A:20mM Tris pH7.5, B:A+1.5M硫酸铵)
[0116]实施例3:在STZ(链脲霉素)诱发的糖尿病中同时施用长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的功效测试
[0117]为了进行对包括在实施例1和2中制备的长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的组合物的施用或长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的同时施用的体内功效测试，使用STZ (链脲霉素)诱发的糖尿病小鼠检查血糖水平变化。
[0118]在禁食16h的7周龄C57BL/6小鼠中连续5天通过腹膜内注射在IOmM柠檬酸缓冲液(pH4.5)中的STZ(50mg/kg，lmg/mL)诱发糖尿病。2天后，使用26G注射器从尾静脉取1-2滴血，并且使用血糖仪(OneTouch Ultra, LifeScan, Inc., USA)测量血糖。通过测量的血糖(350-600mg/dL)确定糖尿病诱发。
[0119]将诱发糖尿病的小鼠分成5组，每组5只小鼠:G1, G2，G3，G4和G5。
[0120]将所述组分为未治疗对照组(载体)、长效exendin-4缀合物治疗的组(5mcg/kg)、长效胰岛素缀合物治疗的组(100mcg/kg)、长效exendin-4缀合物(5mcg/kg)和长效胰岛素缀合物(50mcg/kg)治疗的组、以及长效exendin-4缀合物(5mcg/kg)和长效胰岛素缀合物(lOOmcg/kg)治疗的组。在上述测试材料治疗后，每天在每组中測量血糖水平变化。
[0121]结果，与单ー施用长效exendin-4缀合物或长效胰岛素缀合物相比，长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的同时治疗显示稳定的血糖水平和持续的降血糖效应(图1)，并且显示显著较低的血糖水平。
[0122]这些结果指示同时施用本发明的长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物显示稳定和持续的降血糖效应，并且因此显著地減少施用剂量，导致exendin-4的副作用诸如呕吐和恶心的减少并防止由胰岛素治疗引起的体重增加。
[0123]实施例4:同时施用长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物引起的空腹血糖(A FBG)和体重(A Bff)的变化
[0124]为了进行对包括在实施例1和2中制备的长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的组合物的施用或长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的同时施用的体内功效测试，使用2型糖尿病db/db小鼠检查血糖水平的改善和体重増加的抑制。
[0125]将2型糖尿病db/db小鼠分成长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的单一施用组和同时施用组。单ー施用组分别用430nmol/kg长效胰岛素缀合物和2.3nmol/kg长效exendin-4缀合物通过皮下注射一周一次进行治疗。同时施用组用108nmol/kg和216nmol/kg的长效胰岛素缀合物和2.3nmol/kg的长效exendin-4缀合物通过皮下注射一周一次进行治疗。测试进行28天，并且在初次药物治疗前和实验的最后一天将动物禁食8h，并且然后测定药物治疗前和实验的最后一天的空腹血糖(AFBG)和体重(ABW)的变化并且作为最終的测试项目计算。
[0126]A FBG和A Bff的测量结果显不一周一次同时施用长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物显示出与长效胰岛素缀合物的単一施用相比，在四分之一的胰岛素剂量(108nmol/kg)下改善血糖水平(图2)和抑制体重増加(图3)的优异效应。这些结果显示同时施用长效胰岛素缀合物和长效CA exendin-4缀合物的优势是降低低血糖症的风险并通过减少胰岛素的剂量抑制体重増加，表明即使一周进行一次同时施用，与胰岛素和GLP-1激动剂的每天注射相比，其显示出优异的降血糖效应，并且还显示比単一施用更好的优异的血糖控制，并且其減少对胰岛素的需求，从而降低了胰岛素引起的低血糖症和体重増加的风险。
[0127]这些结果支持，即使一周施用一次，本发明的包括长效胰岛素缀合物和长效exendin-4缀合物的组合物显示优异的血糖控制并且不诱发由胰岛素治疗引起的体重增加，同时其显著地減少由已知的胰岛素肽和exendin-4的単一施用所导致的副作用。
【权利要求】
1.ー种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括长效胰岛素缀合物和长效促胰岛素肽缀合物，其中通过将胰岛素或促胰岛素肽与免疫球蛋白Fe区经由非肽基连接体连接制备所述长效胰岛素缀合物和所述长效促胰岛素肽缀合物中的每ー个，所述非肽基连接体选自:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基こ醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胰岛素是天然胰岛素，基础胰岛素，通过天然胰岛素的氨基酸序列的置換、添加、缺失、修饰或其组合中的任一种而制备的胰岛素变体，胰岛素衍生物或其片段。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述胰岛素用非肽基聚合物修饰。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述非肽基聚合物选自:聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇丙二醇共聚物、聚氧乙烯多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯基こ醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述促胰岛素肽选自:GLP-l、eXendin-3、exendin-4、其激动剂、其衍生物、其片段、其变体及其组合。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述促胰岛素肽通过用选自脱氨基组氨酰基、二甲基组氨酰基、(6-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并こ酰基和(6-羧基咪唑并丙酰基的物质置换促胰岛素肽的N-末端组氨酸残基而制备。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述促胰岛素肽选自天然exendin-4、通过缺失N-末端胺基制备的exendin-4衍生物、通过用羟基置换N-末端胺基制备的exendin-4衍生物、通过用二甲基修饰N -末端胺基制备的exendin-4衍生物、通过缺失exendin-4的第一个氨基酸(组氨酸)的a -碳制备的exendin-4衍生物、通过用丝氨酸置换exendin-4的第12个氨基酸(赖氨酸)制备的exendin-4变体以及通过用精氨酸置換exendin-4的第12个氨基酸(赖氨酸)制备的exendin-4变体。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是无糖基化的。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fe区由选自CHl、CH2、CH3和CH4结构域的1-4个结构域构成。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fe区还包含铰链区。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是来源于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fe区。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fe区的每个结构域是选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的不同来源的杂合结构域。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫球蛋白Fe区是由相同来源的单链免疫球蛋白构成的二聚体或多聚体。
14.根据权利要求1所述的组合物，还包括药学上可接受的载体。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述长效胰岛素缀合物和所述长效促胰岛素肽缀合物被同时、序贯或逆序施用。
16.ー种用于预防或治疗糖尿病的方法，其包括向患有糖尿病或处于患糖尿病的风险中的受试者施用权利要求1-14中任一项所述的组合物的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述施用步骤通过同时施用所述长效胰岛素缀合物和所述长效促胰岛素肽缀合物进行。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述同时施用通过同时、序贯或逆序地施用所述长效胰岛素缀合物和所述长效促胰岛素肽缀合物进行。
19.ー种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括长效胰岛素缀合物和促胰岛素肽。
20.ー种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括胰岛素和长效促胰岛素肽缀合物。
【文档编号】A61P3/10GK103596595SQ201280026982
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年6月1日 优先权日:2011年6月2日
【发明者】禹姈银, 张明贤, 朴永振, 朴荣敬, 林昌基, 权世昌 申请人:韩美科学株式会社