专利名称：用于表征蠕虫卵特别是鞭虫卵的生物学活性的方法
用于表征蠕虫卵特别是 鞭虫卵的生物学活性的方法本发明涉及用于测定处于生活史不同阶段的蠕虫(Helminth)卵、特别是鞭虫 (Trichuris)卵、优选猪鞭虫(Trichuris suis)卵的生物学活性的方法。所述方法使得作 为治疗性药品有效成分的蠕虫卵制备物(Preparation)能够以受控的方式得到生产，并且 能够保证对人的安全的且在治疗上有效的应用。寄生虫感染对激活其动物宿主免疫系统的影响是已知的(Review，D M Mckay, Parasitology 2006，！^ :1_12)。这种激活还影响自身免疫病的发生和进程。流行病学研 究显示，在蠕虫感染(Wurminfektion)比率高的区域中，自身免疫病少于因更好的卫生条 件而使这些感染率较低的区域。患克罗恩氏病(Morbus Crohn)(一种慢性炎症性肠病)的 患者的细胞因子概貌(Cytokinprofile)显示Th2_免疫细胞能够受到蠕虫感染的刺激。克 罗恩氏病，一种Thl支配的自身免疫疾病，可以通过蠕虫感染来预防或影响(Summers等人， Am J Gastroenterol 2003，巡2034_2041)。早在1971年，Beer (Br. Med. J.，1971，2:41)就报道了猪鞭虫对于实现对人的定向 中度感染而不诱导致病效果(例如，伴有人的病原体鞭虫(Trichuris trichiura)的感染) 可能是一种合适的线虫。根据较新的研究，猪鞭虫对人的感染似乎只是暂时的，而且这些蠕 虫显然在它们能够繁殖之前就遭驱除。不过，对于就慢性炎症性肠病使用猪鞭虫的积极临 床研究指出这样的事实，即这种对人的暂时感染能够引发对免疫系统在治疗上有效的调节 (Summers 等人，Am. J. Gastroenterol. 2003,98 :2034_2041)。猪鞭虫的生活史(Lebenszyklus)始于产下未胚胎化的卵(LO期)，这些卵随着粪 便从受感染的动物排出。在土壤中历时3-6个月的时间胚胎化(Embryonierimg)成第一幼 虫期Li。在达到Ll期之后的最开始的几天中，能够在卵中观察到幼虫的运动，然后卵进入 休眠状态，在这种状态它们能够维持数年而不丧失它们的感染性。在由合适的宿主经口摄 入之后，在肠腔中Ll幼虫从卵孵出并在几个小时之内穿透进入盲肠和结肠的粘膜。幼虫 在接下来的几周中在肠粘膜中经历进一步的幼虫发育期(L2-L4)，直到它们最终作为成体 (adult) L5 幼虫再次进入肠腔(Beer, Parasito 1. 1973,67 :253_262)。为了在制药上制备出猪鞭虫卵(Trichuris suis ova = TS0)，使用合适的方法分 离并纯化体外或原位产下的未胚胎化的TSO(LO) (W0 199933479, WO 2007 076868, WO 2007 134761)。接下来，在受控的实验室条件下进行胚胎化，以形成有生物学活性的(Ll)TSO，其 表现为药品的药物活性部分。具有治疗应用的蠕虫卵可归类为生物药品。在生物药品的生产和应用中必需检测 的核心参数是生物学活性，其在根本上是对药品治疗效果的衡量。不分析生物学活性，就无 法合理地开发和监控生产过程，也无法对在人中的计划应用来决定对患者的治疗效果所必 需的以及患者所能承受的药品剂量。因此，只有那些生物学活性完全合格的蠕虫卵制备物 才能安全且有效地用作药品。迄今为止，已经向猪鞭虫提供了三种分析方法，然而它们仅仅是不充分地表征了 生物学活性。1.胚胎化率的测定(Kringel 等人，Vet. Parasitol. 2006，139 132-139，段落2·2(猪鞭虫)；也见 Johnson 等人，Intl. J. Parasitol. 1998，28，627-633 (猪蛔虫(Ascaris suum)))该研究在显微镜下进行。其借助形态学标准评估卵是否含有完整的、完全成形的 Ll幼虫。然而，与在本申请中描述的分子生物学方法不同的是，仅从形态学评估无法绝对肯 定地推出幼虫是否确实完全胚胎化。另一个限制在于这样一个事实，即胚胎化率没有提供 关于胚胎化Ll TSO的生存力和生物学活性的信息。此外，形态学评估要求观察者的经验， 而形态学边界情况的主观划分限制了这种方法的正确性和准确性。2.感染率的测定对于猪鞭虫，分析是对猪进行的。在感染之后的特定时间点，测 定肠粘膜中形成的幼虫数，并与应用的TSO剂量建立关联(Kringel等人，Vet. Parasitol.， 2006，122 132-139，也见 Summers 等人，2005，Gastroenterology，128 :825_832 或 Johnson 等人，Intl. J. Parasitol. 1998，28，627-633 (猪蛔虫))。在感染率测定中存在的问题是其 不仅依赖于蠕虫卵的功能性，还同样依赖于个体宿主因素，诸如例如实验动物的免疫系统、 肠内菌群和肠功能。因此，实验动物中感染率的测定本质上伴有高度可变性，并且由于天然 测试系统的原因而无法进行标准化，这相当大地限制了作为生物学活性检测的适用性。对 于猪鞭虫，对猪的感染性测试涉及至少三周的长时间孵育期，并且由于高度可变性还要涉 及大量的动物，这使得此种检测的常规使用在伦理和经济两方面都产生了问题。另外，Kringel等人描述 了从受到蠕虫卵感染的动物的粪便回收卵作为蠕虫卵生 物学活性的证据。此外，在动物受到感染之后，需要等待7-8周直到孵出的幼虫成熟到L5 期、交配并产下它们自己的卵。并不存在下述直接的、定量的联系，即能根据这种联系由粪 便中卵的数目表明成体幼虫的感染率或生物学活性。显然Kringel等人的方法与本申请 中描述的在体内测定孵化率是有区别的，因为在Kringel等人的方法中分析的是下一代的 卵。3. WO 2007/134761描述了一种用于证明猪鞭虫卵生存力的方法，其中体外刺激卵 通过猪的胃肠道，并由此使卵孵化。然而，这些方法不足以以药用产品所要求的精确度来测定蠕虫卵制备物的生物学 活性。因此，在动物中检测其生物学活性的生物药品的主要问题之一就是制备物的标准 化。动物模型的使用(如上文提及的猪的感染)是极其昂贵的并且要求大量的时间。因此在 本发明的范围中描述了这样的一种方法，其中进行了不同类型的检测，这些检测涉及蠕虫 卵发育及其生物学活性的不同方面。为了获得可靠的结论，必需对要分析的装料(charge) 进行至少一种根据本发明的检测，然而，优选进行至少三种，更优选进行至少四种或者甚至 五种本文描述的检测，其中在每种情况下测定相关的参数。整体上考虑单独检测的各个结 果，其中合适的蠕虫制备物必需在每个检测中满足预定的极限值，从而能够由此得到该蠕 虫卵制备物适于药物应用的结论。如此，非常需要这样一种能够在工业上应用的方法，其全面可靠地分析了不同发 育阶段的TSO和其它蠕虫卵的生物学活性并由此表征蠕虫卵的不同生物学功能。只有依靠 这样的方法才能以受控的方式生产适合销售的药用产品。本发明的目的是，通过下文详细描述的方法全面分析蠕虫卵的生物学活性，并由 此在一方面使得生产过程能够得到严密控制，并且在另一方面使得在患者中实现安全的且 在治疗上有效的应用。
鉴于目前已知方法的复杂问题和缺陷，显然生物学活性的可靠测定通常无法通过 单个方法步骤实现。因此本发明的主题是一种用于测定含有完全胚胎化幼虫的鞭虫卵的生物学活性的方法，并且在所述方法中进行下述测定中的至少一种使用生物化学和/或分子生物学方法测定鞭虫卵的温度诱导活性，特别是测量 ATP含量，测定胚胎化鞭虫卵中基因表达的可诱导性，在通过升高温度下的预孵育进行活化 之后经过长期观察在显微镜下测定卵中存在的鞭虫幼虫的运动性，和/或测定实验动物中 鞭虫幼虫的孵化率，其中将从肠内容物回收的完整胚胎化卵相较于内部标准品(interner Standard) i^^T^M (quantifizieren)。因此，开发了由五种测定组成的系统，这些测定分别研究蠕虫处于其生活史特定 阶段的不同生物学功能。尽管在药物制备的单个生产步骤中只应用一种测定方法可能是足 够的，但是为了测定终产品的生物学活性，通常必需进行至少3种在表1中描述的测定。
权利要求
1.用于测定胚胎化鞭虫(Trichuris)卵的生物学活性的方法，其中进行以下测定中的 至少一种a)借助定量PCR分析通过使用供确定基因组DNA拷贝数用的合适标志序列来测定和/ 或确认蠕虫卵的胚胎发育阶段，b)依靠生物化学和/或分子生物学方法测定胚胎化蠕虫卵的代谢活性，c)测定胚胎化蠕虫卵中基因表达的可诱导性，d)在升高的温度预孵育后用显微镜经长时间观察来测定在卵中存在的蠕虫幼虫的运 动性，和/或e)测定实验动物中鞭虫幼虫的孵化率，其中将从肠内容物回收的完整的胚胎化卵相较 于内部标准品进行定量。
2.根据权利要求la)的方法，其中依靠定量PCR分析使用适合于猪鞭虫的特异性序列 测定基因组DNA的拷贝数。
3.根据权利要求lb)的方法，其特征在于测量ATP含量以测定胚胎化鞭虫卵的代谢活性。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述鞭虫卵在荧光测量之前在以下条件下预孵育aa)36°C -42 °C bb) 2-30 小时cc)在pH 0. 1-3的悬浮培养基中。
5.根据权利要求lb)的方法，其特征在于将所述鞭虫卵先用选自次氯酸、壳多糖酶和/ 或蛋白酶的预处理剂处理，再用四唑盐染色。
6.根据权利要求Ic)的方法，其特征在于测定热休克蛋白的可诱导性。
7.根据权利要求Ic)的方法，其特征在于通过与荧光标记的核苷酸探针杂交来检测表达。
8.根据权利要求Ic)的方法，其特征在于借助流式细胞术检测杂交。
9.根据权利要求Id)的方法，其特征在于卵中蠕虫幼虫的运动性是通过显微镜在历时 2分钟到8小时的时间借助慢摄速放摄影来测定的。
10.根据权利要求Ie)的方法，其特征在于待检验的蠕虫卵用荧光探针标记，并且内部 标准品用不同颜色的荧光探针标记。
11.根据权利要求Ie)的方法，其特征在于将兔和/或猪的肠内容物用作检测体系。
12.根据权利要求Ie)的方法，其特征在于将未胚胎化的鞭虫卵或灭活的鞭虫卵用作 内部标准品用于确定孵化率。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于进行至少三种选自测定la)、lb)、 lc) Ud)和/或le)的测定。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于在进行所述测定之前将鞭虫卵在 精确标准化的条件下预孵育至少30分钟到24小时的时间，其中所述预孵育任选还包括改 变主要参数，特别是温度。
15.鞭虫卵，其特征在于根据权利要求1-14中任一项的方法测定，所述鞭虫卵的至少 50%有生物学活性。
16.根据权利要求15的鞭虫卵在生产用于治疗自身免疫病的药物产品中的用途。
全文摘要
本发明涉及测定胚胎化鞭虫卵的生物学活性的方法，根据该方法进行以下步骤a)借助定量PCR分析使用供确定基因组DNA拷贝数用的合适标志序列来测定和/或确认蠕虫卵胚胎发育的阶段，b)依靠生物化学和/或分子生物学方法测定胚胎化蠕虫卵的代谢活性，c)测定胚胎化蠕虫卵中基因表达的可诱导性，d)在升高的温度预孵育之后用显微镜经长时间观察测定在卵中存在的蠕虫幼虫的运动性，和/或e)测定实验动物中鞭虫幼虫的孵化率，其中将从肠内容物回收的完整的胚胎化卵相较于内部标准品进行定量。
文档编号C12Q1/66GK102037141SQ200980118522
公开日2011年4月27日 申请日期2009年5月20日 优先权日2008年5月21日
发明者伯恩哈德·特维斯, 鲁道夫·威廉 申请人:福尔克博士药物有限责任公司