一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于卵黄抗体制备技术领域，具体涉及一种禽用多联特异性卵黄抗体及转 移因子的制备方法。
【背景技术】
[0002] 在哺乳动物，转移因子和抗体主要富集在淋巴组织、循环血、胎盘及初乳中，哺乳 动物的后代通过胎盘和初乳获得和继承母体的免疫防御能力，进而逐渐建立自身的免疫防 御系统。在禽类，转移因子和抗体主要富集于卵黄，通过卵黄把母体的免疫防御能力传递给 它们的后代。因此，禽类的卵黄是人工提取卵黄抗体和卵黄转移因子的最佳物质。转移因 子和抗体可用以防病治病是早已被人们所共识，与传统的化学药物及抗生素比较，它们的 优点是无毒副作用、无药物残留，也不会通过生物链损害人类，是一种节能环保、安全有效 的防治手段。卵黄抗体除了具有与哺乳动物产生的抗体相同的功能外，还具有比哺乳动物 抗体更优越的特性，它耐酸、耐碱、耐高温，便于贮存和运输，它能抵抗胃酸的破坏，所以注 射和口服效果均很好。制备卵黄抗体比制备哺乳动物抗体也有更多优越性。制备卵黄抗体 不需杀生、只需取高免鸡蛋，取材方便、成本低、产量高、质量优、无菌化处理较方便，所以用 卵黄抗体和卵黄转移因子防病治病，是一条优选免疫防疫途径。
[0003] 迄今，禽用特异性卵黄抗体和卵黄转移因子及制备方面的专利报道较多，但多数 是单一疾病的特异性卵黄抗体及卵黄转移因子，2?3联特异性卵黄抗体及卵黄转移因子 有少量报道，4联以上特异性卵黄抗体及卵黄转移因的专利未见报道。现有的专利中，特异 性转移因子和特异性卵黄抗体都是单独制备，未见采用同一工艺同时生产卵黄抗体和卵黄 转移因子的报道。在制备工艺方面，一般采用反复冻融和研磨法破碎卵黄组织细胞，这种方 法费时、费力，难于工业化生产。在转移因子分离提取方面，一般都采用透析法进行提取，这 种方法需用透析袋，在4°C无菌蒸馏水中进行，生产周期需要48h甚至更长，也难以进行工 业化生产。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术存在的缺陷，提出了一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因 子的制备方法，采用同一工艺流程同时制备出特异性卵黄抗体和卵黄转移因子，达到节能、 减排、扩能、增效的目的。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法，具体包括以下步骤：
[0007] 1)将禽类疾病的疫苗通过腿部或翅下肌注方法，联合免疫产蛋鸡，第一次免疫后 7?10d，进行第二次加强免疫，第二次免疫后5?7d，收集含有免疫抗体的鸡蛋；
[0008] 2)连续收集高免产蛋鸡的鸡蛋，每隔一个月加强免疫一次，再继续收集鸡蛋，直到 产蛋鸡被淘汰；
[0009] 3)将收集的鸡蛋清洗，放入70%酒精浸泡lOmin，晾干后分离蛋黄；
[0010] 4)用高压均质机在60Pa条件下进行卵黄组织破碎，加蒸馏水后搅拌均匀；
[0011] 5)调节卵黄溶液的PH，离心去除沉淀脂蛋白，收取上清液；
[0012] 6)上清液经压力微孔过滤进一步除去脂蛋白和脂肪，收取滤液；
[0013] 7)将以上滤液经超滤器进行超滤，收集被截留的液体为特异性卵黄抗体粗制品， 滤液为多联特异性卵黄转移因子生物制品；
[0014] 8)取卵黄抗体粗提液中加冷酒精，使卵黄抗体粗提液质量浓度为50?60%，充分 搅拌使其混浊沉淀，在4000r/min离心20?30min，收集沉淀物；
[0015] 9)加蒸馏水恢复到所取卵黄抗体粗提液体积，然后加冷酒精使其浓度达到25? 30%，充分搅拌使其混浊沉淀，在4000r/min离心20?30min，收集沉淀物，重复两次；
[0016] 10)收取沉淀物，加适量蒸馏水使其沉淀物溶解或在37°C温箱烤干，即为精制多 联特异性卵黄抗体。
[0017] 本发明所述的疫苗为防治禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊炎、鸡 球虫病、鸡白痢、鸭瘟、鸭肝炎、鸡支原体病或鸡大肠杆菌病中多种的混合疫苗。
[0018] 本发明步骤（1)中所述的含有免疫抗体的鸡蛋为检测得到抗体效价大于IXKT4 的鸡蛋。
[0019] 本发明步骤（4)中破碎蛋黄组织与蒸馏水的体积比为1:10?30。
[0020] 本发明步骤（5)具体为使用盐酸和氢氧化钠溶液调节卵黄溶液的PH为5. 4? 6. 0,在3500?4000r/min离心机离心20?30min，去除沉淀脂蛋白，收取上清液。
[0021] 本发明步骤（6)所述的压力微孔过滤孔径为0. 22 μ m。
[0022] 本发明步骤（7)中超滤膜截留分子量为lOOOODa。
[0023] 本发明的有益效果为：1)本发明生产的多联特异性卵黄抗体，一种产品可预防治 疗多种禽病；2)本发明方法生产出多联特异性卵黄抗体的同时，还有卵黄转移因子生物制 品副产品的产出，达到更加节能、减排、省时、省力、增产、增效的效果；3)本发明采用高压 均质机取代反复冻融研磨工艺破碎组织细胞，用超滤机取代透析法分离转移因子和卵黄抗 体，大大缩短生产周期、增加产量、提高质量、更适合大规模工业化生产；4)本发明生产的 多联特异性卵黄抗体含量为6?7mg/mL，效价为I X ΚΓ5,远高于目前已获注册批文的同类 产品，转移因子多肽类含量为6?7mg/mL，和疫苗配伍使用能提高疫苗的效力2. 4倍，远超 过国内已获得注册批文的转移因子。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0025] 应用实施例一 [0026] 实施例1
[0027] 一种禽用多联特异性卵黄抗体及转移因子的制备方法，具体包括以下步骤：
[0028] 1)免疫：将禽类多种重要疾病的疫苗（含禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染 性法氏囊炎、鸡球虫病、鸡白痢、鸭瘟、鸭肝炎、鸡支原体病、鸡大肠杆菌病）通过腿部或翅 下肌注方法，联合免疫产蛋鸡，第一次免疫后7?10d，进行第二次加强免疫，第二次免疫后 5?7d，收集鸡蛋。用ELISA检测卵黄是否产生以上所有疫苗的卵黄抗体以及其滴度，如果 有的疫苗没有产生可检抗体，再用该疫苗单独加强免疫一次，第三次加强免疫后第五天，开 始收集鸡蛋，检测卵黄抗体，能检测到几种抗体而且其效价在IX 1〇_4以上的，之后所提取 的卵黄抗体和卵黄转移因子，就命名为几联特异性卵黄抗体和特异性卵黄转移因子。
[0029] 2)取材：连续收集高免产蛋鸡的鸡蛋，每隔一个月加强免疫一次，再继续收集鸡 蛋，直到产蛋鸡被淘汰。
[0030] 3)卵黄分离：将鸡蛋用清水洗净，放入70%酒精浸泡IOmin