一种双特异性抗体cd19xcd3的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学的技术领域。具体地说，本申请设及双特异性抗体的构建和应 用。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体化ispecificantibody,BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的 人工抗体，能在祀细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在 生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用 杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关 抗原和免疫效应细胞上的祀分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。W下 是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，W及相关技术发展的一些【背景技术】介绍。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4个亚基组成；5、e、丫、C，其分子质量分别为18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肤链， 常与T细胞受体（Tcellrec巧tor，TCR)紧密结合形成含有8条肤链的TCR-CD3复合体，结 构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免 疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，TCR 识别并结合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肤，导致CD3的 ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p561ck磯酸化，然后可募集其 他含有甜2(Scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磯酸化和 与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分 子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。
[0005] 2.CD19
[0006] CD19在正常及恶性B淋己细胞中均有表达，被视为B细胞发育过程中一个涵盖阶 段较长的最为可靠的表面标记物。在正常淋己组织中，CD19表达于生发中屯、的B细胞和滤 泡树突状细胞、套细胞、滤泡间T细胞区的树突状大细胞，与CD20和CD22染色模式基本相 同，但同CD20相比，CD19在前B细胞中也表达。此外，通过流式细胞学检测方法，CD19在 人体组织分离得到的浆细胞中可W检测到。通常来说CD19在B淋己细胞瘤中表达，其中包 括B淋己细胞淋己瘤、小淋己细胞淋己瘤、套细胞淋己瘤、滤泡淋己瘤、Burkitt淋己瘤、边 缘区淋己。
[0007] 3.双特异性抗体技术发展
[000引双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原 表位的抗体。
[0009] 抗体药物是W细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物 大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定祀点定向制备等优点。单克隆抗体在临 床上主要应用于W下=个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗W及抗感染治疗。其中肿瘤的治 疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗产品中，用于肿 瘤治疗的产品数量占比大概为50%。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异祀点刺 激免疫系统来杀伤祀细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的 效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之 一，现已成为抗体工程研究领域的热点。
[0010] 用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在 祀细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗 中具有广阔的应用前景。
[0011] 4.双特异性抗体制备
[0012] 双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交一杂交 瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连 接在一起，制备出了双特异性单克隆抗体，该是最早的双特异性单克隆抗体概念。杂交一杂 交瘤法是通过细胞杂交法或者=元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，该些细胞杂交 瘤或者=元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋己细胞 融合而得到的，只能生产出鼠源的双特异性抗体，它的应用受到了极大的限制。而随着分子 生物学技术的迅速发展，出现了基因工程双特异性抗体的多种构建模式，并主要分为双特 异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体，多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数种基因 工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。
[0013] 5.肿瘤的过继免疫治疗
[0014] 肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者 体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活 的T淋己细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于 晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合 应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿 瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手 术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛 的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是，双特异性抗体一端可W结合培养好的免疫细 胞的表面抗原CD3,并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细 胞的表面抗原；该样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免 疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。通过该种方法可有效解决肿瘤细 胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗S大传统治疗方式后的"不彻底、易转移、副作用大" 等弊端。
【发明内容】
[0015] 术语和缩略语
[0016] BiAb:双特异性抗体化ispecificantibody)
[0017] TA:肿瘤抗原（tumorantigen)
[0018] VH:重链可变区化eavychainvari油leregion)。
[0019] VL:轻链可变区（li曲tchainvari油leregion)。
[0020]CL;轻链恒定区（^constantregionofli曲tchain)。
[0021] CDR;是英文Complementaritydeterminingregions(CDRs)的缩写，是指抗体的 抗原互补决定区。
[002引ScFv;单链可变区抗体片段（single-chainvari油lefragment)，又称为单链抗 体。
[002引 化D:细胞系开发（celllinedevelopment)
[0024] FACS;巧光激活细胞分选（Fluorescence-activatedcellsorting)，也称为流式 细胞分选术。
[0025] 本发明针对常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法进行的 新分子-双特异性抗体的创制，在传统单克隆抗体主要通过CDC，ADCC和调亡能力来杀伤肿 瘤细胞的基础上，增加了介导T细胞的免疫疗法，大大提高了免疫系统杀伤肿瘤细胞的功 效。
[0026] 具体地，本发明提供了W下的技术方案：
[0027] 在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体，其特征在于，该抗体包含；(a)单链 单元A，为融合肤，该融合肤包含单链可变片段ScFv和具有较链区、C肥结构域和C册结构 域的Fc片段，其中该融合肤针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选地该肿瘤细 胞表面抗原是CD19、CD20、CD30和CD133,更优选地该肿瘤细胞表面抗原是CD19 ;和化）单 链单元B，为融合肤，该融合肤包含单链可变片段ScFv和具有较链区、C肥结构域和C册结 构域的化片段，其中该融合肤针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细胞；优选地， 该融合肤对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。
[002引在一种实施方式中，所述单链单元A和所述单链单元B的C肥结构域位于ScFv片 段和C册结构域之间。
[0029] 在一种实施方式中，所述单链单元A和所述单链单元B的单链可变片段由轻 链可变区和重链可变区结构域组成，它们分别都祀向于抗原表位CD19和抗原表位CD3 ; 单链单元A单链可变片段的轻链可变区和重链可变区由佑GGG巧3的短肤进行连接，如 VH-佑GGG巧3-VL;单链单元B单链可变片段的轻链可变区和重链可变区佑GGG巧3的短肤进 行连接，如VH-佑GGG巧3-VL。
[0030] 在一种实施方式中，所述单链单元A的较链区和所述单链单元B的较链区通过通 过一个或多个二硫键相连接。
[0031] 在一种实施方式中，单链单元A包括针对人源CD19的抗体抗-CD19;单链单元B包 括针对人源CD3的抗体抗-CD3 ;
[0032] 优选地，所述抗-CD19ScFv-化的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，W及 所述抗-CD3ScFv-化的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列；所述抗-CD19重链在265 和268位点