Cll-1特异性的抗体的制作方法
【专利说明】CLL-1特异性的抗体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年5月7日提交的美国临时申请第61/643, 739号、于2012年 9月10日提交的美国临时申请第61/699, 134号以及2013年3月11日提交的美国申请第 13/794, 525号的优先权，所述申请的公开内容通过引用整体并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] C型凝集素样分子I (CLL-I)表达于AML细胞和癌症干细胞（CSC)上，所述癌症干 细胞为能产生额外的癌细胞的细胞。
[0005] 化疗的一个主要限制是抗癌药物无法区分正常细胞和癌细胞。主要类别的抗肿瘤 药剂的几乎所有成员都对正常细胞具有相当大的毒性。
[0006] 特异性靶向癌细胞的组合物可避免该问题。然而，现有癌症靶向物不靶向CSC。由 于这一原因，现有化疗策略并未有效清除癌症，即使当特异性地递送至癌细胞时亦如此。由 于存活的CSC可产生新的癌细胞，因此仍存在复发风险。
[0007] 与造血干细胞（HSC)相似，CSC表达⑶34,但是在HSC上不表达CLL-I。这使得能 够使用CLL-I来特异性地靶向CSC。本文提供了识别高百分比的表达CLL-I的细胞的CLL-I 抗体。本CLL-I抗体对表达CLL-I细胞的补体依赖性毒性和抗体依赖性毒性都有效，并且 抑制表达CLL-I的癌细胞的肿瘤生长。本文描述的抗体为靶向CLL-I相关疾病提供了新的 诊断策略和治疗策略。
[0008] 发明概述
[0009] 本文提供了 CLL-I特异性的抗体（"CLL-1抗体"），其结合来自AML患者样品的、 高百分比的表达CLL-I的原代细胞。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体以IOnM或更小的 Kd，例如5ηΜ、1ηΜ、500ρΜ、200ρΜ、100pM、50pM中的任何Kd或更小的Kd，特异性结合人CLL-I 的胞外结构域。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体以100nM、10nM、InM、IOOpM或更小的Kd 结合食蟹猴CLL-I。例如，在一些实施方案中，食蟹猴CLL-I和人CLL-I竞争结合所述CLL-I 抗体。本领域技术人员将理解，较高亲和力的结合表示为较低的Kd(较低浓度的结合所必 需的抗体靶标）。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实 施方案中，所述CLL-I抗体与细胞毒素连接。
[0010] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体结合由CLL-I的C-凝集素结构域组成的多肽 的Kd为其结合包含或由CLL-I的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的Kd的至少5 倍，例如，至少10倍、20倍、50倍或100倍中的任一倍数。换言之，所述抗体结合含有CLL-I 的茎结构域和C-凝集素结构域的多肽的亲和力比其结合单独的C-凝集素结构域或单独的 茎结构域的亲和力高。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体结合包含部分茎结构域和部分 C-凝集素结构域的表位。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体结合由人C型凝集素样分子 (CLL-I)的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的亲和力，比其结合（a)由人CLL-I的 C-凝集素结构域组成的多肽或（b)由人CLL-I的茎结构域组成的多肽的亲和力更大。例 如，命名为M26和M31的CLL-I抗体结合人CLL-I的101位至265位氨基酸的亲和力比其 结合人CLL-I的141位至265位氨基酸（参照SEQ ID NO: 2)的亲和力高。在一些实施方 案中，所述CLL-I抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体与细 胞毒素连接。
[0011] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体结合CLL-I的C-凝集素结构域的Kd为其结 合全长CLL-I胞外结构域的Kd的至少5倍，例如，至少10倍、20倍、50倍或100倍中的任 一倍数。换言之，所述CLL-I抗体的亲和力是对全长CLL-I胞外结构域（例如，如在细胞上 表达的）的亲和力的1/5、1/10、1/20、1/50或1/100中的任一项。在一些实施方案中，所述 CLL-I抗体结合静止期的表达CLL-I的细胞。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体以IOnM 或更小的Kd，例如，以ΙηΜ、500ρΜ、200ρΜ、ΙΟΟρΜ、50pM中的任何Kd或更小的Kd结合静止期 的表达CLL-I的细胞。
[0012] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体结合HL60细胞培养物中至少60%的细胞，例 如HL60细胞的至少70%、75%、80%、85%、90%、95%中的任意百分比或更高。在一些实施 方案中，所述CLL-I抗体结合来自AML患者的原代细胞样品中至少30% (例如40%、50%、 60 %、70 %、80 %、85 %、90 %、95 %中的任意百分比或更高的百分比）的有核细胞，其中所 述原代细胞样品是外周血或肿瘤组织活检样品。本领域技术人员将理解，在这样的细胞结 合测定中，添加合适浓度的抗体，例如以使得存在足够的抗体分子来结合培养物或样品中 的众多细胞。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施 方案中，所述CLL-I抗体与细胞毒素连接。
[0013] 在一些实施方案中，在以表达CLL-I的细胞（例如，HL60细胞或原代AML细胞）进 行的抗体-药物缀合物（ADC)细胞毒性测定中，所述CLL-I抗体具有小于InM的EC50。在 一些实施方案中，在ADC测定中的EC50为500ρΜ、200ρΜ、ΙΟΟρΜ、50pM中的任一项或更小。在 一些实施方案中，在ADC细胞毒性测定中，所述CLL-I抗体将AML细胞集落的形成降低了至 少50 %，例如至少60 %、70 %、80 %或更多。在一些实施方案中，所述细胞是原代患者AML细 胞。在一些实施方案中，所述细胞是AML癌症干细胞。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体不 影响正常的⑶34+造血干细胞（HSC)，或者在ADC细胞毒性测定中显著减少正常⑶34+HSC 集落的形成。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体是双特异性抗体的一部分。
[0014] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体在以表达CLL-I的细胞如HL60细胞或原代 AML细胞进行的补体依赖性细胞毒性（CDC)测定中具有1 μ g/ml或更小的EC50。在一些实 施方案中，在 CDC 测定中，EC50 为 500ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ ml中的任何一项或更小。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体在以表达CLL-I的细胞如 CLL-I转染的293细胞、HL60细胞或原代AML细胞进行的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)测定中，具有1 μ g/ml或更小的EC50。在一些实施方案中，在ADCC测定中，EC50为 500ng/ml、200ng/ml、100ng/ml中的任一项或更小。在一些实施方案中，当向携带有AML异 种移植物的小鼠给予至少4周时，与未处理对照（即，携带AML异种移植物但未用CLL-I抗 体处理的小鼠）相比，所述CLL-I抗体将肿瘤负荷降低的倍数为至少10倍。在一些实施方 案中，所述AML异种移植物来自人AML细胞系，例如HL60细胞或OCI AML-5细胞。在一些 实施方案中，所述AML异种移植物来自原代人AML或原代灵长类（例如食蟹猴）AML细胞。 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述 CLL-I抗体与细胞毒素连接。
[0015] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体选自与选自以下的抗体竞争结合CLL-I (例 如，表达CLL-I的细胞或AML细胞）的抗体：
[0016] ?包含M26的重链和轻链⑶R的抗体（参见实施例1);
[0017] ?包含M31的重链和轻链⑶R的抗体；
[0018] ?包含G4的重链和轻链⑶R的抗体；
[0019] ?包含M22的重链和轻链⑶R的抗体；
[0020] ?包含M29的重链和轻链⑶R的抗体；
[0021] ?包含M2的重链和轻链⑶R的抗体；
[0022] ?包含M5的重链和轻链⑶R的抗体；
[0023] ?包含G12的重链和轻链⑶R的抗体；
[0024] ?包含M41的重链和轻链⑶R的抗体；
[0025] ?包含E3的重链和轻链⑶R的抗体；
[0026] ?包含BlO的重链和轻链⑶R的抗体；
[0027] ?包含G2的重链和轻链⑶R的抗体；
[0028] ?包含G6的重链和轻链⑶R的抗体；
[0029] ?包含G8的重链和轻链⑶R的抗体；
[0030] ?包含GlO的重链和轻链⑶R的抗体；
[0031] ?包含G14的重链和轻链⑶R的抗体；
[0032] ?包含G16的重链和轻链⑶R的抗体；
[0033] ?包含G23的重链和轻链⑶R的抗体；
[0034] ?包含G26的重链和轻链⑶R的抗体；
[0035] ?包含G28的重链和轻链⑶R的抗体；以及
[0036] ?包含G30的重链和轻链⑶R的抗体。
[0037] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体选自：选自以下的抗体：
[0038] ?包含M26的重链和轻链⑶R的抗体（参见实施例1);
[0039] ?包含M31的重链和轻链⑶R的抗体；
[0040] ?包含G4的重链和轻链⑶R的抗体；
[0041] ?包含M22的重链和轻链⑶R的抗体；
[0042] ?包含M29的重链和轻链⑶R的抗体；
[0043] ?包含M2的重链和轻链⑶R的抗体；
[0044] ?包含M5的重链和轻链⑶R的抗体；
[0045] ?包含G12的重链和轻链⑶R的抗体；
[0046] ?包含M41的重链和轻链⑶R的抗体；
[0047] ?包含E3的重链和轻链⑶R的抗体；
[0048] ?包含BlO的重链和轻链⑶R的抗体；
[0049] ?包含G2的重链和轻链⑶R的抗体；
[0050] ?包含G6的重链和轻链⑶R的抗体；
[0051] ?包含G8的重链和轻链⑶R的抗体；
[0052] ?包含GlO的重链和轻链⑶R的抗体；
[0053] ?包含G14的重链和轻链⑶R的抗体；
[0054] ?包含G16的重链和轻链⑶R的抗体；
[0055] ?包含G23的重链和轻链⑶R的抗体；
[0056] ?包含G26的重链和轻链⑶R的抗体；
[0057] ?包含G28的重链和轻链⑶R的抗体；以及
[0058] ?包含G30的重链和轻链⑶R的抗体，
[0059] 其中所选⑶R中的任何一种或多种可比初始⑶R序列具有1、2或3个保守氨基酸 替换。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中， 所述CLL-I抗体与细胞毒素连接。
[0060] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体包含M26的重链和轻链⑶R。在一些实施方案 中，所述CLL-I抗体包含M31的重链和轻链⑶R。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体包含 G4的重链和轻链CDR。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体是双特异性抗体的一部分。在 一些实施方案中，所述CLL-I抗体与细胞毒素连接。
[0061] 在一些实施方案中，上述CLL-I抗体结合由CLL-I的C-凝集素结构域组成的多肽 的Kd为其结合由CLL-I的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的Kd的至少5倍（例 如，至少10倍、20倍、50倍、100倍中的任一倍数或更高倍数）。在一些实施方案中，所述 CLL-I抗体结合CLL-I的C-凝集素结构域的Kd为其结合全长CLL-I胞外结构域的Kd的至 少5倍（例如，10倍、20倍、50倍或100倍中的任一倍数或更高倍数）。在一些实施方案中， 上述CLL-I抗体还结合HL60细胞培养物中至少80 %的细胞（例如85%、90%、95 %中的任 意百分比或更高百分比）。在一些实施方案中，上述CLL-I抗体还结合来自患有AML个体的 AML细胞样品中至少30%的有核细胞（例如40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95% 中的任意百分比或更高百分比）。再次地，在这样的细胞结合测定中，添加合适浓度的抗体， 例如以使得存在足够的抗体分子来结合培养物或样品中的众多细胞，并且抗体浓度不是限 制因素。
[0062] 在一些实施方案中，上述CLL-I抗体是具有例如来自IgGl的人Fc区的嵌合抗体。 在一些实施方案中，上述CLL-I抗体是人源化的。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体是双 特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，上述CLL-I抗体是Fv片段（例如，Fab、Fab'或 F(ab'）2)。在一些实施方案中，对上述CLL-I抗体进行标记，例如，与可检测部分缀合。在 一些实施方案中，上述CLL-I被连接于治疗化合物，例如细胞毒素或细胞生长抑制剂。
[0063] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体选自：
[0064] ?包含与M26的可变区序列（Vh = SEQ ID N0:4 ;V1 = SEQ ID N0:6)基本相同 (至少85%、90%、95%或98%的同一性中的任意项）的可变区序列的抗体；
[0065] ?包含与M31的可变区序列（Vh = SEQ ID N0:8 ;V1 = SEQ ID N0:10)基本相同 的可变区序列的抗体；
[0066] ?包含与G4的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 12 ;V1 = SEQ ID NO: 14)基本相同 的可变区序列的抗体；
[0067] ?包含与M22的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 16 ;V1 = SEQ ID NO: 18)基本相同 的可变区序列的抗体；
[0068] ?包含与M29的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:20 ;V1 = SEQ ID NO:22)基本相同 的可变区序列的抗体；
[0069] ?包含与M2的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:24 ;V1 = SEQ ID NO:26)基本相同 的可变区序列的抗体；
[0070] ?包含与M5的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:28 ;V1 = SEQ ID NO:30)基本相同 的可变区序列的抗体；
[0071] ?包含与G12的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:32 ;V1 = SEQ ID NO:34)基本相同 的可变区序列的抗体；
[0072] ?包含与M41的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0073] ?包含与E3的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0074] ?包含与BlO的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0075] ?包含与G2的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0076] ?包含与G6的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0077] ?包含与G8的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0078] ?包含与GlO的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0079] ?包含与G14的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0080] ?包含与G16的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0081] ?包含与G23的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0082] ?包含与G26的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；
[0083] ?包含与G28的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体；以及
[0084] ?包含与G30的可变区序列基本相同的可变区序列的抗体。
[0085] 在一些实施方案中，所述基本相同的抗体具有初始抗体的⑶R序列。
[0086] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体与选自以下的抗体竞争结合：
[0087] ?包含 M26 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:4 ;V1 = SEQ ID NO:6)的抗体；
[0088] ?包含 M31 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:8 ;V1 = SEQ ID NO: 10)的抗体；
[0089] ?包含 G4 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 12 ;V1 = SEQ ID NO: 14)的抗体；
[0090] ?包含 M22 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 16 ;V1 = SEQ ID NO: 18)的抗体；
[0091] ?包含 M29 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 20 ;V1 = SEQ ID NO: 22)的抗体；
[0092] ?包含 M2 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 24 ;V1 = SEQ ID NO: 26)的抗体；
[0093] ?包含 M5 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 28 ;V1 = SEQ ID NO: 30)的抗体；
[0094] ?包含 G12 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:32 ;V1 = SEQ ID NO:34)的抗体；
[0095] ?包含M41的可变区序列的抗体；
[0096] ?包含E3的可变区序列的抗体；
[0097] ?包含BlO的可变区序列的抗体；
[0098] ?包含G2的可变区序列的抗体；
[0099] ?包含G6的可变区序列的抗体；
[0100] ?包含G8的可变区序列的抗体；
[0101] ?包含GlO的可变区序列的抗体；
[0102] ?包含G14的可变区序列的抗体；
[0103] ?包含G16的可变区序列的抗体；
[0104] ?包含G23的可变区序列的抗体；
[0105] ?包含G26的可变区序列的抗体；
[0106] ?包含G28的可变区序列的抗体；以及
[0107] ?包含G30的可变区序列的抗体。
[0108] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体选自：
[0109] ?包含 M26 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:4 ;V1 = SEQ ID NO:6)的抗体；
[0110] ?包含 M31 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:8 ;V1 = SEQ ID NO: 10)的抗体；
[0111] ?包含 G4 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 12 ;V1 = SEQ ID NO: 14)的抗体；
[0112] ?包含 M22 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 16 ;V1 = SEQ ID NO: 18)的抗体；
[0113] ?包含 M29 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 20 ;V1 = SEQ ID NO: 22)的抗体；
[0114] ?包含 M2 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 24 ;V1 = SEQ ID NO: 26)的抗体；
[0115] ?包含 M5 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO: 28 ;V1 = SEQ ID NO: 30)的抗体；
[0116] ?包含 G12 的可变区序列（Vh = SEQ ID NO:32 ;V1 = SEQ ID NO:34)的抗体；
[0117] ?包含M41的可变区序列的抗体；
[0118] ?包含E3的可变区序列的抗体；
[0119] ?包含BlO的可变区序列的抗体；
[0120] ?包含G2的可变区序列的抗体；
[0121] ?包含G6的可变区序列的抗体；
[0122] ?包含G8的可变区序列的抗体；
[0123] ?包含GlO的可变区序列的抗体；
[0124] ?包含G14的可变区序列的抗体；
[0125] ?包含G16的可变区序列的抗体；
[0126] ?包含G23的可变区序列的抗体；
[0127] ?包含G26的可变区序列的抗体；
[0128] ?包含G28的可变区序列的抗体；以及
[0129] ?包含G30的可变区序列的抗体。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体是双特异性 抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-I抗体与细胞毒素连接。
[0130] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体包含M26的重链和轻链可变区序列。在一些 实施方案中，所述CLL-I抗体包含M31的重链和轻链可变区序列。在一些实施方案中，所述 CLL-I抗体包含G4的重链和轻链可变区序列。
[0131] 在一些实施方案中，上述CLL-I抗体结合由CLL-I的C-凝集素结构域组成的多肽 的Kd为其结合由CLL-I的C-凝集素结构域和茎结构域组成的多肽的Kd的至少5倍（例 如，至少10倍、20倍、50倍、100倍中的任一倍数或更高倍数）。在一些实施方案中，所述 CLL-I抗体结合CLL-I的C-凝集素结构域的Kd为其结合全长CLL-I胞外结构域的Kd的 至少5倍（例如，10倍、20倍、50倍或100倍中的任一倍数或更高倍数）。在一些实施方案 中，上述CLL-I抗体还结合HL60细胞培养物中至少80%细胞（例如85%、90%、95%中的 任意百分比或更高百分比）。在一些实施方案中，上述CLL-I抗体还结合来自患有AML个 体的AML细胞样品中至少30%的有核细胞（例如40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、 95%中的任意百分比或更高百分比）。
[0132] 在一些实施方案中，上述CLL-I抗体是Fv片段（例如，Fab、Fab'或F(ab'）2)。在 一些实施方案中，在单个抗体构建体中，所述抗体包含具有两种不同表位结合序列的两个 不同的可变区（例如，一个表位结合区来自M26、M31、G4或M22,并且一个表位结合区来自 M26、M31、G4或M22的任意组合）。在一些实施方案中，对上述CLL-I抗体进行标记，例如， 与可检测部分缀合。在一些实施方案中，