3-DTPA、 99niTc(C0)3-ENPy2、62/64/67Cu-TETA、 99mTc(CO)3-IDA以及99mTc(CO)3三胺（环状或线性的）。在一些实施方案中，所述试剂可 包括DOTA及其与 mIn、mLu、153Sm、88/9°Y、62/64/67Cu或 67/68Ga的多种类似物。在一些实施方 案中，可通过掺入与螯合剂连接的脂质（例如DTPA-脂质）来标记纳米颗粒，如在以下文 献中所提供的：Phillips 等，Wiley Interdisciplinary Reviews:Nanomedicine and Na nobiotechnology，I(I):69-83(2008) ;Torchilin，V. P. &Weissig，V.，Eds. Liposomes 第 2 版：0xford Univ.Press(2003) ;Elbayoumi，T.A.&Torchilin，V.P.，Eur.J.Nucl.Med· Mol. Imaging 33:1196 - 1205(2006) ;Mougin_Degraef，M 等，Int' I J.Pharmaceutics 344:110-117(2007)。
[0337] 在一些实施方案中，可将诊断试剂与第二结合配体或酶（酶标签）结合，其在与发 色底物接触后生成有颜色的产物。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、（辣根）氢过氧 化物酶和葡萄糖氧化酶。第二结合配体包括例如，如本领域已知的生物素和抗生物素蛋白 或链霉亲和素化合物。
[0338] 在一些实施方案中，如在下文中更详细描述的，还可将经标记的抗体与改进体内 稳定性的组合物结合，例如PEG或纳米颗粒如脂质体。
[0339] B.标记方法
[0340] 用于将可检测试剂和治疗剂缀合至抗体的技术是公知的（参见例如， Arnon 等，''Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld等（eds.)，第243-56页 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ;Hellstrom等，〃Antibodies For Drug Delivery〃in Controlled Drug Delivery(第 2 版），Robinson 等（eds.)，第 623-53 页（Marcel Dekker，Inc. 1987); Thorpe, ''Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review^Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications, Pinchera 等（eds.)，第 475-506 页（1985);以及 Thorpe 等，〃The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"，Immunol. Rev.，62:119-58(1982))〇
[0341] 通常，抗体在不干扰结合至表位的区域连接至可检测部分。因此，在一些情况下， 使可检测部分连接至恒定区，或可变区中CDR的外侧。本领域技术人员认可，可检测部分可 定位于抗体上的其他地方，并且可检测部分的位置可相应调节。在一些实施方案中，在连接 之前和之后对抗体与表位结合的能力进行比较，以确保该连接不过度地破坏结合。
[0342] 在一些实施方案中，所述抗体可与附加的靶向部分结合。例如，可将结合靶分子或 靶细胞上的不同位点的抗体片段、肽或适体与抗体缀合以优化靶标结合至例如癌细胞。
[0343] VL治疗应用
[0344] 可使用本文描述的CLL-I抗体来靶向表达CLL-I的细胞如AML细胞。针对AML 细胞和CSC (例如AML CSC)评价CLL-I的表达。CLL-I不显著性地在正常⑶34+造血干细 胞（HSC)上表达，因此，可使用本CLL-I抗体来从HSC中区分CSC。识别与AML细胞相同的 CLL-I表位，并因此能够普遍地结合AML细胞的高亲和力CLL-I抗体，是特别有价值的，因 为AML具有非常高的复发率。如上文所述，包含CLL-I抗体的治疗组合物还可包含可检测 标记以形成治疗诊断性组合物，例如用于检测和定位表达CLL-I的细胞，并监测治疗效果。
[0345] 如本文所述，所述CLL-I抗体可抑制癌细胞生长（增殖和/或移植）并且因此可 视为单独的化疗剂。以下公开内容提供了可连接至CLL-I抗体以对表达CLL-I的细胞产生 额外作用的化疗试剂和细胞毒性试剂的实例。
[0346] 化疗（抗癌）剂可为能够降低癌症生长、干扰癌细胞复制、直接或间接杀伤癌细 胞、降低转移、降低肿瘤血液供应等的任何试剂。因此，化疗试剂包括细胞毒性试剂。细胞 毒性试剂包括但不限于皂草素、紫衫烷、长春花生物碱、蒽环霉素和铂基试剂。化疗试剂的 种类包括但不限于烷基化试剂、抗代谢物例如甲氨蝶呤、植物生物碱例如长春新碱，和抗生 素例如多柔比星，以及不落在特定类型中的众多药物例如羟基脲。由顺铂和奥沙利铂例示 的铂基药物代表了化疗试剂的主要种类。这些药物结合DNA并干扰复制。由紫杉醇例示的 紫杉烷类代表了化疗试剂的另一个主要种类。这些化合物通过干扰细胞骨架和纺锤体形成 抑制细胞分裂，并从而阻止快速分裂的癌细胞的生长来发挥作用。其他化疗药物包括激素 治疗。
[0347] 可在同一组合物中或单独的组合物中组合多于一种治疗试剂。还可使治疗试剂与 适于特定个体的其他治疗试剂组合。向癌症患者提供的常用的治疗试剂包括克服疼痛、恶 心、贫血、感染、炎症和癌症患者通常经受的其他症状的药剂。
[0348] 可使用多种已知的交联剂使抗体连接至治疗试剂、可检测试剂或纳米载体。用于 多肽的共价连接或非共价连接的方法是本领域公知的。这样的方法可包括但不限于，使用 化学交联剂、光活化的交联剂和/或双官能交联剂。用于交联分子的示例性方法在美国专 利第5, 603, 872号和美国专利第5, 401，511号中有公开。交联剂的非限制实例包括戊二醛、 双官能环氧乙烷、乙二醇二缩水甘油醚、碳二亚胺如1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基）碳二 亚胺或二环己基碳二亚胺、双亚胺酯、二硝基苯、辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯、二琥珀酰 亚氨基酒石酸醋、二甲基 -3, 3' -二硫-双丙亚胺醋、叠氮乙二醛（azidoglyoxal)、N-琥?白 酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫）丙酸酯和4-(溴代氨乙基）-2-叠氮硝基苯。
[0349] 在一些实施方案中，所述CLL-I抗体与纳米载体结合。对于缀合至纳米载体（例如 脂质体）的抗体，表面上将存在一定数量的抗体，即，以给定的表面密度存在。在一些实施 方案中，所述纳米载体中的每个纳米载体将具有至少5个抗体，例如每个纳米载体至少10、 30、40、50、75、100或更多个抗体。本领域技术人员将理解，表面密度表示平均范围，因为对 于群体的所有成员，每个纳米载体的抗体数量将不会绝对一致。
[0350] 纳米载体包括囊，例如脂质体和胶束，以及聚合纳米颗粒等。纳米载体可用于递 送治疗试剂和诊断试剂，但是特别可用于遮挡用于治疗癌症的细胞毒性试剂。纳米载体可 包括脂质（例如磷脂）、亲水性聚合物、疏水性聚合物、两性化合物、交联聚合物和聚合基质 (参见例如W02009/110939)。根据应用，纳米载体可设计成具有特定的大小、半衰期、贮藏 寿命和泄漏率。
[0351] 诸如抗体靶向的脂质体、聚合纳米颗粒或延长的贮藏期限的脂质体等纳米载体的 制备在例如美国专利第6465188、7122202、7462603和7550441号中有描述。
[0352] 在一些实施方案中，所述抗体连接至稳定性部分如PEG或脂质体或其他纳米载 体。美国专利第4, 732, 863 和 7892554 号以及Chattopadhyay 等，（2010)M〇1 Pharm 7:2194 描述了用于将选择的抗体连接至PEG、PEG衍生物和纳米颗粒（例如脂质体）的方法。包含 磷脂酰-乙醇胺（PE)的脂质体可通过确立的如本文所述的方法来制备。PE的夹杂物提供 了脂质体表面上用于连接的活性官能位点。
[0353] 抗体缀合物还可配制成提供多于一种活性化合物，例如，另外的化疗试剂和细胞 毒性试剂、细胞因子或生长抑制剂。所述活性成分还可制备为缓释制备物（例如固体疏水 聚合物的半透性基质（例如，聚酯、水凝胶（例如聚（2-羟乙基-甲基丙烯酸酯）或聚（乙 烯醇））、聚乳酸）。在胶质药物递送系统（例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳 米囊）中或在大乳液中，抗体和免疫缀合物可包埋于例如通过凝聚技术或界面聚合制备的 纳米颗粒（分别例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚_(甲基甲酰基）微囊）中。
[0354] 本文描述的CLL-I抗体可单独或与细胞毒性试剂组合杀伤表达CLL-I的细胞。在 一些实施方案中，治疗的方法包括向个体给予有效量的治疗性CLL-I抗体或CLL-I抗体缀 合物，例如与治疗试剂连接的CLL-I抗体。在一些实施方案中，所述个体已被诊断出患有癌 症，例如AML。在一些实施方案中，所述个体正在接受或已经接受了癌症治疗，例如手术、放 疗或化疗。在一些实施方案中，所述个体已被诊断出患有癌症，但是癌症正在减轻。
[0355] 在一些实施方案中，所述方法还包括监视个体的癌症进展。在一些实施方案中，基 于个体的治疗进展来确定每次给予的CLL-I抗体或CLL-I抗体缀合物的剂量，例如，如果个 体对治疗没有足够的响应，则给予更高的化疗剂量。
[0356] 在一些实施方案中，本发明可包含抗体或抗体靶向的组合物以及生理学（即，药 学）可接受的载体。术语"载体"是指用作诊断试剂或治疗试剂的稀释剂或载体的通常为 惰性的物质。该术语还涵盖赋予组合物粘性性质的通常为惰性的物质。生理学可接受的 载体可为液体，例如生理盐水、磷酸盐缓冲剂、标准的缓冲盐水（135mM至150mM NaCl)、水、 缓冲的水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸、糖蛋白，以提供增强的稳定性（例如，白蛋白、脂蛋白、 球蛋白等）等。因为生理学可接受的载体部分地通过所给予的特定组合物以及通过用于 给予组合物的特定方法来确定，所以存在大量适于本发明的药物组合物的制剂（参见例如 Remington's Pharmaceutical Sciences,第 17 版，1989)〇
[0357] 本发明的组合物可通过常规方法、公知的消毒技术消毒，或可在无菌条件下生产。 可包装水溶液以供使用，或在无菌条件下过滤并冻干，在给药前先将冻干的制备物与无菌 水溶液组合。所述组合物可按需要包含药学可接受的辅料物质以接近生理学条件，例如PH 调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂等，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山 梨酸单月桂酸酯以及三乙醇胺油酸酯。还可包含糖以用于稳定组合物，例如用于冻干的抗 体组合物的稳定剂。
[0358] 剂型可制备用于黏膜（例如，鼻的、舌下、阴道、口腔或直肠）、肠胃外（例如，皮 下、静脉内、肌内或动脉内注射，大丸剂或输注）、经口或透皮给予至患者。剂型的实例包括 但不限于：分散剂；栓剂；软膏；糊剂（膏剂）；贴剂；粉剂；敷料；霜剂；膏剂；溶液剂；贴片 (patch);气溶胶（例如鼻用喷雾剂或吸入剂）；凝胶剂；适于经口使用或黏膜给予至患者 的液体剂型，包括混悬剂（例如，水性混悬剂或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水乳 剂）、溶液剂和酏剂；适于肠胃外给药至患者的液体剂型；以及可重构以提供适于肠胃外给 药至患者的无菌固体（例如，晶形固体或非晶形固体）。
[0359] 可注射（例如静脉内）组合物可包含悬浮于可接受载体（例如水性载体）中的 抗体或抗体靶向的组合物的溶液。可使用多种水性载体的任意一种，例如水、经缓冲的水、 0.4%盐水、0.9%等渗盐水、0.3%甘氨酸、5%葡萄糖等，并且可包含用于增强的稳定性的 糖蛋白，例如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常而目，将使用标准缓冲的盐水（135mM至150mM NaCl)。所述组合物可包含药学可接受的辅料物质以接近生理学条件，例如pH调节剂和缓 冲剂、毒性调节剂、润湿剂，例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨酸单月桂酸 酯以及三乙醇胺油酸酯等。在一些实施方案中，所述抗体靶向的组合物可配制于用于静脉 内给药的试剂盒中。
[0360] 适于肠胃外给药的制剂，例如通过关节内（在关节中）、静脉内、肌内、瘤内、皮内、 腹膜内和皮下途径给药的制剂，包括可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受 者的血液等渗的溶质的水性和非水性的等渗无菌注射溶液，以及可包含悬浮剂、增溶剂、增 稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性的无菌混悬剂。
[0361] 药物制备物可以单位剂型形式来包装或制备。在这样的形式中，例如根据治疗试 剂的剂量或抗体浓度，将制备物再分成包含合适量的有效组分的单位剂量。所述单位剂型 可为包装的制备物，所述包装物包含处于单位剂量或多剂量密封容器（例如安瓿和小瓶） 中的不连续量的制备物。所述组合物还可按需要包含其他相容的治疗试剂。
[0362] 可通过使用任意合适的途径注射或输注来给予抗体（或抗体靶向的组合物），包 括但不限于静脉内、皮下、肌内或腹膜内途径。给予药物组合物的实例包括将抗体以IOmg/ ml储存于4°C的注射用无菌等渗的水性盐水溶液中，并在给予至患者之前将其稀释于 100mL或200ml注射用的0. 9%氯化钠中。通过经1小时过程的静脉内输注来给予0. 2mg/ kg至10mg/kg剂量的抗体。在其他实施方案中，通过经15分钟至2小时时段的静脉内输注 来给予抗体。在其他实施方案中，给药方案是经皮下大丸剂注射。
[0363] 选择抗体剂量以为患者提供有效治疗，并且抗体剂量范围为小于0. lmg/kg体重 至约25mg/kg体重，或Img至2g每名患者。在一些情况下，所述剂量范围为lmg/kg至IOOmg/ kg，或约50mg/患者至8000mg/患者。可以合适的频率重复该剂量，所述频率范围根据抗体 的药代动力学（例如，抗体在循环系统中的半衰期）和药效动力学响应（例如，抗体治疗效 果的持续时间），可为每天一次至每三个月一次。在一些实施方案中，体内半衰期为约7天 至约25天，并且每周一次至每三个月一次重复抗体给药。
[0364] 给药可为周期性的。根据给药途径，可以例如每1、3、5、7、10、14、21或28天或更 长时间一次（例如，每2、3、4或6个月一次）来给予剂量。在一些情况下，给药更频繁，例 如每天2次或3次。如本领域技术人员认可的，可监视患者以根据治疗进展和任何不良副 作用来调节给药剂量和频率。
[0365] 因此，在一些实施方案中，根据患者的进展来进行附加给药，例如在各次给药之间 监视患者。例如，在第一次给药或第一轮给药后，可监视患者的肿瘤生长速率、复发（例如， 在术后患者的情况下）或一般疾病相关症状，例如虚弱、疼痛、恶心等。
[0366] 对于癌症的治疗，可以约0. 001mg/kg至约1000mg/kg每天的初始剂量给予抗体 或抗体靶向的组合物（例如，包含治疗试剂和/或诊断试剂），并随着时间调整。可使用约 0· Olmg/kg 至约 500mg/kg，或约 0· lmg/kg 至约 200mg/kg，或约 lmg/kg 至约 100mg/kg，约 5mg/kg至约10mg/kg，或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。本文描述的体内异种移 植结果指示，5mg至20mg抗体/kg体重的剂量对大幅降低肿瘤生长是有效的。
[0367] 剂量根据患者的需求、所治疗病况的严重程度和所使用的靶向组合物而不等。例 如，可考虑具体患者中诊断的癌症类型和阶段来根据经验确定剂量。在本发明的上下文中， 给予至患者的剂量应足以在患者中随时间而引起有益的治疗响应。如有经验的医生认可 的，剂量大小还根据将具体靶向组合物在具体患者中给药时所伴随的任何不良副作用的存 在、性质和程度来确定。
[0368] 应理解，本文中所描述的实例和实施方案仅用于举例说明的目的，并且由此启发 的多种改造和变化将提供给本领域技术人员，并且将包含于本申请的精神和范围以及所附 权利要求的范围之内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本 文中，用于所有目的。
[0369] VII.实施例
[0370] A.实施例1 :CLL_1抗体序列和结构的表征
[0371] 使用人CLL-I在小鼠中生成了抗体。选择对CLL-I具有特异性的抗体，并将其克 隆到杂交瘤中用于稳定产生单克隆抗体。克隆一些对CLL-I具有特异性的抗体，并表征其 序列和抗体结构。这些数据在下表1至3中示出。在序列表中示出了重链和轻链可变区序 列。
[0372] 表1抗体结构
[0373]
【主权项】
1. 分离的抗体，其特异性结合人C型凝集素样分子I (CLL-I)的胞外结构域，其中所述 抗体结合由人CLL-I的C-凝集素结构域组成的多肽的Kd为其结合由人CLL-I的C-凝集 素结构域和茎结构域组成的多肽的Kd的至少5倍。
2. 如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体以1000 pM或更小的Kd结合人CLL-I 或食蟹猴CLL-I。
3. 如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体结合来自患有急性骨髓性白血病 (AML)个体的AML细胞样品中至少50 %的细胞。
4. 如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体结合静止期的表达CLL-I的细胞。
5. 如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体选自： 包含重链互补决定区（CDR)SEQ ID NO: 51、59和67的和轻链CDR SEQ ID NO: 75、83和 91的抗体； 包含重链CDR SEQ ID NO:52、60和68和轻链CDR SEQ ID NO:76、84和92的抗体；以 及 包含重链 CDR SEQ ID N0:53、61 和 69 和轻链 CDR SEQ ID N0:77、85 和 93 的抗体。
6. 如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体为人源化的。
7. 如权利要求1所述的分离的抗体，其中所述抗体是Fv抗体片段。
8. 如权利要求1所述的分离的抗体，其与治疗性化合物缀合。
9. 如权利要求1所述的分离的抗体，其与可检测的部分缀合。
10. 确定细胞是否表达C型凝集素样分子I (CLL-I)的方法，其包括： 将权利要求9所述的抗体与所述细胞接触；以及 检测所述抗体与所述细胞的结合，其中所述抗体与所述细胞的结合指示所述细胞表达 CLL-I ;以及 确定所述细胞是否表达CLL-I。
11. 如权利要求10所述的方法，其中所述细胞处于来自个体的包含造血细胞的生物样 品中。
12. 如权利要求10所述的方法，其还包括确定所述细胞是否表达⑶34或⑶38。
13. 抑制表达C型凝集素样分子I (CLL-I)的细胞的存活的方法，其包括： 将权利要求1所述的抗体与所述细胞接触， 从而抑制所述细胞的存活。
14. 如权利要求13所述的方法，其中所述接触包括向个体给予所述抗体，并且所述细 胞处于所述个体中。
15. 如权利要求13所述的方法，其中所述个体已经被诊断出患有骨髓增生性疾病。
16. 如权利要求13所述的方法，其中所述骨髓增生性疾病选自：急性骨髓性白血病 (AML)、慢性骨髓性白血病（CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病（CMML)、骨髓增生异常综合 征（MDS)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维变性。
17. 包含权利要求1所述的分离的抗体和药学可接受的载体的药物组合物。
18. 治疗个体骨髓增生性疾病的方法，其包括： 向所述个体给予权利要求17所述的药物组合物， 从而治疗所述个体的AML。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述抗体与治疗性化合物缀合。
20. 如权利要求18所述的方法，其中所述个体已经被诊断出患有骨髓增生性疾病或已 经经历过针对骨髓增生性疾病的治疗。
21. 如权利要求18所述的方法，其中所述骨髓增生性疾病选自：急性骨髓性白血病 (AML)、慢性骨髓性白血病（CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病（CMML)、骨髓增生异常综合 征（MDS)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维变性。
22. 与人C型凝集素样分子I (CLL-I)结合的分离的抗体，所述抗体选自： 包含重链互补决定区（CDR)SEQ ID NO: 51、59和67和轻链CDR SEQ ID NO: 75、83和91 的抗体； 包含重链CDR SEQ ID NO:52、60和68和轻链CDR SEQ ID NO:76、84和92的抗体；以 及 包含重链 CDR SEQ ID N0:53、61 和 69 和轻链 CDR SEQ ID N0:77、85 和 93 的抗体。
【专利摘要】本文提供了CLL-1特异性的抗体(“CLL-1抗体”)，其结合来自AML患者样品的、高百分比的表达CLL-1的原代细胞。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以10nM或更小的Kd特异性结合人CLL-1的胞外结构域。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体以100ηΜ、10ηΜ、1nM、100pM或更小的kd结合食蟹猴CLL-1。例如，在一些实施方案中，食蟹猴CLL-1和人CLL-1竞争结合所述CLL-1抗体。本领域技术人员将理解，较高亲和力的结合表示为较低的kd(较低浓度的结合所必需的抗体靶标)。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体是双特异性抗体的一部分。在一些实施方案中，所述CLL-1抗体与细胞毒素连接。
【IPC分类】C07K16-28
【公开号】CN104736562
【申请号】CN201380035351
【发明人】蒋英萍, 霍尔戈尔·卡尔苏恩基, 罗布·特莱斯勒
【申请人】塞勒兰特治疗公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年5月6日
【公告号】CA2872513A1, EP2847222A1, US20130295118, WO2013169625A1