用于从乳纯化生长因子的改进方法及其产品的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明一般涉及用于从乳纯化目标蛋白质的方法。
[0002]发明背景
[0003]多年来来自家畜的乳已被用作蛋白质和其他用于食品和制药行业的产品的来源，并且已知各种技术用于分离这些产品。乳是主要由脂肪、乳糖和水中的蛋白质组成的胶体悬浮液。在反刍动物和实验室动物中，乳包含平均30至140克蛋白质/升，或按重量计约4-17%，这取决于该物种。这些蛋白质的本体(bulk)是酪蛋白，它们与钙及磷酸盐复合成被称为胶束的超分子结构。乳蛋白的其他主要种类是主要由乳球蛋白和α-乳清蛋白组成的乳清蛋白，而且还包括乳铁蛋白、免疫球蛋白和血清白蛋白。
[0004]通常通过包括膜过滤技术以及离子交换吸附方法在内的方法的组合分离乳蛋白。
[0005]乳铁蛋白是被天然发现于生物液体中的80kD的铁结合糖蛋白，该生物液体如唾液、胆汁、支气管粘液、胃肠液、宫颈-阴道粘液、精液和乳。乳铁蛋白的最丰富的来源是哺乳动物乳和初乳。乳铁蛋白在脱脂牛乳中的浓度通常较低，典型地在80-200mg/ml之间，这取决于各种因素，其包括脱脂乳的巴氏杀菌和其他预处理经历。在存在于乳中的酪蛋白沉淀后，牛乳清中的乳铁蛋白的浓度典型地为10-100mg/ml，这取决于该乳清的物理和化学预处理。
[0006]生长因子以不同程度存在于乳中，特别是在含有乳铁蛋白的级分中。牛乳含有诸如RNA酶5的RNA酶和包括IGF-1、IGF-2、PDGF, FGF-碱性、EGF、FGF-酸性和VEGF在内的生长因子。这样的生长因子各自具有30kD或更低的分子量(RNA酶5具有17kD的分子量)。在本领域中，采用离子交换色谱法(例如，如在国际专利申请PCT/AU91/00303和PCT/AU2007/001719中描述的)制备富集生长因子和RNA酶的乳级分。
[0007]富集RNA酶5和生长因子的乳级分具有多重假定生物学作用，包括促进肌肉生长、神经保护，促进骨生成和治疗神经系统疾病或病症、脊髓损伤或疾病、骨骼疾病或病症、涉及葡萄糖动态平衡的疾病、伤口愈合，或者用于提供神经系统功能的支持和控制代谢性疾病。
[0008]本发明的优选实施方案的目的是提供用于从乳、特别是牛乳纯化生长因子和RNA酶的改进方法，以提高纯度。
[0009]本说明书中引用的所有参考文献(包括任何专利或专利申请)通过引用并入本文。将要清楚地理解，虽然在本文中引述了许多现有技术出版物，此引用并非承认这些文献中的任一个构成本领域公知常识的一部分。
[0010]概述
[0011]第一方面提供了用于从乳或乳铁蛋白纯化RNA酶和生长因子的方法，该方法包括对所述乳或乳铁蛋白进行过滤以将所述乳或乳铁蛋白分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的渗透物级分，其中，在过滤之前和/或过滤期间对所述乳进行盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入渗透物中。
[0012]当使用具有30kD或50kD的截断值的膜过滤从乳纯化乳铁蛋白时，本发明人发现乳铁蛋白残余物被生长因子和RNA酶污染。由于这些生长因子和RNA酶具有小于30kD的分子量，因此它们应已通过膜并进入渗透物中，而且不应作为残余的乳铁蛋白级分中的杂质存在。因此，在残余物中发现生长因子和RNA酶是令人惊讶的。本发明人发现，在过滤之前将大量的盐加入至乳从残余物中除去了生长因子和RNA酶并进一步浓缩了渗透物中的生长因子和RNA酶。
[0013]不希望受理论的束缚，本发明人提出在正常条件下，乳中的RNA酶和生长因子聚集或以其他方式形成比它们各自的分子量都大的质量。提出了盐处理导致RNA酶和生长因子解聚或解离。
[0014]在可选形式中，第一方面的方法提供了用于从乳或乳铁蛋白纯化RNA酶和生长因子的方法，所述方法包括对乳或乳铁蛋白进行过滤以将所述乳或乳铁蛋白分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的渗透物级分，其中，在过滤之前和/或过滤期间对所述乳或乳铁蛋白进行能够解聚或解离任何质量的RNA酶或生长因子的盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入渗透物中。
[0015]不希望受理论的束缚，本发明人可选地提出了在低离子强度的条件下，蛋白质聚集体可能变得与膜相关联，从而形成表观孔尺寸小于该膜的表观孔尺寸的层，该层防止了乳中的RNA酶和生长因子穿过该膜。提出了盐处理防止蛋白质层的形成或去除，允许任何RNA酶和生长因子通过该膜进入该渗透物中。
[0016]因此，在可选形式中，第一方面的方法提供了一种用于从乳或乳铁蛋白纯化RNA酶和生长因子的方法，该方法包括对所述乳或乳铁蛋白进行膜过滤以将乳或乳铁蛋白分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的渗透物级分，其中，在过滤之前和/或过滤期间对乳或乳铁蛋白进行能够使任何RNA酶或生长因子与膜分离的盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入渗透物中。
[0017]第二方面提供了由第一方面的方法获得的RNA酶和生长因子。
[0018]在一个实施方案中，对第二方面的RNA酶和生长因子进行进一步纯化。
[0019]第三方面提供了第二方面的RNA酶和生长因子的用途，该用途用于治疗由病毒、细菌或真菌及其毒素引起的疾病，用于靶向引起人体粘膜表面的感染的病原体，用于促进血管生成，用于治疗特征为上升的肌抑素的病症，用于治疗其中卵泡抑素和血管生成素之间的相互作用可用于改善组织功能的病症，用于促进肌肉生长，用于改善肌肉从损伤或使用中的恢复，用于改善肌肉力量，用于改善运动耐受性，用于增加肌肉比例，用于减少脂肪，用于降低个体的脂肪对肌肉的比例，用于治疗神经系统疾病或病症，用于治疗脊髓损伤或疾病，用于治疗骨骼疾病或病症，用于治疗涉及葡萄糖动态平衡的疾病，用于伤口愈合，或用于提供神经保护、神经系统功能的支持、控制代谢性疾病和/或增加个体骨密度，用于治疗炎症，用于治疗癌症，用于治疗癌症恶病质，以及用于治疗牙周炎和本领域技术人员所知的生长因子和RNA酶的所有其他用途。
[0020]在可选形式中，第三方面提供了由第一方面的方法获得的RNA酶和生长因子，其用于如第三方面中提出的用途或用于制造用于如第三方面中提出的用途的药物。
【附图说明】
[0021]图1示出了在氯化钠(10mS)的存在下阳离子乳蛋白的混合物穿过50kDa的膜的超滤选择性地允许RNA酶和其他生长因子的传输。
[0022]图2示出了在氯化钠(20mS或40mS)的存在下阳离子乳蛋白的混合物穿过50kDa的膜的超滤选择性地允许在不存在氯化钠(OmS)下不会渗透的RNA酶和其他生长因子的传输。
[0023]图3示出了生长因子(如RNA酶)的增加的传输。生长因子传输在OmS和20mS之间迅速增加。
[0024]详述
[0025]本发明提供了用于从乳或乳铁蛋白纯化RNA酶和生长因子或针对这样的产物富集乳或乳铁蛋白的改进方法。
[0026]本发明人已经认识到需要允许以有效的方式制备富集的RNA酶和生长因子级分的方法。
[0027]本文中使用的与RNA酶或生长因子有关的术语“纯化的”或“富集的”是指存在于该渗透物中的RNA酶/生长因子:总蛋白质的比例相对于存在于过滤步骤之前的乳或乳铁蛋白中的该比例有所增加。对于要考虑被富集或被纯化的级分而言，它应具有比过滤步骤之前的乳或乳铁蛋白中高至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、25、27、28 或 30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、98 或 99% w/w 的 RNA 酶 / 生长因子含量。
[0028]第一方面的方法寻求增加渗透物中的RNA酶和生长因子的纯度。
[0029]如本文所用，术语“级分”是指乳的部分被纯化的部分，特别是含有乳铁蛋白的级分。
[0030]术语“有效的”的使用旨在表示当相较于目前使用的用于富集蛋白质的方法时经济且快速的方法。
[0031]本文中提及的乳包括全脂乳、脱脂乳、酪乳、乳清(如酸或乳酪或/凝乳清)或乳清衍