增加是通过选择性去除生长因子(用作实例的RNA酶，图3)实现的。
[0094]实施例4:超滤膜
[0095]MWCO的可行性:
[0096]-30kDa的膜成功地截留了收获的乳铁蛋白(通过该膜的蛋白质传输是存在的蛋白质的0.6% )，其通过允许重要的污染物(特别是RNA酶)通过该膜来提高纯度。
[0097]-氯化钠(58Da)未被30kDa的膜截留，而乳铁蛋白(80kDa)被该膜截留，为此，从柱上洗脱的低浓度(0.1%的蛋白质)的乳铁蛋白可被浓缩至3%的蛋白质，而在盐浓度或蛋白质损失中无相应的增加。
[0098]UF5
[0099]类型:螺旋缠绕聚醚砜(PES) MWCO:5kDa
[0100]品牌:Synder型号:MT2B-6338
[0101]被称为UF5的超滤设备用于:
[0102]1.浓缩从阳离子交换柱洗脱的非乳铁蛋白的蛋白质，以及
[0103]2.将2.5%的盐回收至2.5%的盐罐以重新用在色谱法中。
[0104]在更广泛的乳铁蛋白制造方法内的方法可行性:
[0105]-氯化钠(2，OOOkg/批次)是乳铁蛋白制造方法中的主要成本($1，200元/批次)，而回收氯化钠的能力显著地降低了生产成本。
[0106]-通过回收氯化钠降低了对环境的损害。在Leongatha的三级处理以除去有机固体之后，含氯化钠的流出物通过海洋排水口处置，并且必须采取所有步骤以减少产生的废物量。盐回收过程减少了所需盐量的80%，这意味着被释放到环境中的氯化钠的量减少了8，OOOkg/批次(三分之一是因UF5导致)。
[0107]膜类型的可行性:
[0108]-螺旋膜是获得大面积的膜的相对便宜的方式，其在具有较小足迹的设备中实现了高通量。
[0109]-PES是迅速且完全地浸湿的固有亲水膜，导致具有优异的流速和高吞吐量的快速过滤。PES膜还是极其低的蛋白质结合，这将靶向蛋白质结合的可能性降至最低，这意味着高产率、稳定的跨膜通量和一致的表观膜孔隙率。
[0110]MWCO的可行性:
[0111]_5kDa的膜截留了非乳铁蛋白杂质，这防止了它们返回至色谱法以及在后续的乳铁蛋白洗脱期间污染该乳铁蛋白。因为蛋白质混合物包含多种较小的蛋白质，其中的许多蛋白质为生长因子，所以需要较小的膜。
[0112]-氯化钠(58Da)未被5kDa的膜截留，而乳过氧化物酶(80kDa)、免疫球蛋白(150至420kDa)和生长因子(5至17kDa)被该膜截留，为此，从柱上洗脱的低浓度(0.1%的蛋白质)的蛋白质可被浓缩至3%的蛋白质，而在盐浓度或蛋白质损失中无相应的增加。
[0113]UF7
[0114]类型:螺旋缠绕聚偏氟乙烯(PVDF) MWCO:50kDa
[0115]品牌:Synder型号:BN4B-6338
[0116]被称为UF7的超滤设备用于:
[0117]1.通过减少非乳铁蛋白的蛋白质来提高乳铁蛋白纯度；以及
[0118]2.通过去除氯化钠和残余的乳糖将蛋白质增加至> 95%的固体。
[0119]在更广泛的乳铁蛋白制造方法内的方法可行性:
[0120]-旨在用于制造铁蛋白OB的乳铁蛋白具有高于标准乳铁蛋白的乳铁蛋白纯度。较高的纯度通过用50kDa的膜取代历史上曾经使用的5kDa的膜获得。
[0121]膜类型的可行性:
[0122]-螺旋膜是获得大面积的膜的相对便宜的方式，其在具有较小足迹的设备中实现了高通量和相对短的处理时间。
[0123]-亲水性聚偏氟乙烯(PVDF)膜具有高的跨膜通量和对蛋白质的低附着力。为此，因为很少有蛋白质污染膜孔，所以在该方法期间保持着高通量以及高产率。
[0124]MWCO的可行性:
[0125]-对于较小的膜(历史上曾经的5kDa的膜)而言，50kDa的膜是优选使用的，因为它们可以改善非乳铁蛋白的蛋白质(RNA酶、生长因子)的传输，同时截留乳铁蛋白。增加的非乳铁蛋白的蛋白质的传输导致较高的乳铁蛋白纯度(纯度平均增加1.8%蛋白质，P < 0.001)。进一步的细节可以从 ‘Increasing Lactoferrin Purity byDiafiltrat1n with Salt Solut1n in an Ultrafiltrat1n Plant Fitted with 50kDaMembranes’ (JR0010)中获得。
[0126]-氯化钠(58Da)未被50kDa的膜截留，而乳铁蛋白(80kDa)被该膜截留，为此，从柱上洗脱的低浓度(3%的蛋白质)的乳铁蛋白可被浓缩至>20%的蛋白质，在盐浓度或蛋白质损失中无相应的增加。
[0127]-通过去除水来增加总固体，且因此使冷冻-干燥机的固体吞吐量最大化。
【主权项】
1.一种用于从乳或乳铁蛋白纯化RNA酶和生长因子的方法，所述方法包括对所述乳或乳铁蛋白进行过滤以将所述乳或乳铁蛋白分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的渗透物级分，其中，在过滤之前和/或过滤期间对所述乳或乳铁蛋白进行盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入所述渗透物中。
2.一种用于从乳或乳铁蛋白纯化RNA酶和生长因子的方法，所述方法包括对所述乳或乳铁蛋白进行过滤以将所述乳或乳铁蛋白分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的渗透物级分，其中，在过滤之前和/或过滤期间对所述乳或乳铁蛋白进行能够解聚或解离任何质量的RNA酶或生长因子的盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入所述渗透物中。
3.一种用于从乳或乳铁蛋白纯化RNA酶和生长因子的方法，所述方法包括对所述乳或乳铁蛋白进行膜过滤以将所述乳或乳铁蛋白分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的渗透物级分，其中，在过滤之前和/或过滤期间对所述乳或乳铁蛋白进行能够使任何RNA酶或生长因子与所述膜分离的盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入所述渗透物中。
4.由权利要求1至3中任一项的方法获得的RNA酶和生长因子。
5.权利要求4的RNA酶和生长因子的用途，所述用途用于治疗由病毒、细菌或真菌及其毒素引起的疾病，用于靶向引起人体粘膜表面的感染的病原体，用于促进血管生成，用于治疗特征为上升的肌抑素的病症，用于治疗其中卵泡抑素和血管生成素之间的相互作用可用于改善组织功能的病症，用于促进肌肉生长，用于改善肌肉从损伤或使用中的恢复，用于改善肌肉力量，用于改善运动耐受性，用于增加肌肉比例，用于减少脂肪，用于降低个体的脂肪对肌肉的比例，用于治疗神经系统疾病或病症，用于治疗脊髓损伤或疾病，用于治疗骨骼疾病或病症，用于治疗涉及葡萄糖动态平衡的疾病，用于伤口愈合，或用于提供神经保护、神经系统功能的支持、控制代谢性疾病和/或增加个体骨密度，用于治疗炎症，用于治疗癌症，用于治疗癌症恶病质，以及用于治疗牙周炎和用于生长因子和RNA酶的所有其他用途。
【专利摘要】本发明提供了用于从乳或乳铁蛋白纯化RNA酶和生长因子的方法，所述方法包括对所述乳或乳铁蛋白进行过滤以将所述乳或乳铁蛋白分离成含有乳铁蛋白的残余物级分和含有生长因子和/或RNA酶的渗透物级分，其中在过滤之前和/或过滤期间对所述乳或乳铁蛋白进行盐处理，使得生长因子和/或RNA酶流入渗透物中。本发明还提供了由本发明的方法获得的RNA酶和生长因子。
【IPC分类】C07K14-475, A61K38-46, A61K38-40, C07K1-34, C07K14-79, A61K38-18, C12N9-22
【公开号】CN104736560
【申请号】CN201380055327
【发明人】A·布朗
【申请人】墨累古尔本合作有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年10月8日
【公告号】CA2887003A1, EP2904007A1, US20150232823, WO2014056026A1