结核分枝杆菌疫苗的制作方法
【专利说明】结核分枝杆菌疫苗 发明领域
[0001] 本发明披露了基于来源于结核分枝杆菌的Esx-I相关多肽和esx家族多肽的新免 疫原性组合物。
[0002] 一般背景
[0003] 对结核分枝杆菌的免疫性的特征在于一些基本特征；特异性致敏的T淋巴细胞介 导保护，并且最重要的介体分子似乎是干扰素 γ (IFN-γ)。
[0004] 结核分枝杆菌保持以及分泌数种可能相关的蛋白质以用于产生一种新的TB疫 苗。在1998年，科尔（Cole)等人公开结核分枝杆菌的全基因组序列并且预测存在约4000 个开放阅读框、然而重要地，这种序列信息无法用以预测DNA是否被翻译并且在体内表达 为蛋白质。该基因组序列已经广泛地用以设计DNA阵列以用于RNA表达分析和蛋白质组研 宄以鉴别表达的蛋白质。即使具有大量的表达数据并且计算机模拟预测工具显著改进，仍 不可能肯定地预测既定序列将编码免疫原性分子。确定在结核分枝杆菌感染期间或之后分 子是否被免疫系统识别的唯一方式是产生既定分子并且在一个如在此所描述的适当分析 中测试它。
[0005] 当前在临床试验中存在数种新的TB疫苗。然而，它们主要是基于在感染的早期表 达的有限数目的抗原的经典预防性疫苗。作为表达动态的直接后果，呈递给T细胞的表位 模式随时间推移根本上变化-暗示新的疫苗应如何设计。例如对于瞬时表达的早期抗原 Ag85B，两个独立T细胞转移研宄已经显示，在感染之后3-4周，Ag85B不再呈递给T细胞并 且因此在感染的这个或后来的时间点不存在细胞因子、趋化因子等的Ag85B特异性产生 2' 3。因此，对于与宿主建立长期共存性的慢性疾病来说，接种疫苗并且诱导对仅在感染的短 暂时间段期间表达的蛋白质中的表位具有特异性的记忆T细胞的价值有限。
[0006] 因此对于疫苗开发，至关重要的是鉴别在感染的后期高度表达的抗原并且在这些 抗原之中选择免疫原性的并且可以促进保护的抗原，并且将这种特殊子集的蛋白质包括于 TB疫苗中。通过这样做，不仅可能提高疫苗效价和表位覆盖，而且靶向潜伏感染。
[0007] 分枝杆菌分泌系统造成蛋白质输出到细胞外环境中。结核分枝杆菌具有数种不同 类型的分泌系统，其中ESX分泌系统（VII型）对于本发明是相关的。结核分枝杆菌具有这 些系统中的五个，称为ESX-I到ESX-5。结核分枝杆菌的6-kDa早期分泌抗原标靶（ESAT-6) 和ΙΟ-kDa培养滤液抗原（CFP-10)是由ESAT-6分泌系统I(ESX-I)分泌的蛋白质，并且属 于最免疫显性的结核分枝杆菌（MTB)抗原之中。这些属性使其对于结核（TB)疫苗开发是 重要的。基于这种了解，我们测试其他ESX-I相关的蛋白质作为可能的TB疫苗抗原。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明涉及通过使用一种融合蛋白或抗原混合物来预防和治疗由结核复合体的 菌种（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、館足动物 分枝杆菌、曼奇分枝杆菌）造成的感染，该融合蛋白或抗原混合物包含选自ESX-I相关多肽 和esx家族多肽（可能包括潜伏多肽）的结核分枝杆菌抗原。融合蛋白或抗原混合物优选 地与佐剂和/或免疫调节剂一起用于疫苗中。
[0010] 发明的详细披露
[0011] 本发明披露一种融合蛋白或抗原混合物，它包含选自以下的氨基酸序列：
[0012] (a)SEQ ID NO. 1(ESAT6)、SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4 (Rv3865)、SEQ ID NO 5 (Rv3849)以及 SEQ ID NO 6 (Rv3872)，或
[0013] (b)SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5 (Rv3849)以及 SEQ ID NO 6 (Rv3872)，或
[0014] (c)SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)以及 SEQ ID NO 7(Rv3616)，或
[0015] (d)SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)、SEQ ID N07(Rv3616)以及 SEQ ID NO 8(Rv3881c)， 或
[0016] (e)SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)以及 SEQ ID NO 8(Rv3881c)，或
[0017] (f)SEQ ID NO 9(Rv3891c)、SEQ ID NO 10(Rv3890)、SEQ ID NO ll(Rv0287)、SEQ ID NO 12(Rv0288)、SEQ ID NO 13(Rv3620c)以及 SEQ ID NO 14(Rv3619)，或
[0018] (g)SEQ ID NO ll(Rv0287)、SEQ ID NO 12(Rv0288)、SEQ ID N013(Rv3620c)、SEQ ID NO 14(Rv3619)、N0 7(Rv3616c)以及 SEQ ID NO 3(Rv3615c)，或
[0019] (h)SEQ ID NO ll(Rv0287)、SEQ ID NO 12(Rv0288)、SEQ ID N013(Rv3620c)、SEQ ID NO 14(Rv3619)、N0 7(Rv3616c)、SEQ ID N03(Rv3615c)以及 SEQ ID 9(Rv3881c)，或
[0020] (i)SEQ ID NO 1(ESAT6)、SEQ ID NO 15(Ag85B)以及 SEQ ID N016(Rvl284)，或
[0021] (j)与（a)_⑴中的序列中的任一者具有至少80%序列一致性并且同时免疫原性 的氨基酸序列类似物。
[0022] 根据本发明的融合蛋白中的半胱氨酸优选地已经被另一种氨基酸置换以避免硫 桥形成和蛋白质聚集。一种优选的置换氨基酸是丝氨酸。
[0023] 根据本发明的融合蛋白的融合伴侣优选地与连接子分子连接以允许蛋白质折叠 和二聚体形成。
[0024] 优选的根据本发明的融合蛋白提出为SEQ ID NO 18 (H64)、SEQ ID NO 19 (H68)、 SEQ ID NO 20(H69)、SEQ ID NO 21(H70)、SEQ ID N022(H71)、SEQ ID NO 23(H65)、SEQ ID NO 24(H72)、SEQ ID NO 25(H73)或 SEQ ID NO 26(H67)。
[0025] 本发明的另一个实施例是使用一种根据本发明的抗原混合物，例如以上所提到的 氨基酸序列（a)-(i)(包含 SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 以及 16)， 而不将多肽融合在一起。
[0026] 一种优选的抗原混合物包含SEQ ID NO 16和Hl (SEQ ID NO 17)，其中Hl是SEQ ID NO 1与SEQ ID NO 15之间的一种融合体。
[0027] 在再另一个实施例中，本发明披露一种免疫原性组合物或药物组合物，包含如在 此所定义的优选地呈一种疫苗形式的一种融合蛋白或抗原混合物。
[0028] 在另一个实施例中，本发明披露一种用于使一种动物、包括一名人类针对由毒性 分枝杆菌、例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、坎纳分枝杆 菌、鳍足动物分枝杆菌或曼奇分枝杆菌造成的结核免疫的方法，包括向该动物给予如在此 所定义的多肽、根据本发明的免疫原性组合物或根据本发明的疫苗。
[0029] 根据本发明的疫苗、免疫原性组合物以及药物组合物可以预防上用于未感染一种 毒性分枝杆菌的一个受试者或治疗上用于已经感染一种毒性分枝杆菌的一个受试者。
[0030] 定义
[0031] 多肽
[0032] 本发明中的词语"多肽"应具有其常用含义。它是具有任何长度的一条氨基酸链， 包括全长蛋白质、寡肽、短肽以及其片段，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
[0033] 多肽可以通过糖基化、通过脂化（例如通过用如莫厄特（Mowat)等人1991所描述 的棕榈酰氧基琥珀酰亚胺或用如卢斯蒂格（Lustig)等人1976所描述的十二酰氯进行化学 脂化）、通过包含辅基或通过含有额外氨基酸（如例如一种纯化标签（例如his标签）或一 种信号肽）而被化学修饰。纯化标签被用以获得高度纯的蛋白质制剂，并且例如His标签 包含甲硫氨酸作为第一氨基酸，接着在使用N末端时是6-8个组氨酸，并且在使用C末端时 是6-8个组氨酸接着是一个终止密码子。当使用N末端时，编码多肽融合体的基因中的甲 硫氨酸起始密码子可以缺失以避免假翻译起始位点。在基因含有通常对应地编码缬氨酸和 白氨酸的替代性起始密码子GUG或UUG之一时同样如此，但作为一种起始密码子，它们翻译 为甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。
[0034] 每种多肽由一种特异性核酸序列编码。应理解，此类序列包括其类似物和变异体， 其中此类核酸序列已经通过取代、插入、添加或缺失一种或多种核酸而被修饰。取代优选地 是密码子使用中的沉默取代，这将不会导致氨基酸序列有任何变化，但可以引入以促进蛋 白质的表达。
[0035] 分泌系统
[0036] VII型分泌系统（T7SS)是在细菌分泌系统中的一个最近发现，它首先鉴别于结核 分枝杆菌中。相对应的基因簇被称为ESX(ESAT-6分泌系统）区 4'结核分枝杆菌H37Rv 的基因组含有五个基因簇，它们已经通过基因复制事件而演化并且包括T7SS分泌机构的 组分。这些簇被称为ESAT-6分泌系统（ESX) 1到5。ESX系统已经显示分泌不具有经典信 号肽的蛋白质。此外，由ESX1-5分泌的大多数蛋白质对于分泌遵循成对依赖性 7。
[0037] Esx 家族
[0038] 除了 Rv3017C(eSXR)，编码ESAT-6家族蛋白质的基因被安排在结核分枝杆菌 H37Rv染色体上11个基因座处串联对中并且通常前面是pe-ppe基因对。它们编码约100 个氨基酸长度并且由ESX1-5系统分泌的蛋白质。