42:423(1988);以及 Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879(1988)。
[0292] 用于人源化非人抗体（即使用来自非人抗体的⑶R)的方法也为本领域已知。一 般而言，人源化抗体具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常 常被称为引入（import)残基，其通常取自引入可变结构域。人源化基本上可根据Winter 及其同事的以下方法来进行（参见例如，Jones等，Nature 321:522-525(1986) ;Riechmann 等，Nature 332:323-327 (1988) ;Verhoeyen 等，Science 239:1534-1536(1988)以及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992))，通过将啮齿类 CDR 或 CDR序列替换为相 应的人抗体序列。这样的人源化抗体是嵌合抗体（美国专利第4, 816, 567号），其中来自非 人物种的相应序列的替换显著小于完整的人可变结构域。事实上，人源化抗体通常是这样 的人抗体，其中一些CDR残基以及可能地一些FR残基被来自啮齿类抗体的类似位点的残基 替换。
[0293] 在一些情况下，抗体或抗体片段可与另一个分子缀合，例如聚乙二醇（PEG 化）或血清白蛋白，以提供延长的体内半衰期。抗体片段的PEG化实例在以下文献中 有提供：Knight 等，Platelets 15:409, 2004(阿昔单抗）；Pedley 等，Br. J. Cancer 70:1126, 1994 (抗 CEA 抗体）；Chapman 等，Nature Biotech. 17:780, 1999 ;以及 Humphreys 等，Protein Eng. Des. 20:227,2007)。还可对所述抗体或抗体片段进行标记或与下文描述 的治疗剂缀合。
[0294] B.结合亲和力
[0295] 结合的特异性可根据相比关于抗体与环境中其他物质或整体不相关分子的解离 常数，抗体（或其他靶向部分）对靶标的比较性解离常数（Kd)来定义。一般而言，抗体针 对不相关物质的Kd将为其针对靶标的Kd的至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、 100倍、200倍或更高倍。
[0296] 抗体期望的亲和力--例如，高（pM至低nM)、中（低nM至IOOnM)或低（约IOOnM 或更高）一一可根据其是否被用作诊断剂或治疗剂而存在差异。不受理论的限制，在一个实 例中，具有中亲和力的抗体可比具有高亲和力的抗体更成功地定位肿瘤。因此，具有不同亲 和力的抗体可用于诊断用途和治疗用途。
[0297] 靶向部分通常以小于约1000 nM的Kd结合，例如小于250nM、100nM、50nM、20nM或 更小的nM。在一些实施方案中，亲和试剂的Kd小于15nM、10nM、5nM或InM。在一些实施方 案中，所述 Kd 为 InM 至 100nM、0.1 nM 至 50nM、0.1 nM 至 IOnM 或 InM 至 20nM。离解常数（Kd) 的值可通过公知方法来确定，并且可通过例如在Caceci等，Byte (1984) 9:340-362中公开 的方法来计算甚至复杂混合物的Kd值。
[0298] 抗体或任何靶向试剂对靶标的亲和力可根据本领域已知的方法来确定，例如， 如 Ernst 等，Determination of Equilibrium Dissociation Constants, Therapeutic Monoclonal Antibodies(Wiley 和 Sons ed.，2009)中综述的。
[0299] 可使用定量ELISA和类似的基于阵列的亲和方法。ELISA(酶联免疫吸附信号转导 测定）是基于抗体的方法。在一些情况下，使对目的靶标具有特异性的抗体贴附于基质上， 并使其与疑似包含靶标的样品接触。然后洗涤该表面以去除未结合的物质。靶标结合可以 多种方式来检测，例如，使用具有经标记抗体的第二步骤、直接标记靶标或用在抗原结合后 可检测的标记来标记第一抗体。在一些情况下，使抗原贴附于基质（例如，使用对蛋白质具 有高亲和力的基质，或链霉亲和素-生物素相互作用），并使用经标记的抗体（或其他靶向 部分）对其进行检测。已经开发了原始ELISA法的一些替换方法，并且这些方法是本领域 已知的（其综述参见 Lequin(2005)Clin. Chem. 51:2415-18)。
[0300] KcU Kon和Koff也可通过使用表面等离子共振（SPR)来确定，例如，通过使用 Biacore TlOO 系统来测量。SPR 技术在 Hahnfeld 等，Determination of Kinetic Data Using SPR Biosensors, Molecular Diagnosis of Infectious Diseases (2004)中有综 述。在典型的SPR实验中，将一种相互作用试剂（靶标或靶向试剂）固定于流式细胞仪中 的具有SPR活性的金包被的玻璃片上，并引入包含另一种相互作用试剂的样品，使其流过 表面。当将指定频率的光照射在该表面上时，金的光学反射率的变化指示结合以及结合的 动力学。
[0301] 结合亲和力还可通过将生物素化的相互作用试剂锚定于链霉亲和素（SA)传感器 芯片来确定。然后使另一种相互作用试剂与芯片接触，并对其进行检测，例如Abdessamad 等，（2002)Nuc. Acids Res. 30:e45 中所描述的。
[0302] C.确定 CLL-I 表位
[0303] 可使用用于表位作图的已知技术来对结合CLL-I的抗体的位点进行作图。本领域 技术人员将理解，用于表位作图的方法可根据抗原而不同，例如，当其表达于细胞中时，第 一多肽序列的翻译后修饰，以及不同细胞上或不同环境中抗原结构之间的差异。
[0304] CLL-I是具有约200个胞外氨基酸的跨膜蛋白。胞外结构域被糖基化，并且包含C 凝集素结构域。可通过改变CLL-I的初级序列或糖基化状态，并且比较CLL-I抗体与不同 CLL-I变体的亲和力来确定或部分确定CLL-I抗体的表位。
[0305] 这样的表位作图可在体外进行，例如，通过筛选噬菌体展示文库或合成肽文库，例 如使用珠子或其他固体基质。线性表位通常为约六个氨基酸，但是这可稍微变化。为了模拟 蛋白质中存在的线性表位，可制得序列所对应的合成肽。在一些实施方案中，在N端和/或 C端延伸该序列，以提供处于蛋白质侧翼序列中的额外的氨基酸残基。这可更接近地模拟表 位的初级结构，并且一定程度地模拟表位的二级结构环境。此外，包含但不限于一个或多个 甘氨酸或γ氨基丁酸的残基可附加于任一末端以提供间隔子，从而使其与例如用于免疫 测定的固相的空间相互作用最小化。常常改变间隔子的长度以根据经验确定最佳结构。
[0306] 由于表位的可变性质以及因侧翼序列导致的潜在影响，在一些实施方案中，可使 用通过以一定数量的残基延伸N端或C端而使得长度发生变化的肽。另一种方法利用重复 肽表位，或用介入的间隔子残基改变表位。这些肽的长度一般根据期望的重复单元数而不 等。
[0307] -种用于表位作图的方法是合成例如20个残基长度的重叠肽，其具有覆盖CLL-I 胞外区的初级序列的六个残基。如果使用这样的肽筛选来对表位进行作图，则可改造肽从 而克服与免疫测定中所使用的固相载体的不期望的相互作用。一种方法是用亲水残基替换 肽中的疏水残基，以降低疏水相互作用或使其最小化，并且提高肽的可触及性。类似地，可 用不带电的残基替换带电的肽残基，以消除与固相的离子相互作用。还可通过添加多种结 构的间隔子基团将肽表位置于离固相较远的位置并使位阻最小化，来对肽进行修饰。
[0308] 可合成肽来反映在天然蛋白质上或靶标细胞上的天然蛋白质上存在的翻译后修 饰。修饰包括但不限于在蛋白质的特定位点进行糖基化和磷酸化。
[0309] 另一种用于确定表位的方法是在细胞中表达CLL-I变体，并比较不同变体之间的 CLL-I抗体亲和力。可按肽研宄中所描述的来设计CLL-I变体。此外，可替换糖基化的残基 (例如，天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）以确定表位是否包含糖基化位点。类似 地，可替换磷酸化的残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）。
[0310] 还可通过比较不同类型的表达CLL-I的细胞的抗体亲和力来确定或部分确定表 位。例如，可确定并比较以下细胞的抗体亲和力：原代AML细胞，例如AML母细胞和移植的 AML肿瘤细胞；AML细胞系；其他非癌性骨髓细胞等。
[0311] D. CDC、ADCC 和 ADC 测定
[0312] 当前描述的抗体对表达CLL-I的细胞的细胞依赖性细胞毒性（CDC)、抗体依赖性 细胞介导的细胞毒性（ADCC)和抗体药物缀合物细胞毒性（ADC)是有效的。表达CLL-I的 示例性细胞包括表达异源、重组CLL-I (例如人CLL-1)的细胞系；人AML细胞系，例如HL60、 THPl、TFl-a、U937和OCI AML-5(前四个可获自ATCC);来自一个或多个AML患者的原代细 胞（例如PBMC细胞或移植肿瘤细胞）；人CML细胞系，例如K562和KU812(可获自ATCC); 以及来自一名或多名CML患者或MDS患者的原代细胞。
[0313] 如果抗体造成表达该抗体靶标的细胞受到补体依赖性杀伤，则该抗体被视为具有 Q)C活性并介导⑶C。Q)C测定是本领域已知的，并且在例如Gazzano-Santoro等，（1997) J. Immunol. Methods 202:163 ;Idusogie 等，（2000) J. Tmmunol. 164:4178 ;以及下文的实施 例6中有描述。CDC试剂盒和服务是市售的，例如可购自GeneScript?和Cell Technology Inc0
[0314] 简言之，该测定通常在体外进行，并且包括使抗体结合于在其表面上表达该抗体 靶标的细胞。添加包括结合至抗体Ch区的Clq在内的补体成分。然后补体成分相互作用 以杀死靶标细胞。在一般4小时至24小时的孵育时间后，测量CDC，例如通过确定已知存在 于靶标细胞中的胞内酶或颗粒的释放、通过比较起始靶标细胞群体和终止靶标细胞群体等 来测量。
[0315] 如果抗体导致结合抗体的细胞（例如表达CLL-I的细胞）受到效应细胞的杀伤， 则该抗体被视为具有ADCC活性并介导ADCC。效应细胞通常是自然杀伤细胞，但也可为 巨噬细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞。也开发了基因改造的效应细胞系用于ADCC测 定（参见例如，Schnueriger 等，（2011)M〇1. Immunol. 48:1512)。ADCC 测定是本领域已知 的，并且在例如 Perussia 和 Loza (2000)Methods in Mo l.Biol. 121:179 ;Bretaudeau 和 Bonnaudet(2011)BMC Proceedings 5(Suppl 8):P63;以及下文的实施例 12 中有描述。 ADCC试剂盒和服务是市售的，例如可购自GeneScript:?和Promega?。
[0316] 简言之，该测定通常在体外进行，并且包括使抗体结合于在其表面上表达该抗体 靶标的细胞。添加效应细胞，其通常通过Fe受体如CD16来识别结合抗体的细胞。效应细 胞通过例如释放引起凋亡的细胞毒素来杀伤结合抗体的细胞。通过释放靶细胞中的可检测 元素（例如Cr51)或通过检测细胞介导的毒性中涉及的元素（例如效应细胞中NFAT信号 转导的活化）来检测细胞死亡。
[0317] 如果在与细胞毒性试剂（药物）缀合时，抗体导致表达该抗体的靶标（在本案 中为CLL-1)的细胞被杀伤（抑制存活），则该抗体被视为具有抗体-药物缀合物（ADC) 活性（或介导ADC)。合适的细胞毒性试剂是本领域已知的，例如，皂草素、多柔比星、 道诺霉素、长春花生物碱（vinca-alkaloid)、紫杉烷类、微管蛋白试剂（例如美登素、 阿里他汀（auristatin))和DNA试剂（例如，加利车霉素（calicheamicin)、倍癌霉素 (duocarmycin)、吡略苯并二卩丫庚因二聚体）等。ADC测定是本领域已知的，例如在Gerber 等，（2009)3:247以及下文的实施例中所描述的。
[0318] E.内化
[0319] 本文描述的CLL-I抗体可内化至包括CLL-IAML细胞在内的表达CLL-I的细胞中。 即，表达CLL-I的细胞可内化本文描述的抗体。本文描述的CLL-I抗体提供了用于靶向这 样的细胞的有效方式，例如使用可检测缀合物或细胞毒性缀合物。
[0320] 可通过使用本领域已知的方法来评价抗体的内化百分比和内化率，包括例如 流式细胞术（FACS)和共聚焦荧光显微镜。这样的方法在例如Lue等，（2007)Nature Protocols(Nature Med. 13:587-96) ;Cho 等，（2010)Biomacromolecules 以及 Corbani 等 (2004)Endocrinology 145:2876-85中有描述，并且如本文中所描述。
[0321] 对于FACS和共聚焦显微镜，用荧光标记的靶向试剂（例如抗体）来孵育细胞。通 常选择细胞来表达经标记抗体的靶标（例如CLL-1)。然后，可使用不表达该靶标的对照细 胞。内化通常发生于37°C，但不发生于4°C，这提供了该反应的另一个对照。因此，可使细 胞与经标记的试剂接触并在37°C或4°C下孵育（例如，以检测未进行内化的结合）。
[0322] 通过洗涤细胞来去除未结合的试剂或表面结合的试剂，例如，在酸洗液中洗涤，然 后用正常pH的缓冲剂洗涤。
[0323] 如果使用粘附细胞，则在进行流式细胞术之前从基质移除细胞。荧光细胞的百分 比指示经荧光标记的试剂的内化百分比。内化百分比还可表示为例如添加至细胞中的初始 标记试剂的百分比。
[0324] 试剂的内化还可通过使用共聚焦显微镜定位荧光标记的试剂来确定。使用共聚焦 显微镜的方法在例如Xiao等，（2008) Chem. Eur. J.，14:1769-1775中有描述。简言之，如上 文所述，使细胞与经标记的试剂接触并孵育。在孵育后，可将细胞孵育于冰上，于4°C下在 PBS缓冲剂中洗涤，用0. 25%的胰蛋白酶处理（如果适用，以除去基质）。然后可将细胞悬液 施加于玻片上用于共聚焦荧光显微镜检测。合适的共聚焦显微镜包括FV500-IX81共聚焦 显微镜（Olympus America Inc. ;Center Valley, PA)和Eclipse Ti-E (Nikon Instruments Inc. ;Melville，NY)〇
[0325] V.诊断应用
[0326] 本文描述的CLL-1抗体特异性结合表达CLL-1的细胞。因此，CLL-1抗体可用于 体外和体内诊断测定，以检测表达CLL-I的细胞（例如AML细胞和AML CSC)。例如，样品 (例如血液样品或组织活检样品）可获自患者，并将其与CLL-I抗体接触，并且，可通过检测 抗体结合来确定患者样品中表达CLL-I的细胞的存在。可直接（例如，当抗体本身被标记 时）检测或通过使用第二检测试剂如第二抗体来检测抗体结合。可检测标记可与本发明的 抗体直接相关或间接相关，例如通过螯合剂或连接子。
[0327] 在一些实施方案中，将CLL-I抗体与来自患有或疑似患有CLL-I相关疾病的个体 的生物样品接触，并确定抗体与样品中的细胞的结合，其中比正常抗体结合更高或更低指 示该个体患有CLL-I相关疾病。在一些实施方案中，所述生物样品是血液样品或血液级分 (例如，血清、血浆、血小板、红细胞、白细胞、PBMC)。在一些实施方案中，所述生物样品是组 织样品（组织活检），例如来自疑似肿瘤部位，或来自已知受到影响的组织，以例如确定已 知肿瘤的边界。
[0328] 通常进行组织活检以得到来自组织的样品，即，非流体细胞类型。所使用的组织活 检技术将依赖于待评价的组织类型（例如，乳腺、皮肤、结肠、前列腺、肾、肺、膀胱、淋巴结、 肝、骨髓、气道或肺）。在癌症的情况下，该技术还取决于肿瘤的大小和类型（例如，实体的、 悬浮的或血液的）以及其他因素。代表性的组织活检技术包括但不限于切除活组织检查、 切口活组织检查、针吸活组织检查、手术活组织检查和骨髓活组织检查。"切除活组织检查" 是指去除整个肿瘤块，其边缘有小的环绕肿瘤的正常组织。"切口活组织检查"是指去除包 含肿瘤截面直径的组织楔。通过内窥镜或荧光镜进行的诊断或预后可能需要对肿瘤块进行 "粗针穿刺组织活检（core-needle biopsy) "，或需要进行"细针穿刺组织活检"，这一般得 到来自肿瘤块内的细胞悬液。组织活检技术在例如Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper等，eds.，第16版，2005，第70章，以及整个第V部分中有论述。
[0329] 检测抗体结合至样品中细胞的任何方法都可用于当前的诊断测定。检测抗体结合 的方法是本领域公知的，例如，流式细胞术、荧光显微镜、ELISA等。在一些实施方案中，所 述方法包括制备用于确定步骤之前的检测的生物样品。例如，可从来自个体的样品的其余 部分（例如，其他血液组分）分离出细胞的子群体（例如，白细胞、CD34+细胞、CD45+细胞 等），或可使组织中的细胞悬浮以便更容易检测。
[0330] 在一些实施方案中，确定样品中表达CLL-I的细胞的百分比，并与对照进行比较， 所述对照例如来自已知患有CLL-I相关疾病的个体或个体组的样品（阳性对照），或来自 已知没有患CLL-I相关疾病的个体或个体组的样品（正常、健康、非疾病或阴性对照）。在 一些实施方案中，所述对照是对指定组织建立的CLL-I的标准表达范围。高于或低于表达 CLL-I细胞的正常百分比，或者高于或低于表达水平，指示该个体患有CLL-I相关疾病。
[0331] 在一些实施方案中，可向个体提供（给予）经标记的CLL-I抗体以确定对预期治 疗的适应性。例如，可使用标记的抗体来检测病变区域中的CLL-I密度，其中该密度一般相 对于非病变组织较高。标记的抗体还可指示病变区对治疗是可达到的。因此，可基于成像 结果来选择用于治疗的患者。可使用标准的成像技术（例如，CT扫描、MRI、PET扫描等）来 实现解剖学表征，例如确定癌症的准确边界。
[0332] 在一些实施方案中，本文所述的经标记的CLL-I抗体还可与治疗性化合物结合， 例如形成"治疗诊断性"组合物。例如，CLL-I抗体可连接（直接或间接）至可检测标记和 治疗剂，例如，连接至细胞毒性试剂以杀伤表达CLL-I的癌细胞。在一些实施方案中，经标 记的CLL-I抗体用于诊断和/或定位表达CLL-I的癌细胞，然后用单独的治疗性CLL-I特 异性抗体来靶向表达CLL-I的癌细胞。在一些实施方案中，诊断性的CLL-I特异性抗体是 不以高速率或百分比内化于表达CLL-I的细胞中的抗体。在一些实施方案中，治疗性CLL-I 抗体以高速率或百分比内化于表达CLL-I的细胞中。
[0333] A.标记
[0334] 包含CLL-I抗体的诊断试剂可包括本领域已知的任何诊断试剂，例如在以下文献 中所提供的：Armstrong 等，Diagnostic Imaging,第 5 版，Blackwell Publishing(2004); Torchilin, V. P. , Ed. , Targeted Delivery of Imaging Agents, CRC Press (1995)； Vallabhajosula, S. , Molecular Imaging:Radiopharmaceuticals for PET and SPECT，Springer (2009)。可通过多种方法来检测诊断试剂，包括作为提供和/或增强可检 测信号的试剂。可检测信号包括但不限于，γ发射信号、放射性信号、回波信号、光学信号、 荧光信号、吸收信号、磁信号或断层摄影信号。用于对诊断试剂成像的技术可包括但不限于 单光子发射计算机断层摄影（SPECT)、磁共振成像（MRI)、光学成像、正电子发射断层摄影 (PET)、计算机断层摄影（CT)、χ-射线成像、γ射线成像等。术语"可检测试剂"、"可检测部 分"、"标记"、"成像试剂"和类似术语在本文中同义使用。
[0335] 在一些实施方案中，所述标记可包括光学试剂，例如焚光剂、磷光剂、化学发光试 剂等。许多试剂（例如，染料、探针、标记或指示剂）是本领域已知的，并且可用于本发明。 (参见例如，Invitrogen, The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,第10版（2005))。焚光剂可包括多种有机和/或无机小分子，或多种焚光蛋 白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于菁、酞菁、扑啉、吲哚菁、罗丹明、吩嗪、苯基咕 吨、吩噻嘆、吩硒嘆、焚光素、苯并卟啉、方酸菁（squaraine)、二P比略喃啶酮、并四苯、喹啉、 P比嘆、咕啉、克酮鐵（cr〇conium)、吖啶酮、菲啶、罗丹明、叮啶、蒽醌、氧族P比喃鐵类似物、二 氢卟酷、萘菁（naphthalocyanine)、次甲基染料、吲噪鐵染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘 菊蓝、三苯基甲烷染料、剛B朵、苯并剛哚、剛噪羰菁、苯并剛哚羰菁和B0DIPY?衍生物。荧光 染料在例如美国专利第4, 452, 720号、美国专利第5, 227, 487号和美国专利第5, 543, 295 号中有描述。
[0336] 所述标记也可为放射性同位素，例如，发射Y射线、正电子、β粒子和α粒子 以及X射线的放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于 225Ac、72AS、211At、nB、 128Ba、 212Bi,75Br,77Br, 14C,109Cd,62Cu,64Cu,67Cu, 18F,67Ga,68Ga,3H,166Ho, 1231,1241,1251,1301, 131 1,111 In, 177Lu、13N、150、32P、 33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、 47Sc、153Sm、89Sr、99D1Tc、88Y 和 90Y。在一些实施 方案中，放射性试剂可包括 niIn-DTPA、99niTc(C0)