改进的生物柴油生产工艺的制作方法

专利名称：改进的生物柴油生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从微生物来源的油类获得用于柴油循环发动机的燃料的工艺及 产生所述的油类的微生物。本发明同样旨在所述产油微生物及其选择工艺和由此获得的多 聚核苷酸。
背景技术：
目前生物柴油的生产是基于来自植物(向日葵、油菜籽、棕榈树和其他物种)的 甘油三酯和低分子量的醇(甲醇、乙醇)的酯交换(醇解)反应从而产生脂肪酸甲酯/乙 酯和甘油。任何醇类的酯化作用都是可行的，但实际上此工艺仅使用了甲醇和乙醇(EP 523767)。由于成本低和物理化学性质允许其与任何低酸油脂反应，甲醇最常使用。生物柴油的产品由甘油三脂和醇生产，其重量比为10/1。因此，由1吨油，可获得 约1吨生物柴油和约IOOkg的粗甘油。纯度为70-85%的粗甘油可以通过调节相来纯化，除了中和步骤，为了达到浓度增 加到90-95%的目的，还进行了一个蒸发步骤。最后，该浓缩产物经过柱纯化，得到高纯度甘 油，其主要目的是用于医药和化妆品行业。然而，最近的生物柴油市场每年增长超过50%， 导致甘油的世界市场已经饱和。这种情况在不久的将来会变得更糟，如果遵守用公共生物 制成的生物柴油取代目前燃料的目标，那么将引起粗甘油在世界市场的过剩。在这种情况 下，由于纯化工艺过于昂贵而难以在一个饱和的市场下竞争，对其通过纯化方法的商业开 发，似乎对于生物柴油厂而言并不能成为最具有吸引力的解决方案。由于这种情况，尽管从 环保角度出发存在弊端，但已经开始考虑甘油的其他应用，例如可能作为燃料使用。此外，目前生物柴油的生产工艺中，大多使用含油种子或植物油，所以其生产成本 在很大程度上取决于原材料价格，这些价格占生产成本的50-60%。尽管使用废油，或另一 类型的脂肪，可以降低原材料的价格，但是该工艺需要一系列额外的步骤，以精炼这些油。 因此，探索降低生物价格价格，尤其是那些减少步骤数、提高产量和使用较便宜的原料的新 战略是有必要的。最近已经提议将非食用油脂的使用作为生产生物柴油的替代储备，特别是麻风树 (Jatropa curcas)、7_K黄皮(Pongamia pinnata)或 Madhuca indica 禾中子中的油月旨(Shah et al. ,Energy fuels,2004,18,154-159 ；Karmee SK et al. ,2005,Bioresource Technol, 96,1425-1429 ；Ghadge SV et al. , Bioresource Technol，2006，97，379-384)。然而，由于 气候或地理条件这些替代品并非在所有国家都可行。目前，源于产油的耕地作物或者具有高油含量的木本植物的甘油三酯的产量为每 年1. 2亿吨。如果达到生物柴油市场增长的预期水平，那么这些甘油三酯的供应将处于极 端的状态，甚至能够威胁到食品和传统油脂化学工业的供应。生产这种类型的更多作物需 要大量可耕种土地，而这种情况在许多地区是不可能实现的。因此，生物柴油行业需要甘油三酯的替代储备，其可以通过其他途径获得，特别是 那些可连续操作且不需要大量耕地的替代储备。
微生物油脂的生产已经作为研究对象很长时间了。有些真菌、酵母菌和藻 类能够在代谢应激过程中，在细胞内积累大于生物量70%的油脂(Ratledge C, Acta Biotechnol, 1991，11，似9_438)，这与植物种子发生的方式类似，因此它们被称为产油微生 物(Ratledge，Biochemie，2004，86，807-815)。一些属于蔷薇色酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、耶罗维 亚酵母属(Yarrowia)、隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利(氏)酵母属(Debaryomyces)、 假丝酵母属(Candida)或油脂酵母属(Lypomyces)和小球藻属(Chlorella)的酵母积累含 有C16和C18脂肪酸骨架的甘油三酯(例如，棕榈酸、硬脂酸、油酸)，其与植物油，例如油 菜籽和大豆中的油十分类似。因此，由于其符合EN 14214标准，来源于这些微生物的油类 (微生物源油类，SCO)有可能被用来生产生物柴油。关于由微生物生产的脂类生产生物柴油的信息几乎没有报道。近年来报道了 一些使用微藻(microalga)Chorella starkey 的工艺(Bioresource Technol, 2006,97, 841-846)和一些使用酵母的工艺(J Chem Technol Biotechnol，2007，82，775-780)。然而， 在这两种情况下，使用的原料为葡萄糖，因此工艺的经济平衡是不可行的。通过使用微生物或酶，从农产品，森林或工业部门的工业生产过程中产生的有机 副产品/废物，可作为生产高附加值化合物的原料。来自生物柴油工业的粗甘油将包括在 这些副产品中。基于这些背景文献，需要在生物柴油工业中建立一种改进的工艺，其从战略、经济 和技术方面解决下列问题-粗甘油巨额过剩所产生的问题。-使用的涉及高价格或者过大的耕种面积的原料的缺点。发明简述本发明的作者已经建立了一种新的用于以甘油作为碳源的生物柴油的生产工艺， 其达到了与已知工艺中相同的产量，但是提高了产品的质量并且降低了生产工艺中的成 本。特定地，该工艺允许从高甘油三酯含量的微生物中获得一种脂肪酸酯混合物，其适合作 为柴油发动机的易燃物或燃料。因此，本发明的第一目的在于一种获得生物柴油的工艺，其包括a)通过利用一种以甘油作为碳源的产油微生物，获得具有甘油三酯含量等于或大 于干重20%的微生物生物量；b)将步骤a)中获得的生物量中的甘油三酯转化成脂肪酸酯的混合物。在一个具体的实施例中，部骤a)中微生物生物量的获得受限于所含甘油三酯的 分离状况，其随后将根据步骤b)转化成脂肪酸酯混合物.在一具体的实施例中，获得步骤a)中的微生物生物量具有甘油三酯的含量在干 重的20%和70%之间。在本发明的另一具体的实施例中，在获得脂肪酸酯混合物之前，向微生物生物量 中添加产油植物种子。本发明同样旨在一种获得生物柴油的工艺，其包括a.通过利用以甘油为碳源的含油微生物获得具有甘油三酯的含量等于或者大于 干重的20%的微生物量；
b.可选地，从微生物生物量中分离甘油三酯；c.通过在酸性培养基中醇解，将步骤a)中获得的包含在生物量中的甘油三酯或 者在步骤b)中分离的甘油三酯转化成脂肪酸酯混合物，以获得一个包括脂肪酸酯的相和 另一个包括甘油和细胞残留物的相；d.对在步骤C)中获得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和细胞残留物的相进行第 一次分离；e.中和步骤d)中分离出的脂肪酸酯的相，以便获得一个包括脂肪酸酯的相和一 个包括水及醇剩余物的相；f.对在步骤e)中获得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和水及醇剩余物的相进行 第二次分离；g.纯化步骤f)分离出的中包含脂肪酸酯的相。在另一方面，本发明旨在一种能够使用甘油作为碳源并能积累甘油三酯的产油微 生物。本发明的还一方面涉及筛选出一种能够以甘油作为唯一碳源并能积累甘油三酯 的含油微生物的方法，其包括获得能够在以甘油作为唯一碳源的培养基上生长的菌株；选择步骤(i)中产生甘油三酯的菌株。发明详述在本发明中，术语“生物量”或者“微生物生物量”指的是培养基中一次生长的微 生物的细胞集合。根据ASTM(美国材料与试验协会)的说明，生物柴油是一种生物燃料，可再生燃 料，如来源于可再生脂类(例如植物油或动物脂肪)中的长链脂肪酸(具有8个以上碳原 子)的单烷基酯，并且其用于压燃式发动机(柴油发动机)中。在本发明中，所述油类来自 先前定义的微生物生物量。在本发明中，“产油微生物”涉及一种其能够在代谢应激下，在细胞内积累脂类的 酵母、丝状真菌或微藻(蔷薇色酵母属、红冬孢酵母属、耶罗维亚酵母属、隐球酵母属、德巴 利(氏)酵母属、假丝酵母属、油脂酵母属或小球藻属)。在第一方面，本发明的目的在于一种获得生物柴油的工艺，其包括a)通过利用一种以甘油作为碳源的产油微生物，获得具有甘油三酯含量等于或大 于干重20%的微生物生物量；b)将在步骤a)中获得的生物量中的甘油三酯转化成脂肪酸酯的混合物。在一个具体的实施例中，对步骤a)中获得的微生物生物量中所含甘油三酯进行 分离，其随后被转化成脂肪酸酯混合物。该分离优选包括提取。在步骤a)中获得微生物生物量的工艺包括在烧瓶中或生物反应器中培养产油微 生物直到甘油三酯含量等于或大于干重的20%。在一优选实施例中，微生物在18°C和30°C之间的温度下培养2到5天，优选在 23°C和30°C之间的温度下不断搅拌培养。一旦细胞内甘油三酯含量达到最大值，通过任一 常规工艺收集细胞，诸如，例如，过滤或离心。在一优选实施例中，生物量中的甘油三酯含量包含在干重的20%和70%之间。
在本发明的一优选实施例中，用于生产生物量的微生物是一种酵母。在更优 选的实施例中，所述酵母特别优选是红冬孢酵母属和圆红冬孢酵母菌(Miodosporidium toruloides)CECT 13006 和圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)CECT 13007 菌株。微生物在以甘油作为碳源的培养基中生长，该甘油相对于在相同的培养基中的氮 源是过量的。氮源可以是酵母提取物、蛋白胨、玉米浆、尿素、谷氨酸钠或不同的无机氮源， 例如，铵盐等，但其不限于此。除了甘油，其他碳来源，例如，葡萄糖、糖蜜、蔗糖、果糖、淀粉或脂肪酸，也能存在 于培养基中，但碳源并不仅仅局限于这些。根据本发明的一个具体的实施例，在发酵培养基 中甘油作为碳源，优选地甘油的量为使用碳水化合物的总量的70-100%。出于经济原因，优 选使用的甘油为粗甘油，即具有纯度在大约70%和85%之间的甘油。在本发明的另一具体实施例中，本发明的工艺还包括向步骤a)中获得的微生物 生物量中添加含油植物种子的步骤，此步骤在获得脂肪酸酯的混合物的步骤之前。合适的 植物种子例如葵花籽、油菜籽、棕榈、大豆、白菜型油菜(turnip rape)或椰子种子。相应地，脂肪酸酯的混合物通过直接醇解在步骤a)中获得的微生物生物量中所 包含的甘油三酯或者从微生物生物量中分离出来的甘油三酯来制备。在该反应中可以使用 一种催化剂去提高反应速率和终产量。醇解反应优选在酸性培养基中进行，也就是说使用 酸作为催化剂。酸化可以在任何酸介质中，诸如，例如，硫酸、盐酸或磷酸中进行，但不限于 此。反应中使用的醇优选为相对于生物量重量的5到40倍，更优选在10到30倍之间。在 一个具体实施例中，允许反应在连接搅拌下进行20至36小时，温度在40°C和70°C之间，优 选在50°C和70°C指间。同样优选地，生物量的醇解所使用的醇具有1、2、3或4个碳原子。 甚至更优选地，醇是甲醇或者乙醇，甲醇为最优选的醇。除了先前所述的均相酸型催化剂，在本发明的其他实施例中还是用了非均相酸催 化剂(例如，沸石、磺酸型树脂、S04/Zr02, W03/Zr02)、非均相碱性催化剂(例如，MgO, CaO, Na/Na0H/Al203)、均相碱性催化剂(例如，Κ0Η、NaOH)或者酶催化剂(脂肪酶，例如，假丝酵 母、青霉菌、假单胞菌)。本发明同样旨在一种获得生物柴油的工艺，其包括a.通过利用甘油作为碳源的含油微生物获得具有甘油三酯的含量等于或者大于 干重的20%的微生物量；b.可选地，从微生物生物量中，分离甘油三酯；c.通过在酸性培养基中醇解，将步骤a)中获得的包含在生物量中的甘油三酯或 者在步骤b)中分离的甘油三酯转化成脂肪酸酯混合物，以便获得一个包括脂肪酸酯的相 和另一个包括甘油和细胞残留物的相；d.对在步骤C)中获得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和细胞残留物的相进行第 一次分离；e.中和在步骤d)中分离出的包括脂肪酸酯的相，以便获得一个包括脂肪酸酯的 相和一个包括水及醇残留物的相；f.对在步骤e)中获得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和水及醇残留物的相进行 第二次分离；
g.纯化步骤f)分离出的包含脂肪酸酯的相。
如前所述进行步骤a)、b)和C)。在本发明一具体的实施例中，通过离心工艺执行相分离的步骤d)。将步骤e)中的含有脂肪酸酯的相通过中和来除去过量的醇，如果有酸，除去酸。 中和过程适于通过加入到一定量的水中的弱碱性溶液进行，例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢 氧化铵，使用水的量范围优选为步骤d)中分离到的含有脂肪酸酯的相体积的1/3到1/10 之间。在本发明的一具体实施例中，所述中和反应可以通过几个步骤进行，例如，第一步 添加浓度相当于所添加的水重量的0. 05-0. 3%的碱，第二步添加浓度相当于水重量的 0. 01-0. 的碱。在一个具体实施例中，在中和过程步骤中，以勻速进行机械搅拌大约15-60分钟 以防止乳液形成。在一个具体实施例中，步骤f)中进行的相的第二次分离通过重力沉淀作用进行， 一个相由水和醇残留物组成，一个相含有获得的脂肪酸酯。通过在蒸发器中除去水和醇残留物来净化所述酯。蒸发少量的水和酯，通常为甲 醇或乙醇，需要一个较低能量的工艺，因为它需要的温度比在酯类的纯化过程中用于酯的 蒸馏的温度低。如果其含水量大于标准14214中所规定的值，所获得的生物柴油可以进行再循 环。产油微生物如上所述，获得生物柴油的工艺包括利用以甘油作为碳源的产油微生物。因此，在 另一方面，本发明旨在一种以甘油作为碳源并能够能够积聚甘油三酯的微生物。在另一具体实施例，所述微生物能够积聚甘油三酯的含量等于或大于干重的 20%，优选在20%和70%之间。在本发明的背景下，产油微生物可以是一种酵母，一种丝状菌或者一种微藻。在本 发明的优选实施例中，所述微生物是一种酵母。在更优选的实施例中，所述酵母是红冬孢酵 母属的，更为优选是圆红冬孢酵母菌CECT 13006和圆红冬孢酵母菌CECT 13007。本发明中微生物的国际保藏单位是西班牙普通微生物保藏中心 (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo-CECT)。在另一方面，本发明涉及筛选一种以甘油作为唯一碳源并能够积聚甘油三酯的含 油微生物的方法，其包括(i)获得能够在以甘油作为唯一碳源的培养基上生长的菌株；(ii)选择步骤(i)中产生甘油三酯的菌株。在步骤(i)中，任何本领域中已知的甘油培养基都可以用于筛选菌株，例如蔷薇 色酵母属、红冬孢酵母属、耶罗维亚酵母属、隐球酵母属、德巴利(氏)酵母属、假丝酵母属、 油脂酵母属或小球藻属。甘油培养基优选包括MMG培养基(每升6. 7g无氨基酵母氮源 (YNB) ；47g粗甘油；补充氯霉素(50 μ g/mL))。在步骤(ii)中，通过抽样染色的方法筛选生产甘油三酯的菌株，如通过尼罗红染 色后进行荧光分析。本发明中限定的酵母菌株已经通过核糖体DNA 26S亚基的D1/D2区域的对应核苷酸序列以及位于18S和26S亚基之间的总ITS区域的片段进行鉴定。因此，在另一方面，本发明涉及一种多聚核苷酸，其特征在于具有如SEQ ID NO=I 所示的序列，对应于圆红冬孢酵母菌株CECT 130076核糖体DNA 26S亚基D1/D2的区域。在另一方面，本发明涉及一种多聚核苷酸，其特征在于具有如SEQ IDNO 2所示的 序列，其对应于圆红冬孢酵母菌株CECT 13006的18S和26S亚基之间的总ITS区域。在另一方面，本发明涉及一种多聚核苷酸，其特征在于具有如SEQ IDNO :3所示的 序列，其对应于圆红冬孢酵母菌株CECT 13007的核糖体DNA26S亚基D1/D2的区域。在另一方面，本发明涉及一种多聚核苷酸，其特征在于具有如SEQ IDNO :4所示的 序列，其对应于圆红冬孢酵母菌株CECT 13007的18S和26S亚基之间的总ITS区域。正如本领域技术人员所知，本发明中的多聚核苷酸可以用作探针，或由此设计引 物或探针，用于鉴定红冬孢酵母属的其他种类。具体实施例1.能够以粗甘油作为唯一碳源进行生长的微生物的选择通过两种策略从Rio Tinto(韦尔瓦)河岸采取的土壤样本中分离这些微生物。向 试管中的Ig样品中添加IOmL盐水溶液并剧烈搅拌10分钟。由此开始，准备用盐溶液进行 1 10倍的连续稀释过程，将0. ImL接种于含有YPG培养基(每升10g酵母提取物、20g 细菌蛋白胨、47g粗甘油、补充氯霉素(50yg/mL))的平板中以抑制细菌增殖。平板在 下培养4-5天并且将长出的菌落转移到含有MMG的培养基中(每升6. 7g无氨基酵母氮源 (YNB) ；47g粗甘油；补充氯霉素(50yg/mL))中。平板在下培养5_7天。在第二个策略中，一部分样品在无菌研钵中研磨，取其中Ig加入到含有50mL补 充添加玫瑰红(50 μ g/mL)和氯霉素(50 μ g/mL)的MMG培养基的烧瓶中。烧瓶在下， 250rpm培养M小时。然后，0. 5mL该培养物被转移到另一个含有8%粗甘油的MMG的烧瓶 中，在同样条件下进行培养。使用含有具有12%粗甘油的MMG培养基重复该过程。来自含 有8-12%甘油的培养物的稀释液被接种在含有MMG培养基的平板上，然后在下，培养 7天。通过这两个过程，在YPG培养基中获得了 470个菌落，从其中选择出230个能够在 MMG中生长的菌落。2.能够以粗甘油作为唯一碳源进行生长并能积累甘油三酯的微生物的筛选通过使用尼红染色(KimuraK，et al. , 2004, J. Microbiol. Methods, 56, 331-338) 抽样分析积累甘油三酯的能力。培养物在小尺寸96孔盘中的MMG培养基中生长，在下，250rpm培养72小时。 此后，取出0. 5mL的培养物用等体积的PBS缓冲液稀释(IOmM磷酸钾缓冲液，0. 15M KCl，pH 7. 0)。在0. 4mL的悬浮液中加入0. OlmL的尼红溶液，混合物在室温下孵育5分钟，将0. ImL 转移到微量滴定板中，在600nm下在光吸收酶标仪(Plate Reader)中测定荧光值。有12 个培养物显示出了高于对照组的荧光测量值，圆红冬孢酵母菌CBS14，其被选为可能是甘油 三酯的生产者。将这12个菌株和对照菌株做三个重复，在含有50mL的MEM培养基(1升 粗甘油，47g ；酵母提取物，1. 5克；磷酸二氢钾，0. 75克；硝酸铵，0. 28克；CaCl · 2H20，0. 4 克；MgSO4 · 72H20，0. 4克，用浓盐酸调节pH至5)中，28°C下，250rpm培养96小时。通过离心收集细胞，排空两个试管，50°C下在烤箱中放置M小时以测量干重。其他的试管用定量 滤纸吸干并用含有0. 75mL氢氧化铵的5mL水进行悬浮。轻轻搅拌悬浮液，在60_70°C的水 浴中培养15分钟。冷却并加入5mL乙醇，剧烈搅拌。然后加入12. 5mL乙醚，简单搅拌。然 后加入同样体积的石油醚。混合物通过离心进行分离，分离出有机相转移到一个平底烧瓶 中。有机相在旋转蒸发器蒸干，将烧瓶放置在102°C下的烤箱中直至恒重。通过重量测定法，鉴定出两个能够积累其干重25. 3%和27. 2%的甘油三酯的菌 株。两者均通过对核糖体DNA 26S亚基的D1/D2区域和位于亚基之间的总 ITS(内转录间隔区)的一个片段进行测序被确定为两个不同的红冬孢酵母菌株，其均示 出了与现有数据库保藏的该物类的相关序列存在着差异。两个菌株均保藏在西班牙典型 培养物保藏中心，分别命名为圆红冬孢酵母菌0376(CECT no. 13006)和圆红冬孢酵母菌 0770 (CECT no. 13007)。为了扩增对应于核糖体DNA28S亚基的D1/D2区域，使用了序列为SEQ ID N0:5和 SEQ ID NO 7的寡聚核苷酸。同样，使用序列为SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 8的寡聚核苷 酸扩增位于18S和26S亚基之间的ITS区域。在另一方面，本发明涉及一种寡核苷酸，其特征在于具有如SEQ ID NO :5所示的序 列。在另一方面，本发明涉及一种寡核苷酸，其特征在于具有如SEQ ID NO :6所示的序 列。在另一方面，本发明涉及一种寡核苷酸，其特征在于具有如SEQ ID NO :7所示的序 列。在另一方面，本发明涉及一种寡核苷酸，其特征在于具有如SEQ ID NO :8所示的序 列。3.通过以粗甘油作为唯一碳源并具有积累甘油三酯能力的微生物发酵生产生物 柴油。将在固体YPG培养基(基于1升的组分酵母提取物10g、细菌蛋白胨20g、粗甘油 47g、琼脂20g)中生长的圆红冬孢酵母菌CECT13007细胞，接种在50mL同样的培养基中。在 定轨振荡器中培育M小时后QOOrpm )，将25mL该培养物转移到含有250mL YPG培养 基的长颈瓶中。细胞在定轨振荡器中再培育M小时O00rpmJ8°C)。然后，将150mL该培 养物转移到含有1. 35升MEM培养基的发酵罐中。该培养基包括(基于1升)47g粗甘油； 1. 5g 酵母提取物；0. 75g 磷酸二氢钾；0. 28g 硝酸铵；0. 4gCaCl · 2H20 ；0. 4g MgSO4 · 72H20， 用浓盐酸调节pH至5。发酵罐维持在^°C，通过以250rpm的转速进行搅拌将溶解氧的浓度维持在20% 以上。72小时后，发酵罐的生物量浓度为M.4g/L，细胞内甘油三酯的含量为52.3%。通 过气相色谱分析存在的脂肪酸的组分，发现主要为棕榈酸(对％)、硬脂酸(8%)、油酸 (55% )和亚油酸(2% )0离心收集细胞，并在50°C下干燥8小时。在一个带有冷凝器的圆底烧瓶中加入IOg生物量(5. 2g甘油三酯)和IOOmL在甲 醇中的酸性溶液。悬浊液在60°C下加热，在常压下剧烈搅拌20个小时。一旦反应结束，停 止搅拌并且通过离心将混合物分离。由此获得了两个相一个轻相含有甲酯和过量的甲醇，一个重相由甘油、甲醇残留物、催化剂和盐组成。通过用氢氧化钠的浓度为所添加水重量的0. 1 %的碱性水洗涤两次，进行对轻相 的纯化。每次洗涤时，允许轻轻倒出，直到达到有机相和水相良好的分离。除去水相，在 IOOmbar绝对压强，120°C下，使用真空降膜蒸发器除去甲醇和水残留物以收集甲酯。获得的 终量为5. 09g甲酯，其代表了 98%的产量。由此获得的甲酯适用于在柴油机中作为汽车燃料使用，其符合欧洲标准14214中 关于该类燃料的规定(见表1)。表 1作为SCO甲酯混合物燃料的性质
权利要求
1.一种获得生物柴油的工艺，其包括a)通过利用一种以甘油作为碳源的产油微生物，获得具有甘油三酯含量等于或大于干 重20%的微生物生物量；b)将步骤a)中获得的生物量转化成脂肪酸酯的混合物。
2.根据权利要求1所述的工艺，其中在随后根据步骤b)将其转化成脂肪酸酯混合物的 步骤之前，对步骤a)中获得的微生物生物量中所含甘油三酯进行分离。
3.根据权利要求2所述的工艺，其中分离包括提取。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的工艺，其中微生物量中的甘油三酯含量包括在 20%和70%干重之间。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的工艺，其中所述微生物是一种酵母菌。
6.根据权利要求5所述的工艺，其中所述微生物是红冬孢酵母菌属中的一种酵母菌。
7.根据权利要求6所述的工艺，其中所述微生物为圆红冬孢酵母菌CECT13006。
8.根据权利要求6所述的工艺，其中所述微生物为圆红冬孢酵母菌CECT13007。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的工艺，其中甘油组成碳源的70-100%。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的工艺，还包括在将生物量转化成脂肪酸酯的步 骤之前，存在将含油植物种子添加到生物量中的步骤。
11.根据权利要求1或2所述的工艺，其中步骤b)通过醇解进行。
12.根据权利要求11所述的工艺，其中，醇解在酸性培养基中进行。
13.根据权利要求11或12所述的工艺，其中，醇解在40°C和70°C之间的温度下进行。
14.根据权利要求13所述的工艺，其中，醇解在50°C和70°C之间的温度下进行。
15.根据权利要求11到14中任一项所述的工艺，其中，用甲醇或者乙醇进行醇解。
16.根据权利要求15所述的工艺，其中，用甲醇进行醇解。
17.一种获得生物柴油的工艺，其包括a)通过一种以甘油作为碳源的含油微生物，获得具有甘油三酯的含量等于或者大于干 重20%的微生物量；b)可选地，从微生物生物量中分离甘油三酯；c)通过在酸性培养基中醇解，将步骤a)中获得的生物量中含有的甘油三酯或者在步 骤b)中分离的甘油三酯转化成脂肪酸酯混合物，以便获得一个包括脂肪酸酯的相和另一 个包括甘油和细胞残留物的相；d)对在步骤c)中获得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和细胞残留物的相进行第一次 分离；e)中和步骤d)中分离的包括脂肪酸酯的相，以便获得一个包括脂肪酸酯的相和一个 包括水及醇残留物的相；f)对在步骤e)中获得的包括脂肪酸酯的相和包括水及醇残留物的相进行第二次分1 ；g)纯化步骤f)中分离的包括脂肪酸酯的相，通过以甘油作为碳源的产油微生物获得 具有甘油三酯含量等于或大于20%干重的微生物生物量。
18.—种能够使用甘油作为碳源积累甘油三酯的产油微生物。
19.根据权利要求18所述的含油微生物，其中所述微生物能够积累的甘油三酯的含量2等于或者大于干重的20%。
20.根据权利要求18或19所述的微生物，其中所述微生物是一种酵母菌。
21.根据权利要求20所述的微生物，其中所述微生物是红冬孢酵母菌属中的一种酵母菌。
22.根据权利要求21所述的微生物，其中所述微生物是圆红冬孢酵母菌CECT13006。
23.根据权利要求21所述的微生物，其中所述微生物是圆红冬孢酵母菌CECT13007。
24.一种选择能够使用甘油作为唯一碳源积累甘油三酯的含油微生物的方法，其包括(i)获得能够在以甘油作为唯一碳源的培养基上生长的菌株； ( )选择步骤(i)中产生甘油三酯的菌株。
25.根据权利要求M所述的工艺，其中步骤(i)中的培养基包括MMG培:
26.根据权利要求M或25所述的工艺，其中步骤(ii)包括抽样染色。
27.根据权利要求26所述的工艺，其中步骤(ii)包括荧光分析。
28.一种3S聚核苷画1，其特征在于具有SEQIDNO :1所示的序列。
29.一种3S聚核苷画1，其特征在于具有SEQIDNO 2所示的序列。
30.一种3S聚核苷画1，其特征在于具有SEQIDNO 3所示的序列。
31.一种3S聚核苷画1，其特征在于具有SEQIDNO 4所示的序列。
32.一种3S聚核苷画1，其特征在于具有SEQIDNO 5所示的序列。
33.一种3S聚核苷画1，其特征在于具有SEQIDNO 6所示的序列。
34.一种3S聚核苷画1，其特征在于具有SEQIDNO 7所示的序列。
35.一种3S聚核苷画1，其特征在于具有SEQIDNO 8所示的序列。
全文摘要
本发明涉及一种获得适合作为柴油循环发动机的可燃物或燃料的脂肪酸酯混合物的工艺，其包括a)通过利用甘油作为碳源的产油微生物，获得具有甘油三酯含量等于或大于20％干重的微生物生物量；和b)将步骤a)中获得的生物量中含有的甘油三酯转化成脂肪酸酯混合物。本发明同样涉及所述产油微生物及其选择工艺和由此获得的多聚核苷酸。
文档编号C12P7/64GK102046794SQ200980118937
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月25日 优先权日2008年3月25日
发明者Ma·卡门·龙切尔巴雷诺, 何塞路易斯·阿德里奥范德维尔, 哈维尔·贝拉斯科阿尔瓦拉多, 阿尔韦托·扎夫拉戈麦斯, 马格达莱纳·巴尔迪维索加特 申请人:神经元生物制药股份公司