抗-flt3抗体的制作方法

专利名称：抗-flt3抗体的制作方法
抗-FLT3抗体本申请要求均于2008年5月30日提交的美国临时申请号61/130，395、 61/130，539 和 61/103，394 的优先权。本发明涉及对人Fms样酪氨酸激酶3受体(FLT3)特异的人抗体，包括其片段或部 分。抗体被用于治疗癌细胞的生长并且可以单独或与抗肿瘤剂(包括但不限于甲氨蝶呤 (MXT))组合用于治疗白血病。人Fms样酪氨酸激酶3受体(FLB)，也称作胎肝激酶2 (FLK-2)、干细胞酪氨酸激 酶1 (STK-I)和CD135 (SEQ ID NO 43)，是III类受体酪氨酸激酶的成员。通常，FLT3在未 成熟的骨髓-淋巴细胞前体细胞和树突细胞前体上表达，但是很少在成熟的成人细胞上表 达。FLT3在约90%的急性粒细胞白血病(AML)、多数急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性粒 细胞白血病的原始细胞危象期(BC-CML)中过表达。FLT3配体(FL)的刺激增强了白血病细 胞的增殖和存活。FLT3信号转导的抑制导致树突细胞中的细胞凋亡和免疫应答的抑制。小分子抑制剂不是完全FLT3特异的并且可以产生药物抗性。从而，小分子FLT3 抑制剂还没有提供白血病的有效靶向疗法。非常希望有该未满足的医学需求的新的治疗。 抗体方法可以克服与小分子FLT3抑制剂相关的一些缺点。首先，抗体对于确定的抗原是特 异的，从而避免了抑制多种激酶引起的潜在副作用。其次，FLT3中和抗体靶定细胞外结构 域，其比激酶结构域较不易于突变，降低了药物抗性的可能性。第三，抗体可以募集免疫效 应机理，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CMC)，以杀死目标肿瘤 细胞，导致增加的治疗功效。最后，FLT3特异性抗体可以对于野生型(特别在中和性抗体 的情况下)和突变的FLT3(由于免疫效应机理)都是有活性的，扩展了目标患者群体。过去在开发白血病治疗剂包括FLT3抑制剂的努力(Li Y.，等人，ht. J.Hematol. 82 (2) :108-14 (2005)，Li Y. , Drug Development Research 67(6) 495-500(2006).Li Y.,等 K, Expert Opinion in Biological Therapy 7(3) 319-330(2007.))在很大程度上是不成功的。已经包括了其他开发策略US5，777，084杂交 瘤抗体；W095/27062拮抗剂抗体，W094/28391抗配体的抗体；W02005/094823小分子。Zheng R.，等人，Blood 103(1) :267-274(2004), Li Y.，等人，Bloodl04(4) 1137-44(2004), Piloto, 0.，等人，Cancer Res. 65(4) 1514-22 (2005)，Williams B.，等 人，Leukemia 19(8) :1432-8(2005), Piloto 0.，等人，CancerRes. 66 (9) :4843-51(2006) Piloto 0.，等人，Blood 109(4) :1643-1652(2007)和 Brent R.，等人，AACR Annual Meeting 2007，Los Angeles (2007)公开了对FLT3受体具有高结合亲和力的人拮抗剂抗 体。一些抗FLT3抗体，包括EB10、NC7和D4-3，抑制FLT3的配体依赖性(野生型受体) 以及配体独立的(突变受体)活化(见Pil0t0，Cancer Res.，上文)。在本发明之前，本发 明的抗FLT3抗体的确切CDR序列和表位结合结构域还是未知的。此外，需要提供备选的抗FLT3抑制剂，其与本领域已知的那些抑制剂相比，对 FLT3具有高结合亲和力并且阻断该配体与FLT3受体的结合，因此抑制FLT3的活化和其信 号途径。本发明试图提供备选的抗FLT3抗体，其与本领域已知的那些抑制剂相比对FLT3具有提高的配体阻断和结合亲和力。还需要提供备选的抗FLT3抑制剂，其诱导细胞表面FLT3的快速和有效的内化和 下调。本发明试图提供人抗FLT3抗体，其与本领域已知的那些抑制剂相比提供了细胞表面 FLT3的快速和有效的内化和下调。还需要提供备选的抗FLT3抑制剂，其抑制白血病中野生型FLT3和MPK、PII和 STAT5途径的下游激酶的FL诱导的磷酸化。本发明试图提供人抗FLT3抗体，其与本领域 已知的那些抑制剂相比抑制白血病中野生型FLT3和MPK、Pi;3K和STAT5途径的下游激酶的 FL诱导的磷酸化。此外，需要提供备选的抗FLT3抑制剂，其活化下游免疫效应功能如抗体依赖性细 胞毒性(ADCC)的能力提高。本发明试图提供人抗FLT3抗体，其与本领域已知的那些抑制 剂相比活化下游免疫效应功能如ADCC的能力提高。完全人或人源化抗体为成功作为人类治疗剂提供了最大的潜力，因为它们在人体 中将比鼠类或嵌合抗体(如W095/07348和WO 98/25457)有更小的免疫原性。本发明抗体 具有这些前述特征，从而提供了重要的优势。在本发明之前，认识到FLT3抑制剂与甲氨蝶呤(MTX)的组合在白血病治疗中 没有益处。该教条起源于如下报导利用培养的白血病细胞系，小分子FLT3抑制剂和甲 氨蝶呤的组合在治疗白血病中无效，而与其他化学疗法的组合有效(Furukawa，Y.等人， Leukemia (2007) 21 :1005-1014)。与本发明相关的实验结果表明实际上，靶定FLT3的抗体 即EBlO与MTX的组合在白血病的动物模型中导致显著提高的存活。本发明提供了结合人FLT3的D4或D5结构域内表位的抗体或其片段。本发明提供了治疗哺乳动物中前癌状况或者癌症的方法，包括对该哺乳动物以有 效治疗前癌状况或癌症的量施用MTX与FLT3抑制剂的组合。本发明还提供了包含连接MTX 的FLT3抑制剂的缀合物。本发明涉及人抗体和其片段，如通过表面等离振子共振测定，所述抗体和其片段 对于可溶性FLT3-FC融合蛋白以不大于4. 5 X IO^10M的亲和力结合人抗原FLT3 (SEQ ID NO 43)。本发明还涉及结合人抗原FLT3的人单克隆拮抗剂抗体和其片段。本发明的一个方面是结合FLT3的抗体或其片段，包含具有序列GYTFTSYYMH(SEQ ID NO 1)或SYYMH(SEQ ID NO 2)的CDRH1、具有序列 IINPSGGSTSYAQKFQG(SEQ ID NO 3)的 CDRH2、具有序列 GVGAHDAFDI(SEQ ID NO 4)或 VVAAAVADY (SEQ ID NO 5)的 CDRH3、具有序 列 RSSQSLLHSNGNNYLD (SEQ ID NO :6)或RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO 7)的 CDRLl、具有序 列 LGSNRAS (SEQ ID NO 8)的 CDRL2、具有序列 MQGTHPAIS (SEQ ID NO :9)或MQSLQTPFT (SEQ ID NO 11)的 CDRL3。本发明的一方面是结合FLT3的抗体或其片段，包含具有序列GYTFTSYYMH(SEQ ID NO 1)或 SYYMH(SEQ ID NO 2)的 CDRH1、具有序列 IINPSGGSTSYAQKFQG(SEQ ID NO 3)的 CDRH2、具有序列 GVGAHDAFDI(SEQ ID NO 4)的 CDRH3、具有序列 RSSQSLLHSNGNNYLD (SEQ ID NO 6)的 CDRLl、具有序列 LGSNRAS (SEQ ID NO 8)的 CDRL2、和具有序列 MQGTHPAIS (SEQ ID NO 9)的⑶RL3。在再一个方面，具有前述⑶Rs的抗体在25°C以不大于4. 5 X ΙΟ,Μ的亲和 力特异结合人FLT3，如通过表面等离振子共振测定。在本发明的另一方面，特异结合FLT3的抗体或其片段包含具有序3/29 列 GYTFTSYYMH(SEQ ID NO 1)或 SYYMH(SEQ ID NO 2)的 CDRHl、具有序列 IINPSGGSTSYAQKFQG (SEQ ID NO 3)的 CDRH2、具有序列 VVAMVADY (SEQ ID NO 5)的 CDRH3、 具有序列 RSSQSLLHSNGYNYLD(SEQ ID NO 7)的 CDRL1、具有序列 LGSNRAS (SEQ ID NO 8)的 CDRL2，和具有序列 MQSLQTPFT(SEQ ID NO :11)的 CDRL3。在本发明的另一方面，特异结合人FLT3的抗体或其片段包含具有序 列 GGTFSSYAIS(SEQ ID NO :12)或 SYAIS(SEQ ID NO :13)的 CDRH1、具有序列 GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 14)的 CDRH2、具有序列 FALFGFREQAFDI (SEQ ID NO :15)的 CDRH3、具有序列 RASQSISSYLN (SEQ ID NO 16)的 CDRL1、具有序列 AASSLQS (SEQ IDNO 17) 的 CDRL2、和具有序列 QQSYSTPFT (SEQ ID NO 18)的 CDRL3。本发明的另一方面是结合FLT3的抗体或其片段，并且包含具有序列DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSG SGSDTDFTLQISRVEAEDVGVYYCMQGTHPAISFGQGTRLEIK(SEQ ID NO 22)的 VL，和具有序列EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVT MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGAHDAFDIffGQGTTVTVSS(SEQ ID NO 19)的 VH。本发明的另一方面是结合FLT3的抗体或其片段，并且包含具有序列DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO :24)的 VL，和具有序列EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWARQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVT MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVVAAAVADYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO :21)的 VH。本发明的另一方面是结合FLT3的抗体或其片段，并且包含具有序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO 23)的 VL，和具有序列EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVT ITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIffGQGTTVTVSS(SEQ ID NO 20)的 VH。本发明的另一方面是单克隆抗体，其包含SEQ ID NO 28的轻链和SEQ ID NO 25 的重链；或SEQ ID NO 29的轻链和SEQ ID NO 26的重链；或SEQ ID NO 30的轻链和SEQ ID NO :27的重链。在本发明的另一方面，抗体包含SEQ ID NO J8的两条轻链和SEQ ID NO: 25的两条重链，或包含SEQ ID NO : 的两条轻链和SEQ ID NO J6的两条重链；或包含SEQ ID NO 30的两条轻链和SEQ ID NO 27的两条重链。此类抗体的FLT3结合片段是本发明 的部分。本发明还涉及编码此类抗体的分离的DNA和其部分。本发明的其他方面包括包 含编码所述抗体或其片段的核苷酸序列的分离的多核苷酸；包含连接到表达序列的所述核 苷酸序列的表达载体或者包含所述表达载体的重组宿主细胞或重组宿主细胞或其后代，其 中该细胞表达所述抗体或其片段。本发明的再一个方面是产生或纯化抗体或其片段的方 法，包括在允许表达所述抗体或其片段的条件下培养所述细胞。此外，本发明涉及抑制哺乳动物中癌细胞生长的方法和治疗哺乳动物中白血病的方法，包括施用有效量的抗体。本发明的抗体可用于治疗瘤性疾病，包括实体瘤和非实体 瘤，和用于治疗白血病。本发明的一方面是使用前述抗体或其片段作为药物。在再一方面， 前述抗体或其片段将用于治疗癌症，包括但不限于白血病。本发明还提供了本发明抗体用 于生产治疗癌症的药物的用途。在优选实施方案中，癌症是白血病。本发明的抗体可以单独使用或与抗肿瘤剂或治疗组合使用。本发明的一方面是使 用前述抗体与额外的抗癌剂或治疗的组合。在再一方面，抗癌剂是甲氨蝶呤。天然发生的抗体通常具有两条相同的重链和两条相同的轻链，每条轻链通过链间 二硫键共价连接到重链。多个二硫键进一步将两条重链相互连接。工程化的抗体可以包含 对天然发生的抗体的结构和/或形式的多种改变。如本文所用，术语“抗体”包括免疫球蛋 白分子，其包含4条多肽链通过二硫键连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。各链可以折 叠成具有相似大小(110-125个氨基酸)和结构，但是具有不同功能的结构域。轻链可包含一个可变结构域(本文缩写为VL)和/或一个恒定结构域(本文缩写 为CL)。抗体(免疫球蛋白)的轻链是κ或λ轻链。本文使用的表述VL旨在包括κ型 轻链(Vk)禾Π λ型轻链(νλ)的可变区。轻链恒定区由一个结构域CL构成。重链也可包含一个可变结构域(本文缩写为VH)和/或根据抗体的类别或同种 型，三个或四个恒定结构域(CHI、CH2、CH3和CH4)(本文总体缩写为CH)。在人类中，该同 种型IgA, IgD, IgE, IgG和IgM, IgA和IgG进一步又分为亚类或亚型(IgA1^2和IgG1J。本 发明包括任意上述类型或亚类的抗体。人IgG1是本发明抗体的优选同种型。通常，该可变结构域在不同抗体之间显示相当多的氨基酸序列可变性，特别是在 抗原结合部位处。在每个VL和VH中发现称为高可变区或者互补决定区(这里缩写为CDR) 的三个区域，其由称为构架可变区(这里缩写为FR)的较少可变的区域所支持(support)。 根据Kabat 规则(Kabat 等人Ann. NY Acad. Sci. 190 :382-93(1971) ；Kabat，等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版，U. S. Department of Health 禾口 Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)或 Chothia 规则(C. Chothia and A. M. Lesk, J. Mol. Biol. 196 (4) :901-917 (1987) ·) (A. Martin, http: //www. bioinf. org. uk/ abs/chothia. html))将氨基酸分配给特定CDR区域或结构域。每个VH和VL由三个CDR和 四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列FRI-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。由VL和VH结构域组成的抗体的部分称为Fv(Fragment variable)并构成抗原 结合部位。单链Fv(SCFV)是在一条多肽链上含有VL结构域和VH结构域的抗体片段， 其中一个结构域的N端和另一个结构域的C端通过柔性接头相连(参见，例如美国专利 No. 4，946, 778 (Ladner 等人)；W088/09344，(Huston 等人)；WO 92/01047 (McCafferty 等 人)描述了 scFv片段在可溶性重组遗传展示包(比如噬菌体)表面上的展示。用于产生单链抗体的肽接头可以是柔性肽，其经选择以确保VL和VH结构域发生 正确的三维折叠和结合。该接头一般为10至50个氨基酸残基。优选地，该接头一般为10 至30个氨基酸残基。更优选地，该接头一般为12至30个氨基酸残基。最优选是15至25 个氨基酸残基的接头。这些接头肽的非限制性实例是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。“分离的抗体”是(1)从组分的混合中部分、基本上或完全纯化的抗体；( 已从 组分的天然环境中鉴定和分离和/或回收的抗体；(3)单克隆抗体；(4)不含来自相同物种 的其他蛋白质的抗体；(5)由来自不同物种的细胞表达的抗体；或者(6)自然界不存在的抗体。其天然环境的杂质组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，其可包括酶、激素及其 他蛋白质或非蛋白质溶质。分离抗体的实例包括已经亲合纯化的抗体，由杂交瘤或其他细 胞系体外产生的抗体，以及来自于转基因小鼠的人抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”指获得自基本上同质的抗体群体的抗体，例如，包 含基本上相同的各个抗体的群体，可能存在的可能天然突变或者次要翻译后变化除外。单 克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点(也称为决定簇或表位)。此外，与通常包括 针对不同决定簇的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上 的单个决定簇。修饰形式“单克隆的”表示获得自基本上同质的抗体群体的抗体特性，并且 不被视为需要通过任何特定方法生产抗体。如本文所用的术语“人抗体”包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒 定区的抗体(如Kabat，等人，上文和Chothia等人，上文中所述)。本发明的人抗体可包含 不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外随机或位点特异性诱变引入或 者体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。人抗体可具有至少一个由氨基酸残基替换 的位置，例如不由人种系免疫球蛋白序列编码的活性增强的氨基酸残基。但是，本文使用的 术语“人抗体”不旨在包括其中来自于另一个哺乳动物物种种系(例如小鼠)的CDR序列 移植于人构架序列上的抗体。短语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用 转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，分离自重组、组合人抗体文库的抗体，分离 自对人免疫球蛋白基因转基因的动物的抗体，或者通过包括将人免疫球蛋白基因序列与其 他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有来自 于人种系源免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat等人，见上文和Chothia等人， 见上文)。Fc (片段结晶区)是由成对重链恒定结构域组成的抗体部分或片段的名称。在IgG 抗体中，例如，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc还包含CH4结构域。Fc与 Fc受体结合、补体介导的细胞毒性(CMC)和ADCC的活化相关联。对于作为多个IgG样蛋白 质复合物的诸如IgA和IgM的抗体，复合物形成需要Fc恒定结构域。因此，本发明的抗体包括但不限于天然抗体、抗体、人抗体、人源化抗体、重组人抗 体、单克隆抗体、其消化片段、特定部分和变体，包括抗体模似物或者包含模拟抗体或其特 定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分；其各自含有至少一个CDR。功能性片段包括结 合FLT3抗原的抗原结合片段。例如，本发明所涵盖的能够结合FLT3或其部分的抗体片段 包括二价片段例如具有完整链内二硫键的(Fab' )2，单价片段例如Fab (抗原结合片段)， 其表示由VL、CL、VL、CHl结构域组成并且未保留重链铰链区(例如通过木瓜蛋白酶消化) 的抗体片段，保留重链绞链区的fabs，facb(例如通过纤维蛋白溶酶消化)，F(ab' )2，缺少 二硫键的Fab' ,pFc'(例如通过胃蛋白酶或纤维蛋白溶酶消化)，Fd(例如通过胃蛋白酶 消化，部分还原和再聚集)以及Fv或scFv(例如通过分子生物学技术)。抗体片段还旨在 包括，例如结构域缺失的抗体、线性抗体、单链抗体、scFv、单结构域抗体、多价单链抗体、由 抗体片段形成的多特异性抗体，包括特异性结合抗原的双抗体、三抗体等。绞链区将抗体的Fab和Fc部分分开，提供了 Fab彼此之间以及相对于Fc的可动 性，以及包括多个二硫键用以两个重链的共价连接。
已经开发了保留结合特异性，但是具有希望的其他特征，包括例如双特异性、多价 (多于两个结合位点)和紧凑尺寸(例如仅仅结合结构域)的抗体形式。本发明的抗体是FLT3特异性的。抗体特异性指抗体选择性识别抗原的特定表位。 例如，本发明的抗体可以是单特异性的或双特异性的。双特异性抗体(BsAb)是具有两种不 同抗原结合特异性或位点的抗体。在抗体具有超过一种的特异性时，所识别的表位可以与 单个抗原或者与多于一个的抗原相关联。因此，本发明提供了结合两种不同抗原的双特异 性抗体，其具有至少一种对FLT3的特异性。如上所述，此类抗体包括其任何片段。可以根据亲和力和/或亲合力确定本抗体或其片段对FLT3的特异性。由抗原与 抗体解离的平衡常数(Kd)代表的亲和力度量抗原决定簇与抗体结合部位之间的结合强度。本发明的抗体或其片段结合到FLT3的表位，该表位可以包含FLT3的五个细胞外 结构域区段(下文中简称为“结构域”或“ECD”)，S卩D1、D2、D3、D4和D5的任一个。本发明 的抗体或其片段结合的表位在结构域D4或D5内。抗体EBlO和D4-3结合到FLT3的结构 域4内的表位，而NC7结合到FLT3的结构域5内的表位。如本文所用的术语“表位”指被 本发明抗体识别的抗原上的分散的三维位点。表位是复杂抗原上的免疫活性区域，实际结 合B细胞受体的区域，并且实际上被B细胞产生的抗体分子结合。抗原通常含有至少一个 表位并且通常多于一个表位。蛋白质抗原上的表位可以是线性或非线性的。线性表位是包 含蛋白质氨基酸序列中连续氨基酸残基的那些表位。线性表位可以需要或不需要构象折叠 以形成天然的三维结构并引起免疫应答，该免疫应答产生对所述抗原具有结合特异性的抗 体。非线性表位包含非连续的氨基酸残基。从而，非线性表位需要一定程度的蛋白质折叠 来使必要的氨基酸残基相互接近，以形成天然的三维结构并引起免疫应答，该免疫应答产 生对所述抗原具有结合特异性的抗体。本发明的抗体或其片段结合野生型或突变的FLT3。FLT3，例如，突变或野生型的 FLT3经常在AML和ALL以及其他白血病中表达。它在约三分之一的急性AML患者中突变， 该突变是由于近膜域的内部串联重复(ITD)或者由于通常涉及激酶结构域(KD)的点突变 引起。两种类型的突变都组成型活化FLT3。除了干扰FLT3信号转导，抗FLT3抗体还诱导 ADCC，作为诱导细胞毒性的额外机理。本发明的抗体或其片段还包括通过定向突变；亲合力成熟、噬菌体展示或者链改 组(chain shuffling)的方法修饰或改善结合特征的那些。可通过突变⑶R和/或FW残 基和筛选具有所需特征的抗体结合部位来修饰或改善亲和力和特异性(参见，例如Yang等 人，J. Mol. Biol. ,254 :392-403 (199 )。CDR以多种方式突变。一种方式是将各个残基或残 基组合随机化，使得在否则相同的抗体结合部位的群体中，二到二十种氨基酸的子集存在 于特定位置上。备选地，可以通过易错PCR方法在残基范围内诱导突变(参见例如Hawkins 等人，J. Mol. Biol. 226 :889-96(1992)).。在另一实例中，含有重链和轻链可变区基因的噬 菌体展示载体可以在大肠杆菌(E. coli)突变体菌株中增殖(参见，例如Low等人，J. Mol. Biol.，250 :359-368(1996))。这些诱变方法是本领域技术人员已知的许多方法的示例。产生替代变体的一种便利方法是使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，突变几 个CDR区域的位点，产生每个位点所有可能的氨基酸替代。由此产生的抗体变体作为在每 个颗粒中包装的与M13的基因III产物的融合物以单价形式展示于丝状噬菌体颗粒。然后， 针对本文公开的生物学活性(例如结合亲和力、特异性、IC50、EC50、Kd)筛选噬菌体展示变体。为了鉴定用于修饰的候选CDR区域位点，可进行丙氨酸扫描诱变，以鉴定对抗原结合有 显著贡献的CDR区域残基。备选地或者另外地，可在一个或多个残基位置对一个或多个CDR 序列进行随机诱变，而⑶R有效连接可变区或者⑶R独立于其他可变区序列，然后使用重组 DNA技术将改变的⑶R回复到可变区。一旦产生并表达这些变体抗体，如本文所述对变体组 进行筛选，可选择在一个或多个相关测定中具有优越性能的抗体用以进一步开发。除了本文具体描述的抗体之外，可利用本领域技术人员公知的多种重组DNA技术 容易地设计和生产其他“基本上均勻的”经修饰抗体。例如，构架区在一级结构水平上可与 天然序列相差数个氨基酸替代、末端和中间添加和缺失等。此外，多种不同的人构架区可单 独或组合用作本发明人源化免疫球蛋白的基础。一般说来，基因的修饰可通过多种公知技 术例如位点定向诱变容易地实现。本发明包括FLT3结合多肽，其具有基本上与该全长抗FLT3抗体的可变区或高变 区所述的氨基酸序列相同的氨基酸序列。基本上相同的氨基酸序列在本文中定义为与另一 个氨基酸序列有至少70 %，优选至少约80 %，更优选至少约90 %同源性，如根据Pearson和 Lipman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :2444-8(1988))的 FASTA 检索方法所确定的。此夕卜， 本发明包括保守氨基酸替代，其保留当前公开的抗体的功能特征。本发明包括编码抗FLT3抗体重链的核酸序列，其包含本文公开的任一 VH区或其 部分，或者任一 VH CDR，包括其任何变体。本发明也包括编码抗FLT3抗体轻链的核酸分子， 其包含本文公开的任一 VL区或其部分，或者任一 VL⑶R，包括其任何变体。本发明抗体的每个结构域可以是具有重链或轻链可变结构域的完整抗体，或者可 以是功能等同物或者天然结构域的突变体或衍生物，或者构建的合成结构域，例如体外使 用例如WO 93/11236 (Griffiths等人)所述的技术。例如，可能将缺少至少一个氨基酸的 对应于抗体可变结构域的结构域连接在一起。还包括具有CDR序列之一中一个或多个氨基 酸替代、突变或缺失的抗体。重要特征性特点是每个结构域与互补结构域相关联形成抗原 结合部位的能力。因此，术语可变重链和轻链片段不应解释为排除不具有对特异性有实质 作用的物质的变体，包括CDR的变体。本发明的抗体可以通过本领域已知的方法产生。这些方法包括Kohler和 Milstein, Nature 256 :495-497(1975) UR Campbell, MonoclonalAntibody Technology, The Production and Characterization of Rodent andHuman Hybridomas,Burdon等人编Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，第13卷，Elsevier Science Publishers, Amsterdam(1985)所述的免疫学方法和 Huse 等人，Science 246 1275-1281(1989)所述的重组DNA方法。所述抗体也可以从噬菌体展示文库得到，该文库带 有scFv或Fab形式的VH和VL结构域的组合。VH和VL结构域可以由合成的、部分合成的 或者天然得到的核苷酸编码。在一些实施方案中，可以优选带有人抗体片段的噬菌体展示 文库。人抗体的其他来源是经改造而表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。可通过切割整个抗体或者通过表达编码该片段的DNA来产生抗体片段。可通 过 Lamoyi 等人，J. Immunol. Methods 56 :235-243(1983)禾口 Parham，J. Immunol. 131 2895-2902(1983)所述的方法制备抗体片段。这些片段可含有一个或两个Fab片段或者 F(ab' )2片段。这些片段还可含有单链片段可变区抗体，即scFv、双抗体或者其他抗体片 段。产生这些功能等同物的方法公开于PCT申请WO 93/21319、欧洲专利申请号239，400;PCT申请WO 89/09622 ；欧洲专利申请338，745 ；以及欧洲专利申请EP 332,424。在说明书 全文中，无论是否特别指出，本发明的术语“抗体”包括其任何片段。用于转化载体和表达本发明抗体的优选宿主细胞是哺乳动物细胞，例如NSO细胞 (非分泌(0)小鼠骨髓瘤细胞)、293和CHO细胞以及其他淋巴来源的细胞系，例如淋巴瘤、 骨髓瘤或杂交瘤细胞。可备选使用其他真核宿主，例如酵母。本发明提供了对FLT3特异的分离的抗体或其片段。本发明的抗体能够具有一种 或多种下面的活性1)展示对FLT3的高亲和性结合；2)阻断配体与FLT3受体的结合，从而 抑制FLT3的活化和其信号途径；幻诱导细胞表面FLT3的快速和有效内化和下调；4)抑制 白血病中野生型FLT3和MPK、PI3K和STAT5途径的下游激酶的LF诱导的磷酸化力)在人 体中展示降低的免疫原性；6)展示提高的活化下游免疫效应功能如抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)的能力；7)诱导FLT3受体内化和8)在体外和体内抑制肿瘤生长。在本发明的一方 面，本发明的抗FLT3抗体是显示一种或多种下面性质(在说明书全文包括实施例中进一步 阐明)的人抗体⑴抑制FLT3配体(FL)与野生型FLT3的结合；(ii)抑制FL与内部串联重复突变FLT3 (FLT3-ITD)的结合；(iii)结合到FLT3的结构域4和/或结构域5内的表位；(iv)中和 FLT3 的 FL 活化；(ν)独立于FL中和FLT3活化；(vi)ADCC 的介导；(vii)FLT3 的内化;(viii)表面FLT3的减少；或(ix)以不大于约 4. 5 X IO-10M 的 Kd 结合 FLT3。本发明的抗体结合到FLT3的外部结构域并且抑制FL与FLT3的结合。例如，通过 直接结合测定法，使用纯化的或膜结合的受体可以测定抑制。在一个实施方案中，本发明的 抗体或其片段优选至少与FLT3的天然配体一样强地结合FLT3。本发明的抗体中和FLT3。中和通过多种机理发生。一种此类机理是FL结合到FLT3 的细胞外结构域，其刺激β亚基的自磷酸化和FLT3的底物，包括下游途径STAT5、Akt、PI3K 和MAH(的磷酸化。FLT3的中和也包括通常与信号转导有关的一种或多种这些活性的抑制、 减少、失活和/或破坏。此外，中和包括FLT3异二聚体以及FLT3同二聚体的抑制。因此， 中和FLT3具有多种效应，包括生长(增殖和分化)、血管发生(血管募集、侵入和转移)和 细胞运动性和转移(细胞粘附和侵入)的抑制、减少、失活和/或破坏。通过经由但不限于 所公开的多种机理中和FLT3，本发明的抗体降低了 FLT3激酶活性，从而抑制疾病发展。FLT3中和的一种测量是抑制受体的酪氨酸激酶活性。使用公知的方法，例如，通 过测量重组激酶受体的自磷酸化水平，和/或天然或合成底物的磷酸化，可以测定酪氨酸 激酶抑制。从而，磷酸化测定法可用于测定本发明背景中的中和抗体。例如，使用在ELISA 测定中或在蛋白质印迹上对磷酸酪氨酸特异的抗体，可以检测磷酸化。酪氨酸激酶活性的 一些测定法在 Panek 等人，J. Pharmacol. Exp. Thera. 283 :1433-44(1997)和 Batley 等人， Life Sci. 62 =143-50(1998)中描述。本发明的抗体引起应答配体的细胞中FLT3的酪氨酸 磷酸化显著降低至少约60%、优选至少约75%，更优选至少约85-90%。
FLT3中和的另一种度量是抑制FLT3下游底物的磷酸化。因此，可以测量STAT5、 PI;3K、Akt或MAPK的磷酸化水平。此外，检测蛋白质表达的方法可以用于测定FLT3中和，其中被测量的蛋白质受到 FLT3酪氨酸激酶活性的调节。这些方法包括用于检测蛋白质表达的免疫组织化学(IHC)、 用于检测基因扩增的荧光原位杂交(FISH)、竞争性放射性配体结合测定法、固体基质印迹 技术，如RNA和DNA印迹、反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和ELISA。见，例如，Grandis 等人，Cancer 78 :1284-92(1996) ；Shimizu 等人，Japan J. CancerRes. 85 :567-71 (1994)； Sauter 等人，Am. J. Path. 148:1047-53(1996) ；Collins,Glia 15:289-96(1995) ；Radinsky 等人，Clin. Cancer Res. 1 19-31 (1995) ；Petrides 等人，Cancer Res. 50 :3934-39 (1990)； Hoffmann 等人，Anticancer Res. 17 :4419-26(1997) ；Wikstrand 等人，Cancer Res. 55 3140-48(1995)。体内测定法也可以用于测定FLT3中和。例如，通过促有丝分裂测定法，使用用受 体配体刺激的细胞系，在抑制剂存在和不存在下观察受体酪氨酸激酶抑制。一种方法涉及 测试表达FLT3的肿瘤细胞或者经转染而表达FLT3的细胞的生长抑制。也可以使用肿瘤模 型，如注射到小鼠中的人肿瘤细胞观察抑制。本发明不限于FLT3中和的任何具体机理。本发明的抗FLT3抗体可以(1)外在地 结合到FLT3细胞表面受体，(2)阻断与FL的结合和随后通过受体相关的酪氨酸激酶介导 的信号转导，和(3)防止该信号转导级联中FLT3和其他下游蛋白质的磷酸化。在另一实施方案中，本发明的抗体下调FLT3。细胞表面上存在的FLT3的量取决于 受体蛋白质产生、内化和降解。细胞表面上存在的FLT3的量可以通过检测受体或结合到受 体的分子的内化而直接测量。例如，可以通过将表达FLT3的细胞与经标记的抗体接触或用 该抗体包被来测定受体内化。然后剥离、收集并计数膜结合的抗体。通过裂解细胞并检测 经标记的组分来测定抗体的内化。通过用抗FLT3抗体或其他物质处理后测量细胞上存在的受体的量，例如，通过对 经染色细胞进行荧光激活细胞分选分析FLT3的表面表达，可以直接测量细胞表面上存在 的FLT3的量。将染色细胞温育并随时间测量荧光强度。作为对照，可以在受体内化停止的 条件下温育部分被染色群体。如下面的实施例中所述，可以使用对FLT3特异并且不阻断或竞争被测试抗体结 合的不同抗体检测和测量细胞表面FLT3(Burtrum，等人，Cancer Res. 63 =8912-21 (2003)) 在一个实施方案中，用本发明抗体处理表达FLT3的细胞导致细胞表面FLT3的减少。下调的另一度量是细胞中存在的总受体蛋白质的减少，并且反映了内部受体的降 解。因此，用本发明抗体的处理细胞(尤其癌细胞)导致总细胞FLT3的显著减少。本发明的抗体抑制肿瘤生长。例如，通过向免疫缺陷小鼠注射癌细胞系的细胞可 以建立皮下异种移植物肿瘤。然后通过腹膜内注射抗体处理小鼠并以规则间隔测量肿瘤大 小。与对照注射相比，本发明的抗体抑制肿瘤生长。在一个实施方案中，本发明的抗体当 与抗肿瘤剂组合时促进肿瘤消退。在另一实施方案中，本发明的抗体当以单一疗法使用时 促进肿瘤消退。促进肿瘤消退指施用有效量的抗体或有效量的抗体和抗肿瘤剂的组合导致 肿瘤尺寸的减小或肿瘤坏死。肿瘤消退可以作为经历具体治疗方案的受试者组的平均值测 量，或者可以通过肿瘤消退的治疗组中受试者数目来测量。
本发明的抗体可通过本领域中任何已知方法分离或纯化，包括通过硫酸铵或硫酸 钠沉淀，然后对盐水进行透析；离子交换层析；亲和或免疫亲和层析以及凝胶过滤或区带 电泳。本发明抗体的优选纯化方法是蛋白A亲和层析。编码人抗体的DNA可通过重组除了⑶R之外的编码基本上或排他地来源于对应人 抗体区域的人恒定区和可变区的DNA以及编码来源于人的CDR的DNA来制备。编码抗体片段的合适DNA来源包括表达全长抗体的任何细胞，例如杂交瘤和脾细 胞。该片段本身可用作抗体等同物，或者可重组为如上所述的等同物。该部分中所述的DNA 缺失、重组和其他技术可通过公知方法进行。如本领域中已知的，另一个DNA来源是抗体的 噬菌体展示文库。本发明举例的抗体通过噬菌体展示技术制备。另外，本发明提供了含有与表达序列、启动子和增强子序列有效连接的上述多核 苷酸序列的表达载体。已经开发了用于在原核体系(例如细菌)和真核体系(包括但不限 于酵母和哺乳动物细胞培养体系)中有效合成抗体多肽的多种表达载体。本发明的载体可 包含染色体区段、非染色体和合成DNA序列。可使用任何合适的表达载体。例如，原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒，例如 colEl，pCRl，pBR322, pMB9, pUC，pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA的衍生物例如 M13以及其他丝状单链DNA噬菌体。可用于酵母的载体实例有2 μ质粒。用于在哺乳动物 细胞中表达的合适载体包括公知的SV-40衍生物、腺病毒、反转录病毒来源的DNA序列和来 源于功能性哺乳动物载体组合的穿梭载体，例如上文所述的那些，以及功能性质粒和噬菌 体 DNA。其他真核表达载体是本领域中已知的(例如P. J. Southern和P.Berg，J. Mol. App 1. Genet. 1 :327-41 (1982) ；Subramani 等人，Mol. Cell. Biol. 1 :854-64 (1981)； Kaufmann and Sharp, J.Mol. Biol. 159 :601-21(1982) ；Kaufmann 禾口 Sharp，Mol. Cell. Biol. 159 :601-64(1982) ；Scahill ^ 人，Proc. Nat ' I Acad. Sci. 80 :4654-59(1983)； Urlaub 和 Chasin，Proc. Nat' 1 Acad. Sci. 77 :4216-20(1980))。可用于本发明的表达载体含有至少一个表达控制序列，其有效连接待表达的DNA 序列或片段。将控制序列插入载体，以控制和调节所克隆的DNA序列的表达。可用的表达 控制序列实例有Iac系统、trp系统、tac系统、trc系统、λ噬菌体的主要操纵基因和启动 子区域、fd衣壳蛋白的控制区、酵母糖酵解启动子例如3-磷酸甘油酸激酶、酵母酸性磷酸 酶启动子例如Wio5、酵母α交配因子启动子、以及来源于多瘤病毒、腺病毒、反转录病毒和 猿猴病毒的启动子例如早期和晚期启动子或SV40，以及已知控制基因在原核或真核细胞以 及它们的病毒表达的其他序列或者其组合。当希望在酵母中表达基因构建体时，用于酵母的合适选择基因是在酵母质粒YRp7 中存在的 trpl 基因。Stinchcomb 等人 Nature，282 :39(1979) ；Kingsman 等人，Gene, 7 141(1979)。trpl基因提供了缺少在色氨酸中生长的能力的突变酵母菌株的选择标记，例如 ATCC No. 44076 或 PEP4-1。Jones，Genetics，85 12 (1977)。因此，酵母宿主细胞基因组中 trpl损伤的存在提供了用于通过在缺乏色氨酸时生长检测转化的有效环境。类似地，Leu2 缺乏酵母菌株(ATCC 20，622或38，6 )由带有Leu2基因的已知质粒来补偿。本发明还提供了含有上述表达载体的重组宿主细胞。本发明抗体可在杂交瘤之外 的细胞系中表达。包含编码本发明多肽的序列的核酸可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。根据高水平表达、组成型表达目的蛋白质以及来自宿主蛋白质的最少的污染来选 择具体的细胞系。可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，包括许多永生化细 胞系，例如但不限于C0S-7细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和许多其 他细胞，包括淋巴来源的细胞系，如淋巴瘤、骨髓瘤或杂交瘤细胞。其他合适真核细胞包 括酵母及其他真菌。可用的原核宿主包括，例如大肠杆菌，例如大肠杆菌SG-936、大肠杆 菌HB 101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2^2、大肠杆菌DHI和大肠杆菌 MRC1，假单胞菌属O^seudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)禾口链霉菌属(Streptomyces)。这些重组宿主细胞可用于产生抗体或其片段，其通过在允许该抗体或其片段表 达的条件下培养该细胞以及从该宿主细胞或宿主细胞周围的培养基中纯化该抗体或其片 段来进行。可通过在目的抗体编码基因的5’端插入信号或分泌前导肽编码序列来利于 所表达的抗体或片段在重组宿主细胞中靶向分泌(参见，Shokri等人，Appl Microbiol Biotechnol. 60 :654-64(2003) ；Nielsen 等人，Prot. Eng. 10:1-6(1997)；和 von Heinje 等 人，Nucl. AcidsRes. 14 :4683-90 (1986))。这些分泌前导肽成分可来源于原核或真核序列。 因此，适当地使用分泌前导肽，连接于多肽N端的氨基酸，以引导多肽从宿主细胞胞质溶胶 中移出并分泌进入培养基。转化的宿主细胞通过本领域中已知的方法培养于含有可同化碳源(糖类例如葡 萄糖或乳糖)、氮源(氨基酸、肽、蛋白质或其降解产物例如蛋白胨、铵盐等)以及无机盐 (钠、钾、镁和钙的硫酸盐、磷酸盐和/或碳酸盐)的液体培养基中。该培养基还含有，例如， 生长促进物质，例如微量元素，例如铁、锌、锰等。本发明的抗体可以与另外的氨基酸残基融合。这些氨基酸残基可以是肽标签，可 能便于分离。还可考虑其他使得该抗体归巢到具体器官或组织的氨基酸残基。制备本发明抗体的另一个实施方案是在转基因动物中表达编码本发明抗体的核 酸，该转基因动物具有插入的人抗体产生基因组的实质部分并且缺乏内源抗体的产生。转 基因动物包括但不限于小鼠、山羊和兔。本发明的另一个实施方案包括在例如动物乳腺中 表达抗体编码基因，从而在哺乳过程中分泌该多肽。如下面的实施例中所述，可以从自人重链和轻链可变区基因构建的噬菌体展示文 库分离本发明的高亲和力抗FLT3抗体。例如，可以从含有重排的可变区基因的外周血淋巴 细胞得到本发明的可变结构域。备选地，可变结构域部分，如CDR和FW区可以来自不同的 人序列。三轮选择后超过90%的回收克隆对FLT3是特异的。对筛选的Fab的FLT3的结合 亲和力可以在nM范围内，其与使用杂交瘤技术产生的许多二价抗FLT3单克隆抗体一样高。本发明的抗体可以例如从自然发生的抗体或Fab或SCFv噬菌体展示文库得到。通 过从天然发生的抗体或杂交瘤选择VH或VL结构域或从VH结构域文库或VL结构域文库选 择可以得到单结构域抗体。可以理解为单结构域抗体结合的主要决定簇的氨基酸残基可以 在Kabat或Chothia定义的⑶R内，但是也可以包括其他残基，如否则将埋藏在VH-VL异二 聚体的VH-VL界面中的残基。本发明的抗体还包括通过定向突变；亲合力成熟、噬菌体展示或者链改组(chain shuffling)的方法改善结合特征的那些。可通过突变CDR和筛选具有所需特征的抗体结合部位来修饰或改善亲合力和特异性(参见，例如Yang等人，J. Mol. Biol. ,254 392-403(1995))。CDR以多种方式突变。一种方式是将各个残基或残基组合随机化，使得在 否则相同的抗体结合部位的群体中，所有二十种氨基酸存在于特定位置上。作为替代地，可 以通过易错PCR方法在⑶R残基范围内诱导突变(参见例如Hawkins等人，J. Mol. Biol.， 226 :889-896(1992)).例如，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆 菌(E. coli)突变体菌株中扩增(参见，例如Low等人，J. Mol. Biol.，250 :359-368 (1996))。 这些诱变方法是本领域技术人员已知的许多方法中的示例。用于鉴定本发明的FLT3结合抗体的蛋白质优选为FLT3，更优选为FLT3的胞外结 构域。FLT3胞外结构域可以为游离的或者缀合到另一分子。本发明的抗体可以融合到额外的氨基酸残基。此类氨基酸残基可以是肽标记，可 能方便分离。也预期用于将抗体归巢到特定器官或组织的其他氨基酸残基。在本发明的另一方面，抗FLT3抑制剂，包括但不限于本发明的抗体，可以与抗肿 瘤剂或抗血管发生剂或者可检测的信号产生剂结合施用或者通过化学或生物合成方法连 接后施用。如下文示例，本发明的抗体当结合到带有FLT3的细胞时被有效内化。与抗体结 合或缀合或连接施用的抗肿瘤剂包括任何物质，其破坏或损害抗体已经结合的肿瘤或者在 抗体已经结合的细胞环境中的肿瘤。一方面，抗FLT3抑制剂，包括本发明抗体，可以作为缀 合物施用，该缀合物特异结合受体并在配体-毒素内化后递送毒素。另一方面，FLT3抑制 剂-抗肿瘤剂缀合物可以直接相互连接或者通过街头、肽或非肽结合。例如，抗肿瘤剂是 毒性剂，如化学治疗剂或放射性同位素。合适的抗肿瘤剂是本领域技术人员已知的并且包 括蒽环类抗生素(例如，道诺霉素和阿霉素hauristatin、甲氨蝶呤(MTX)、长春地辛、新 制癌菌素、顺钼、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、苯丙氨酸氮芥、蓖麻毒蛋白和加利车 霉素。使用常规方法将化学治疗剂缀合到抑制剂、抗体或小分子(见例如，Hermentin and Seller, Behring Inst. Mitt. 82 :197-215 (1988))。在一方面，MTX 是本发明的优选抗肿瘤 剂。本发明还设想连接到靶标或报道分子部分的抗FLT3抗体，所述靶标或报道分子 部分包括例如仅仅抗肿瘤剂、其他抗体或报道分子，如诊断系统中的放射性标记的同位素， 其中可检测的信号产生物质缀合到抗体。可检测的信号产生物质可在体内和体外用于诊断目的。信号产生物质产生可测量 的信号，其通过外部手段，通常通过测量电磁辐射可以检测。通常，信号产生物质是酶或生 色团，或通过荧光、磷光或化学发光而发射。生色团包括在紫外或可见区吸收光的染料，并 且可以是底物或酶催化的反应的降解产物。本发明还设想连接靶标或报道分子部分的抗FLT3抗体。靶标部分是结合对的第 一个成员。例如，抗肿瘤剂缀合到这种对的第二个成员，并从而被导向抗FLT3抗体结合的 部位。此类结合对的常见实例是抗生物素蛋白和生物素。在优选实施方案中，生物素缀合 到抗FLT3抗体，从而提供抗肿瘤剂或其他部分的靶标，所述肿瘤剂或其他部分缀合到抗生 物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。备选地，生物素或另一此类部分连接到本发明的抗FLT3抗 体并用作例如诊断系统中的报道分子，其中可检测的信号产生剂缀合到抗生物素蛋白或链 霉抗生物素蛋白。用作抗肿瘤剂的合适的放射性同位素也是本领域技术人员已知的。例如，使用mI或mAt。使用常规技术将这些同位素连接到抗体(见例如，Pedley等人，Br. J. Cancer 68 69-73(1993))。备选地，连接到抗体的抗肿瘤剂是活化前体药物的酶。这样，施用前体药 物，其保持无活性形式直到到达肿瘤部位，在那里一旦施用抗体复合体，它就被转化为其细 胞毒素形式。实践中，将抗体-酶缀合物施用于患者并允许定位于待治疗的组织区中。然 后对患者施用前体药物使得在待治疗的组织区域中发生细胞毒性药物的转化。备选地，缀 合到抗体的抗肿瘤剂是细胞因子，如白介素-2(IL1)、白介素-4(IL-4)或肿瘤坏死因子 α (TNF-α)。抗体将细胞因子靶向肿瘤使得细胞因子介导肿瘤的破坏或损坏而不影响其他 组织。使用常规重组DNA技术，将细胞因子在DNA水平上融合到抗体。本发明还提供了通过对哺乳动物施用有效量的如前述的抗体来治疗哺乳动物中 肿瘤生长的方法。根据本发明待治疗的合适条件涉及优选表达FLT3的细胞。不希望限于 任何具体机理，本发明方法提供了治疗癌细胞生长，包括FLT3刺激的肿瘤生长、器官移植 排斥或免疫疾病如自身免疫病。本发明上下文中的“治疗”指治疗性处理，包括抑制、减缓、减轻或逆转与疾病或病 症相关的下列病症或非预期生理变化的进程，改善病症的临床症状或者预防病症临床症状 的出现。有益或希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病或障碍程度的降低或者疾 病或障碍稳定(即，疾病或障碍不恶化)、疾病或障碍发展延迟或减缓、疾病或障碍的改善 或缓和、以及疾病或障碍的缓解(部分或全部)，不论是可检出的或不可检出的。“治疗”还 可表示，与未接受治疗时的预期存活相比，存活延长。需要治疗的包括已患疾病的那些。在 一个实施方案中，本发明可用作药物。待治疗的一种前癌状况是骨髓增生异常综合征。其他待治疗的癌包括但不限于血 液恶性肿瘤，如白血病，如原始细胞危象中的AML、ALL和CML等等。其他白血病包括表9中 的那些，其列出了从所选的白血病细胞系的EBlO染色得到的所选人白血病细胞系中FLT3 的表达。癌症也可以是实体瘤，如甲状腺或者脑肿瘤。在本发明方法中，向有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明抗体。用于治 疗本文该疾病的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而不同，所述因素包括施用方 式、目标部位、患者生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是治疗性的还 是预防性的。本文使用的术语施用表示通过可实现所追求结果的任何方法将本发明抗体递 送至哺乳动物。它们可通过例如静脉内或肌内施用。尽管本发明的人抗体特别适合用于 施用给人，但是它们也可施用给其他哺乳动物。本文使用的术语哺乳动物旨在包括但不限 于人、实验动物、家庭宠物和家畜。治疗有效量表示在施用给哺乳动物时有效产生所需治 疗作用例如抑制肿瘤生长的本发明抗体量。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定 (titrate)治疗剂量，以优化安全性和有效性。本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”的本发明抗FLT3抗体。“治疗有效量” 表示在给药时以及所需的时间段内有效实现所需治疗结果的量。抗体的治疗有效量可根据 例如下列因素而变化，该因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部 分在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也为其治疗有益作用超过了抗体或抗体部 分任何有毒或有害作用。可调节给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗或预防性应 答)。以足以抑制或减少肿瘤或病理状态发展的量，向有需要的患者施用本发明的抗FLT3抗体用于治疗性治疗。发展包括，例如肿瘤或病理状况的生长、侵袭、转移和/或复发。 足以实现这些的量定义为治疗有效剂量。有效实现此用途的量将取决于疾病的严重程度和 患者自身免疫系统的整体状态。给药方案也会随着疾病状态和患者状态的变化而变化，通 常从单次浓注给药或连续输注至每天多次施用(例如每4-6小时)，或者根据给予治疗的医 生和患者状态所示。本发明抗体治疗有效量的示例性非限制性范围是0. l_50mg/kg，更优选 3-35mg/kg，更优选5-20mg/kg。给药量和频率将由治疗患者的医生来确定，可包括每天、每 周三次、每周、每两周一次或者频率更低地给予小于lmg/kg至高于100mg/kg的剂量。每次 施用的剂量可以在1-100、2-75或5-60mg/kg的范围内。然而，应当指出本发明不限于任何 特定的剂量。在备选实施方案中，本发明也包括抑制树突细胞活化或者成熟的方法，包括将树 突细胞与本发明的抗体单独或者与其他物质的组合接触。本发明的另一方法包括预防器官 移植排斥或治疗自身免疫病，如多发性硬化或脑炎，包括施用仅仅本发明的抗体或与其他 物质的组合。在本发明的一个实施方案中，抗FLT3抗体可以与一种或多种其他抗肿瘤剂组合 施用。对于组合疗法的实例，见例如，美国专利号6，217，866 Gchlessinger等人，Anti-EGFR antibodies in combination withanti-neoplastic agents) ；WO 99/60023 (Waksal 等人， Anti-EGFRantibodies in combination with radiation)。可以使用任何合适的抗肿瘤齐[J, 如化学治疗剂、放射或其组合。本领域当前已知或者被评估的抗肿瘤剂可以被分成多种类别，包括例如，有丝分 裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异 构酶抑制剂、抗存活剂、生物应答调节剂、抗激素、和抗血管发生剂。烷化剂的实例包括但 不限于，顺钼、环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥和达卡巴嗪。抗代谢物的实例包括但不限于，阿糖 胞苷、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、吉西他滨、ALJMTA 和拓扑异构酶抑制剂伊立替康 (CPT-Il)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f、拓扑替康(拓扑异构酶I)、依托泊苷(VP-16)，和 替尼泊苷(VM16)(拓扑异构酶II)。当该抗肿瘤剂是放射时，该放射的来源可以是在待治 疗患者的外部(外粒子束放射疗法(external beam radiation therapy-EBRT))或者内部 (近距离放射治疗(brachytherapy-BT))。所施用的抗肿瘤剂的剂量取决于多个因素，包括 例如药物类型、待治疗肿瘤类型和严重程度以及该药物的施用途径。然而应强调本发明不 限于任何特定的剂量。在本发明的一方面，MTX是与本发明抗体组合的待给予的优选抗肿瘤剂。本文提供 的数据阐明与MTX组合的抗FLT3抗体EBlO的协同作用。考虑到Furukawa等人(Leukemia 21 :1005-1014(2007))公开的体外工作，该组合是尤其新颖和出乎意料的，所述工作报导 了同时施用FLT3抑制剂H(C412与其他化学治疗剂(排除MTX)对FLT3白血病在临床上有 效。在本发明中，任何合适的方法或途径可以用于施用本发明的抗FLT3抗体和任选 地，共同施用抗肿瘤剂和/或其他受体的拮抗剂。在本发明的组合疗法中，抗FLT3抗体可以 在用另一药物开始治疗之前、期间或之后施用，所述药物包括例如，仅仅MTX，以及其任一组 合，即在开始抗肿瘤剂疗法之前和期间、之前和之后、期间和之后，或之前、期间和之后。例 如，抗FLT3抗体可以在开始放射疗法前1到30天、优选3到20天、更优选5到12天之间施用。在本发明的优选实施方案中，化学疗法与抗体疗法同时施用，更优选在抗体疗法随后 施用。在本发明的另一方面，任一 FLT3抑制剂可以与MTX组合用于治疗白血病。本发明的抗FLT3抗体可以与中和涉及肿瘤生长或血管发生的其他受体的抗体施 用。在本发明的一个实施方案中，抗FLT3抗体与特异结合EGFR的受体拮抗剂组合使用。此 类受体的另一实例是VEGFR。本发明的抗FLT3抗体可以与VEGFR拮抗剂组合使用。在额外 的备选实施方案中，FLT3抗体可以与一种或多种合适的佐剂组合施用，所述佐剂如细胞因 子(例如，IL-10和IL-13)或其他免疫刺激剂，如，但不限于，趋化因子、肿瘤相关的抗原和 肽。此外，这些刺激剂可以与MTX施用。然而，应该理解作为单一疗法，施用仅仅抗FLT3抗 体足够以治疗有效方式预防、抑制或减少肿瘤的发展。在本发明中，任何合适的方法或途径可以用于施用本发明的抗FLT3抗体，并且任 选地，共同施用抗肿瘤剂，如MTX和/或其他受体的拮抗剂。根据本发明利用的抗肿瘤剂方 案包括认为最适合治疗患者的肿瘤状况的任何方案。不同的恶性肿瘤，包括多种形式的白 血病可以需要使用特定抗肿瘤抗体和特定抗肿瘤剂，其将根据患者而定。施用途径包括例 如，经口、静脉内、腹膜内、皮下、鞘内或肌内施用。施用的拮抗剂剂量取决于多种因素，包括 例如，拮抗剂类型、被治疗的肿瘤的类型和严重性和拮抗剂的施用途径。然而，应该强调的 是，本发明不限于任何具体的施用方法或途径。应该理解本发明的抗FLT3抗体当为了预防或治疗目的用于哺乳动物中时，将以 组合物的形式施用，该组合物额外包含可药用的载体。合适的可药用的载体包括例如，水、 盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其组合的一种或多种。可药用的载体可以进 一步包含少量的辅助物质，如增湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强结合蛋白的货架期 或有效性。注射的组合物可以也是本领域公知的，经配制以在施用于哺乳动物后提供活性 成分的快速、持续或延迟的释放。本发明还包括用于抑制肿瘤生长和/或血管发生的药盒，其包含治疗有效量的人 抗FLT3抗体。本发明的另一实施方案包括用于抑制肿瘤生长和/或血管发生的药盒，其包 含治疗有效量的人抗FLT3抗体与MTX。药盒可以还含有涉及肿瘤发生或血管发生的另一 生长因子(例如，EGFR，VEGFR-l/Flt-1，VEGFR-2，PDGFR，NGFR,和FGFR)的任何合适的拮抗 剂。备选地或额外地，本发明的药盒可以还包含抗肿瘤剂。本发明上下文中合适的抗肿瘤 剂的实例已经在本文描述。本发明的药盒可以还包含佐剂，其实例已经在上文描述。此外，本发明的范围内包括本抗体在体内和体外用于本领域公知的研究或诊断方 法的用途。诊断方法包括试剂盒，其含有本发明的抗体。本发明的抗体以强于FLT3配体结合活性的结合强度结合FLT3，例如，具有约 200 X KT12M到500 X KT12M的KD。结合人FLT3_Fc融合蛋白的抗体的Kd为在25°C测定 为 0. 5X 1(Γ10Μ 到 5X 1(Γ10Μ ；优选的抗体以 1.0X 1(Γ10Μ 到 4. 75X ΙΟ,Μ、1. 5X 1(Γ10Μ 到 4. 5 X IO-10M,或不大于4. 5 X KT10M的Kd (所有都在25°C测定)结合到人FLT3_Fc融合蛋白。 优选地,抗体以 4. 5 X l(T5l/s (sec-1，1/秒)和 6 X l(T5l/s、5. 0 X l(T5l/s 和 5· 7 X l(T5l/s (所 有都在25°C下通过如本文所述的表面等离振子共振测量)的解离速率常数(Kd或k。ff)结 合到FLT3，更优选地，抗体以5. 1 X 10_5l/s和5. 6 X 10_5l/s，或者这些速率常数的10%以内 的Kd或k。ff结合到FLT3。进一步优选的是抗体以0. SXlOVsec-^l/Ms ； 1/摩尔1/秒)和5X IO5M-1Sec-1,或IX IO5M-1Sec-1和4X lOVsec"1之间的解离速率常数(所有都在25°C下 通过如本文所述的表面等离振子共振测量)结合到FLT3，更优选地，抗体1. 2 X IO5M-1Sec-1 和3. GXlO5M-1Sec-1,或这些速率常数的10%内的1或、结合到？1^3。在另一实施方案 中，抗体以解离速率常数(如通过25°C下表面等离振子共振测量)结合到FLT3，所述解离 速率常数为在相同条件下为EB10、NC7、或D4-3测定的解离速率常数的10%以内。本发明包含对FLT3特异的单克隆抗体或其片段，其包含选自表1和2中⑶R组成 的组的一个或多个CDR。在另一方面，本发明是对FLT3特异的单克隆抗体或其片段，其具有 序列为MQGTHPAIS(SEQ ID NO 9)的轻链⑶R3区。在另一方面，本发明是对FLT3特异的 单克隆抗体或其片段，其具有序列为GVGAHDAFDI (SEQ ID NO 4)的重链⑶R3。在不同的方 面，本发明是单克隆抗体或其片段，包含⑴选自EB10、NC7和D4-3的轻链可变区和(ii) 选自EB10、NC7和D4-3的重链可变区。另一方面，本发明是对FLT3特异的单克隆抗体或其 片段，其包含(i)EB10、NC7和D4-3的轻链可变区和(ii) EB10、NC7和D4-3的重链可变区， 和(iii)人免疫球蛋白G1Q1IgG1)恒定区。本发明的一方面是结合FLT3的表位的抗体或其片段，其中该表位包含高达五个 细胞外结构域(D1、D2、D3、D4和D5)，并且最少包含结构域D4或D5的一个或两个。在另一 方面，所述表位是D4。在再一方面，所述表位是D5。在本发明的一个实施方案中，抗体或抗体片段抑制FLT3的下游途径包括STAT5、 Akt、PI3K禾口 MAPK的磷酸化。一方面，本公开的抗体免疫缀合到抗肿瘤剂，包括auristatin或甲氨蝶呤。免疫 缀合物可以连接到可检测标记。另一方面是检测方法，包括将靶细胞样品与抗体或抗体片 段接触并通过检测经标记的抗体确定样品是否含有FLT3。一方面，治疗组合物有效抑制表达FLT3的瘤性细胞的生长或促进表达FLT3的人 肿瘤的消退。在其他方面，治疗组合物是当前公开的抗体和可药用的载体。本发明的另一方面是通过对哺乳动物施用有效量的抗体或其抗体片段中和哺乳 动物内FLT3的活化的方法。另一方面是抑制树突细胞活化或成熟的方法，包括将树突细胞 与有效抑制树突细胞活化或成熟量的当前公开的抗体或片段接触。本发明的另一方面是治疗哺乳动物中癌症的方法，其包括向哺乳动物施用有效量 的已述任一方面的抗体或其片段。本发明还提供了治疗血液恶性肿瘤包括白血病的方法。 在本发明中，白血病包括但不限于急性粒细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、 慢性粒细胞白血病原始细胞危象(原始细胞危象中的CML)和骨髓增生异常综合征。本发 明提供的另一种治疗方法将使用本发明抗体或其片段与施用另外抗癌剂或治疗相组合。在 一种治疗方法中，该抗癌剂是甲氨蝶呤(MXT)。因此，本受体抗体从而可以在体内和体外用于研究、诊断、预防或治疗方法，其是 本领域公知的。本文公开的本发明原理的变型可以由本领域技术人员做出并且预期此类修 饰包括在本发明的范围内。应理解并预期，本领域技术人员可对本文公开的本发明原理做出改变，并且认为 这些改变包含在本发明的范围内。随后的实施例进一步阐述本发明，但不应以任何方式理解为对本发明范围的限 制。它们不应以任何方式解释为对本发明宽范围的限制。对常规方法的详细说明可得自许多出版物，例如用于构建载体和质粒的方法，将编码多肽的基因插入这些载体和质粒 的方法，将质粒引入宿主细胞的方法，以及基因和基因产物表达和对其测定的方法，该出 fik^l^LfS Sambrook, J.等 Jk, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, HCold SpringHarbor Laboratory Press, (1989)禾口 Coligan， J.等人 Current Protocolsin Immunology, Wiley & Sons, Incorporated(1994)。人抗FLT3抗体的表达和纯化对于每种抗体，通过合适方法，例如PCR克隆，将合适的重链核苷酸序列，例如SEQ ID NO :37，38，或39 (分别针对EB10, NC7和D4-3)，置于合适的表达质粒，例如pGSHC，并将 合适的轻链核苷酸序列，例如SEQ ID NO :40，41，或42(分别针对EB10，NC7和D4-3)置于 合适的表达质粒中，例如PGSLC。为了建立稳定细胞系，通过电穿孔用线性化重链和轻链质 粒共转染合适宿主细胞系例如NSO或CHO细胞，在合适培养基例如含透析胎牛血清和谷氨 酰胺合成酶添加剂的无谷氨酰胺Dulbecco' sModified Eagle Medium中培养。通过酶联 免疫吸附测定(ELISA)针对抗体表达筛选克隆，选择最高的生产者培养于转瓶中。通过合 适方法纯化抗体，例如蛋白A亲和层析法。本发明包括重组人单克隆抗体EBlO —种靶定人FLT3受体的全长IgGl κ。它包 含亚组I的人Y-I重链和亚组II的人K轻链。通过选择对人FLT3受体的高亲和力结合 和它阻断配体与受体结合的能力，从人Fab噬菌体展示文库分离EBlOFab。表明在异种移植 模型中，EBlO通过涉及免疫效应功能活化的机理以高亲和力选择性结合到人FLT3，阻断FL 结合并介导强烈的抗肿瘤活性。本发明还包括重组人单克隆抗体NC7 —种靶定人FLT3受体的全长IgGl κ。它包 含亚组I的人Y-I重链和亚组II的人K轻链。表明NC7以高亲和力结合人FLT3并且阻 断FL结合。本发明还包括重组人单克隆抗体D4-3 —种靶定人FLT3受体的全长IgGl κ。它 包含亚组I的人Y-I重链和亚组II的人K轻链。表明D4-3以高亲和力结合人FLT3并 且阻断FL结合。表1和2提供了本发明多个⑶R的氨基酸序列和SEQ ID Ν0。除了 SEQ ID NOs 1 和12 (其使用Chothia规则确定)之外，使用Kabat规则确定所有⑶R序列。表3提供了 本发明相关的多个序列的SEQ ID N0。编码下述氨基酸序列的多核酸序列也包括在本发明 的范围内。表1 :EB10抗体重链和轻链可变区⑶R的氨基酸序列
权利要求
1.特异结合人FLT3(SEQID NO. 43)的抗体，其包含具有序列SYYMH(SEQ ID NO 2)的 CDRH1、具有序列 IINPSGGSTSYAQKFQG(SEQ ID NO :3)的CDRH2、具有序列GVGAHDAFDI (SEQ ID NO 4)或 WAAAVADY (SEQ ID NO 5)的 CDRH3、具有序列 RSSQSLLHSNGNNYLD (SEQ ID NO 6) 或 RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO 7)的 CDRL1、具有序列 LGSNRAS (SEQ ID NO 8)的 CDRL2、 具有序列 MQGTHPAIS(SEQ ID NO 9)或 MQSLQTPFT (SEQID NO 11)的 CDRL3。
2.权利要求1的抗体，其包含具有序列SYYMH(SEQID NO 2)的⑶RH1、具有序列 IINPSGGSTSYAQKFQG (SEQ ID NO 3)的 CDRH2、具有序列 GVGAHDAFDI (SEQ ID NO 4)的 CDRH3、具有序列 RSSQSLLHSNGNNYLD (SEQ ID NO 6)的 CDRLl、具有序列 LGSNRAS (SEQ ID NO: 8)的 CDRL2，和具有序列 MQGTHPAIS(SEQ ID NO 9)的 CDRL3。
3.权利要求1或2的抗体，其包含含有氨基酸序列DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSD TDFTLQISRVEAEDVGVYYCMQGTHPAISFGQGTRLEIK(SEQ ID NO 22)的 VL，和含有氨基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGG STSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGAHDAFDIWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO 19) 的VH。
4.权利要求1-3任一项的抗体，其包含含有SEQID NO :25的氨基酸序列的重链和含 有SEQ ID NO 28的氨基酸序列的轻链。
5.权利要求1-4任一项的抗体，其包含两条重链和两条轻链，每条重链包含SEQID NO 25的氨基酸序列，每条轻链包含SEQ ID NO 28的氨基酸序列。
6.权利要求1的抗体，其包含含有氨基酸序列DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDffYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPFTFGPGTKVDIK(SEQ ID NO 24)的VL，和含有氨基酸序列EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWARQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRD TSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVVAAAVADYWGQGTLVTVSS(SE Q ID NO :21)的 VH。
7.权利要求1-6中任一项的任意抗体的片段，所述片段特异性结合人FLT3。
8.分离的多核酸，其包含编码权利要求1-7任一项的抗体或片段的核苷酸序列。
9.表达载体，其包含与表达控制元件有效连接的权利要求8的多核酸，使得可表达所 编码的抗体或片段。
10.重组细胞，其包含权利要求9的表达载体，所述重组细胞能够产生权利要求1-7中 任一项的抗体或片段。
11.抗体或片段，其通过培养权利要求10的重组细胞使得产生所述抗体或片段，并从 培养物中回收所述抗体或片段来制备。
12.药物组合物，其包含权利要求1-7或11中任一项的抗体或片段，以及可药用载体、 稀释剂或赋形剂。
13.如权利要求1-7或11任一项要求保护的抗体或片段，其用作药物。
14.如权利要求1-7或11任一项要求保护的抗体或片段，其用于治疗癌症。
15.如权利要求14要求保护的抗体或片段，其中所述癌症是白血病。
16.产品，其含有权利要求1-7或11中任一项的抗体或片段，以及同时、分别或依次用于治疗的相组合的额外抗癌剂或治疗。
17.如权利要求16要求保护的产品，其中所述抗癌剂是甲氨蝶呤。
全文摘要
本发明提供了以高亲和力特异结合细胞外结构域4或5内人FLT3的完全人抗体。本发明还提供了通过施用有效量的抗体单独或者与抗癌剂或包括甲氨蝶呤的治疗的组合来治疗白血病的方法。
文档编号C12N15/13GK102046659SQ200980118935
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月28日 优先权日2008年5月30日
发明者D·瑟古拉兹, D·陆, J·R·托恩拉, Y·李 申请人:伊姆克罗尼责任有限公司