用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗的制作方法
【专利说明】
[0001 ] 本申请为国际申请日2010年4月15日、国际申请号PCT/EP2010/054991于2011年10 月17日进入中国国家阶段、申请号201080017170.0、发明名称"用于免疫接种水禽物种的重 组禽疱疹病毒载体和疫苗"的分案申请。
技术领域
[0002] 总的来说，本发明涉及免疫学和疫苗技术领域。具体来说，本发明涉及用于水禽免 疫接种的疫苗，所述疫苗基于活的重组马立克氏病病毒(在后文中称为rMDV)、更具体为火 鸡重组疱疹病毒(在后文中称为rHVT病毒），其包含编码并表达水禽病原体的抗原性肽的至 少一种核苷酸序列。还提供了免疫接种的方法。
【背景技术】
[0003] 马立克氏病病毒(MDV)是鸡的常见淋巴细胞增生性疾病--马立克氏病的病原 体。在世界范围内，马立克氏病(MD)是鸡群中高度接触传染的疾病。已经鉴定到马立克氏病 病毒(MDV)是MD的病原体。MDV在鸡中感染法氏囊来源和胸腺来源的淋巴细胞，并可能随后 诱导胸腺来源淋巴细胞的淋巴瘤。MDV是一类禽疱疹病毒的名称。例如，MDV(MDVl)是鸡中的 疱疹病毒强毒株，SB-1(MDV2)是鸡中天然减毒的疱疹病毒毒株，HVT(MDV3)是通常在火鸡中 发现的非致病性疱疹病毒。
[0004] 对于宿主范围来说，只报道了鸡和火鸡被MDV和HVT自然感染。而到目前为止，发现 其他鸟类对疾病或感染具有抵抗力。
[0005] 许多水禽鸟类例如鸭和鹅，由于被饲养以获取肉、蛋和羽毛，在经济上是重要的。 因此，对这些鸟类进行针对常见病原体的免疫接种，是提高这些家禽的质量的必要条件。此 外，作为所有已知甲型流感病毒的天然宿主的野生水禽，是在家禽中引起高致命性疾病散 在爆发的病毒的来源。最近在家禽中出现并随后在东南亚向人类传播的高致病性禽流感 (HPAI)毒株，其在家禽中的频繁爆发导致数以亿计动物的破坏，已经引起了关于致命疾病 可能大流行蔓延的顾虑。为了限制病原体的这种传播，重要的是对天然宿主即水禽进行免 疫接种。
[0006] 本申请人令人吃惊地发现，马立克氏病病毒(MDV)能够感染水禽物种，并能以潜伏 感染或持续感染的状态在被感染的水禽宿主中复制、维持和存活，从而提供了有效的免疫 接种手段。
[0007] 因此，本发明的疫苗能够实现水禽的有效免疫接种，并具有优越的免疫接种性质， 因为它们能够引起被免疫水禽宿主的长期持续的免疫。因此，有利情况下，通过给药其中插 入了外来抗原基因的重组HVT或MDV，为水禽宿主提供了足够的免疫接种效果。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了用于对水禽物种进行免疫接种的重组马立克氏病病毒(rMDV)，具体 为火鸡重组疱疹病毒(rHVT)，其包含引入到病毒基因组中的一种或多种异源或同源核苷酸 序列，所述核苷酸序列能够在水禽物种细胞中编码并表达病原体的至少一种抗原性肽，并 且还能够诱导针对在水禽中引起感染的病原体的稳定并长期持续的免疫应答。
[0009] 本发明还涉及用于对水禽物种进行免疫接种的疫苗，所述疫苗包含免疫接种有效 量的rHVT或rMDV，其任选用溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂、防腐剂和其他赋形剂配制。
[0010] 本发明还涉及对水禽物种进行免疫接种的方法和免疫接种试剂盒。
【附图说明】
[0011]图1 HVT特异性PCR的结果（样品在免疫接种后4周收集）。使用的缩写：CA-用细胞 结合的HVT疫苗免疫接种的鸭;FD-用冷冻干燥的HVT疫苗免疫接种的鸭。样品被鉴定为疫苗 缩写/取样器官。
[0012] 图2A-2D对应于同源质粒p45CMVH5HUNMod4999的核苷酸序列和推导的氨基酸序列 (SEQ ID NO:1)〇
[0013] 图3A显示了火鸡疱疹病毒(HVT)基因组的示意图，并标出了长独特序列（Unique Long)(UL)44、UL 45和UL 46基因的位置。供体基因被插入到HVT基因组中UL 45与UL 46之 间通过PCR产生的Sf i I位点中。
[0014] 图3B显示了UL 44的一部分、完整UL 45、和UL 46的一部分，其可以在HVT基因组的 1.9千碱基(kb)的EcoRV-XhoI片段上分离到。加框部分显示了在Southern印迹中，被设计与 插入位点两侧的序列结合的探针(插入位点探针或45/46探针)与1.0-kb Pvul-Pvul片段退 火的位置。
[0015] 图3C显示了分离插入位点序列的策略。
[0016]图4A显示了在由8个单链负股RNA区段构成的禽流感病毒H5亚型基因组中分离红 细胞凝集素(HA)基因。还显示了从每个区段表达的蛋白和这些蛋白的功能。
[0017] 图4B显示了使用分别向5'和3'末端添加 BamHI和Sail限制性酶位点的正向引物和 反向引物，通过反转录酶-聚合酶链反应从禽流感病毒RNA基因组扩增的HA基因。HA基因的 切割位点被改变成低致病性禽流感病毒毒株的典型的切割位点序列。切割位点的修饰通过 聚合酶链反应来进行。
[0018] 图5显示了中间质粒pGICMVpA的构建。将巨细胞病毒立即早期启动子(CMV启动子） 和SV40polyA信号序列插入到pUC18载体中。
[0019] 图6显示了同源质粒p45CMVH5HUNMod4999的构建。
[0020] 图7显示了受调控的禽流感-马立克氏病疫苗H5亚型血清型3型活马立克氏病载体 的制备。
[0021 ]图8显示了受调控的禽流感-马立克氏病疫苗H5亚型血清型3型活马立克氏病载体 的生产。
[0022] 图9显示了当用H5N1高致病性禽流感病毒进化枝2A/Duck/Hungary/1180/2006激 惹时，从重组rHVT-AI/H5疫苗在番鸭中与未免疫接种的对照鸟类相比的效能测试获得的对 比结果。
[0023]
[0024] 在本发明中，术语"重组"是指重组DNA技术，也称基因克隆或分子克隆，是指将DNA 从一种生物体转移到另一种生物体的技术。
[0025] 在本文中，术语"火鸡重组疱疹病毒"（rHVT)和/或"重组马立克氏病病毒"（rMDV) 是指现有的火鸡疱疹病毒，其基因组已通过插入至少一种异源核酸序列进行修饰，所述异 源核酸序列是指对应于与HVT或MDV中天然存在的基因的核酸序列不一致的基因或其一部 分的DNA。可选地，rHVT或rMDV可以通过在病毒基因组中引入同源核酸序列进行遗传修饰， 所述同源核酸序列是指对应于与HVT或MDV中天然存在的基因同一的基因或其一部分的 DNA。应该理解，得到的重组HVT (rHVT)和/或重组MDV (rMDV)可以通过各种方法来制造，并且 一旦制成后，可以不使用其他重组DNA技术来繁殖。因此，"火鸡重组疱疹病毒"的结构根据 DNA插入片段来描述。
[0026] 根据本发明，"水禽"物种打算是指适应于游泳、漂浮在水表面上并且在某些情况 下在浅水中潜泳的鸟类。更准确来说，水禽物种包含雁形目鸭科的鸟类，例如鸭、鹅和天鹅， 并属于鸭亚科、雁亚科、斑鸭亚科、麻鸭亚科或树鸭亚科。例如，雁形目包含约170种鸟类物 种，分成三个科：叫鸭科（叫鸭）、鹊雁科(鹊鹅)和包括超过160种水禽的鸭科。该目中的所有 物种都高度适应于在水表面处的水栖生活方式。全都在脚趾间有蹼，用于高效游泳(尽管一 些物种随后已变成主要陆生）。本发明的范围被扩展到这些宽泛的科下所覆盖的所有鸟类。
[0027] 术语"佐剂"被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。佐剂是非特异性增加 对特定抗原的免疫应答，从而减少在任何给定疫苗中所需的抗原量和/或为了产生针对目 标抗原的足够的免疫应答所需的给药频率的药剂。在本文中，佐剂被用于增强对本发明的 疫苗的免疫应答。佐剂可以在疫苗给药之前、与疫苗联合或在疫苗给药之后给药于目标动 物。
[0028] 当在本文中使用时，单词"致病的"是指由疾病或病害的生物因子对其宿主、在本 发明的情况下具体为水禽宿主造成的。
[0029] 当在本文中使用时，术语"非翻译区"是指不具有0RF或不定义通过翻译进行表达 的蛋白的氨基酸序列的核苷酸区域，以及其中0RF不参与任何转录、翻译或蛋白表达的核苷 酸区域。该区域中包含的核苷酸序列可能是具有碱基取代、缺失或添加的核苷酸序列，除非 它们包含0RF。
【具体实施方式】
[0030] 因此，本发明提供了用于免疫接种水禽物种的重组马立克氏病病毒(rMDV)、具体 为火鸡重组疱疹病毒(rHVT)，其包含插入到病毒基因组中，能够编码并在水禽物种细胞中 表达病原体的至少一种抗原性肽，并且还能在水禽中诱导针对引起感染的病原体的稳定和 长期持续的免疫应答的一种或多种异源或同源的核苷酸序列。
[0031] 只要对水禽是非致病的，任何马立克氏病病毒（MDV)(例如血清型1、2、3型、 CVI988、SB1等)或具体的火鸡疱疹病毒(HVT)都可以使用在本发明中。因此，用于本发明的 MDV和HVT可以包括但不限于天然存在的或可以从保藏中心例如ATCC、CNCM等获得的，例如 FC126(ATCC VR-584B)、PB-THVl、H-2、YT-7、WTHV-l或EPRS-26毒株适合用作骨架病毒。其 中，由于在禽类中使用安全，FC126最优选用于本发明中。
[0032]用于插入到HVT或MDV基因组中的目标基因，可以是从能够在水禽物种中引起感染 的任何致病性生物体获得的同源或异源核苷酸序列。典型情况下，目标基因可以源自于引 起对家禽工业具有经济影响的疾病的病原体。目标基因也可以源自于在水禽中维持并通过 水禽宿主传播到其他家禽和非家禽物种的病原体。基因还可以源自于已存在现有疫苗，但 是由于载体化技术的新优势而使源自HVT或MDV的疫苗对其更优越的生物体。此外，目标基 因可以源自于目前还不存在针对其的疫苗，但是为了控制疾病而存在需求的病原体。典型 情况下，目标基因编码病原体的免疫原性肽，并且优选为表面蛋白、分泌蛋白和结构蛋白。 [0033]因此，用于插入到MDV或HVT基因组中的同源或异源核苷酸序列可以是编码水禽病 原体的抗原性肽的任何序列。本发明的核酸序列可以源自于任何来源，例如病毒、原核生 物、真核生物或合成来源。所述核酸序列可以源自于在插入到病毒基因组中之后能够稳定 表达以诱导针对水禽疾病的免疫力的病原体，优选为水禽物种的病原体。
[0034] 异源或同源核苷酸序列可以编码例如源自下列物种的抗原性肽:禽流感病毒、1型 禽副粘病毒(新城疫病毒，NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、禽肾病病毒(传染性法氏囊 病病毒：IBDV)、鹳和番鸭细小病毒、鸭病毒性肠炎疱疹病毒、鹳疱疹病毒、鸭甲型、乙型和丙 型肝炎病毒、鹅出血性多瘤病毒、鸭和鹅腺病毒、鹅和鸭圆环病毒、西尼罗病毒、鹅和番鸭呼 肠孤病毒、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)物种、多杀巴氏杆 菌(Pasteurella multocida)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、鼻气管鸟杆 菌（Ornithobacterium rhinotracheale)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、鸡滑 液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、感染水禽物种的支原体微生物或球虫。
[0035] 在第一个实施方案中，这样的异源或同源核苷酸序列可以是例如流感病毒的表面 蛋白红细胞凝集素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)、马立克氏病病毒的蛋白、特别是gB、gC、gD、 gH和/或gL蛋白、新城疫病毒的F和/或HN蛋白、鹅和番鸭细小病毒的VP1、VP2和/或VP3蛋白、 鹅和番鸭呼肠孤病毒的任何结构蛋白、鹅出血性多瘤病毒的VP1蛋白、鹅和番鸭病毒性肠炎 疱疹病毒的抗原、鸭和鹅腺病毒的抗原、圆环病毒的衣壳蛋白或IBDV的VP2蛋白。
[0036]在另一个具体实施方案中，这样的异源或同源核苷酸可以编码US6,936,707中所 述的未糖基化的NXB氨基酸序列，其中N是天冬酰胺，X是脯氨酸之外的任何氨基酸，B是苏氨 酸，并且其能够表现出高免疫原性。
[0037]在另一个实施方案中，异源或同源核苷酸序列也可以是融合蛋白，其包含具有鸡 毒支原体的抗原性的肽和源自于疱疹病毒外膜蛋白的肽，如US 7，348，422中所述。
[0038]在另一个优选实施方案中，rHVT或rMDV还可以包含第二个异源核苷酸序列，其编 码第二种抗原或免疫调节剂例如淋巴因子、干扰素或禽类细胞因子。
[0039]为了构建本发明的重组MDV或HVT病毒，首先将上述病毒在适合的宿主细胞中繁 殖，然后获得基因组DNA。用于繁殖病毒的宿主和条件根据需要来选择。作为宿主细胞，源自 于鸡的细胞是优选的，并且可以使用CEF(鸡胚成纤维细胞）、鸡肾细胞等。它可以在培养基 例如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中，在约37°C下培养3至4 天。
[0040] 按照常规方法从如上培养的病毒感染的细胞中提取DNA。因此，将单层生长的细胞 刮下，然后离心以收获上清液。在将蛋白在裂解缓冲液中变性并移除后，使用苯酚和乙醇提 取 DNA。
[0041] 基因克隆和质粒构建对于本领域的普通专业人员来说是公知的，并可以基本上通 过标准的分子生物学技术来进行（《分子克隆实验指南》（Molecular Cloning:A Laboratory Manual ·)第三片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press , Woodbury , N.Y. 2001)。用于插入到病毒中的序列可以源自于任何适合的质粒、粘粒或噬菌体，质粒是 最优选的，并且含有至少一种异源或同源核酸序列，其如果需要，与启动子可操作连接。 [0042]所使用的启动子可以是合成或天然的、内源或异源的启动子，对此没有限制，只要 它能够在用rHVT或rMDV感染的水禽细胞中有效发挥作用即可。因此，启动子的