CSpolyASfi的Pstl-Xbal位点中，以构建pCMV。
[0114] 实施例10:pCMV_HN的构建
[0115] (1)从pCMV的CMV启动子中删除Bgll位点
[0116] 因为在pCMV的CMV启动子中存在3个Bgll位点，因此如下所述执行PCR来引入突变， 以便删除Bgll位点。突变以下述方式进行。
[0117] 使用在实施例9中构建的pCMV(lOOng)作为模板，在与实施例6中相同的条件下，使 用由引物7与引物8构成的引物组E和由M13P7引物（由Toyoboseki Co .，Ltd.制造)与引物9 构成的引物组F进行PCR。获得了约10yg的每种扩增产物。
[0118] 将使用上述两个引物组获得的扩增产物(每种100ng)以1:1的混合比例混合。使用 该混合物作为模板，使用M13P7引物和引物8如实施例2中所述进行PCR，获得约10yg PCR产 物⑴。
[0119] 类似地，以pCMV(1 OOng)为模板，使用由引物10与引物11 (GGCATAATGC ATGGCGGGCC AT;SEQIDN0:17)构成的引物组E和引物12(ATGGCCCGCCATGCATTATGCC;SEQIDN0:18)与 M13P7引物（由Toyoboseki Co.，Ltd.制造），如实施例2中所述进行PCR。
[0120] 类似地，使用这两个引物组的产物各100ng的1:1混合物作为模板进行PCR，这次使 用引物10和Ml3P8引物，以获得约1 Oyg PCR产物(2)。
[0121] 此外，将PCR产物（1)与PCR产物⑵混合。然后使用M13P7引物和M13P8引物如实施 例6中所述进行PCR，以获得其中Bgl I位点被删除的CMV启动子。
[0122] (2)pUCCMV 的构建
[0123] 此外，如实施例6中所述将pBK-CMV的含有CMV启动子的约600bp Nsil-Nhel片段插 入到pUC19的Pstl-Xbal位点中，以构建pUCCMV。
[0124] (3)pNZ87 的构建
[0125] (3-1)其中β-半乳糖苷酶基因与7.5K启动子相连的质粒(pNZ76)的构建
[0126] 在用BamHI消化 10yg pMAOOl (Shirakawa等，Gene · 28:127-( 1984))后，将其用苯 酚:氯仿（1:1)提取，然后进行乙醇沉淀，以收集β-半乳糖苷酶基因（约3.3kb)。
[0127] 另一方面，在用BamHI消化0.3yg pUC19后，将其用苯酚:氯仿提取，然后进行乙醇 沉淀。将产物与如上所述制备的β-半乳糖苷酶基因连接，以产生杂交质粒PNZ66。
[0128] 将40yg pUWP-Ι(含有编码痘苗病毒WR株7.5KDa肽的DNA的启动子的质粒）用Hpall 和EcoRI消化，进行1.5 %低熔点琼脂糖凝胶电泳(70V，6小时）以分离含有7.5K启动子的约 0.26kb片段，然后将其用苯酚:氯仿（1:1)提取，并用乙醇沉淀以收集DNA。使用DNA聚合酶将 DNA片段的粘性末端平端化。在用Hindi消化0.3yg pNZ66后，将其用苯酚:氯仿提取，然后 进行乙醇沉淀以收集片段，将其与上面提到的约0.26kb的7.5K启动子基因连接，并将获得 的杂交质粒命名为PNZ76。
[0129] (4)杂交质粒pNZ87的构建
[0130]将其中来自杂交噬菌体mpl〇-HN180的启动子和NDV的HN基因的DNA已被连接到启 动子PNZ76的控制之下的载体用BamHI消化，然后对其进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，以收集不 含β-半乳糖苷酶基因的约2.9kb片段。
[0131] 另一方面，在用Bglll和BamHI消化杂交噬菌体mpl〇-HN180后，从0.8%琼脂糖凝胶 收集约1.8kb的NH基因的DNA片段。通过连接酶将两个片段连接。将获得的质粒用于转化大 肠杆菌YG-1菌株感受态细胞，并使用常规方法提取质粒。检测到含有HN基因的杂交质粒，其 被命名为PNZ87。
[0132] (5)pNZ87CMV 的构建
[0133] 然后，从(3)中构建的pNZ87切下含有N0V的HN基因的约1.8kb BamHI-SacI片段。如 实施例6中所述将该片段插入到pUCCMV的BamHI-SacI位点中，以构建pNZ87CMV。
[0134] 因为pNZ87CMV在启动子区中具有Bgll位点，将含有CMV启动子的Hindlll-BamHI片 段用（1)中描述的PCR构建的不含Bgll位点的CMV启动子的Hindin-BamHI片段替换，以构建 pCMV-HN(BglF)〇
[0135] 实施例11:RSV_F的构建
[0136] (l)pUCRSV-pA 的构建
[0137] 将含有pBK-RSV(STRATAGENE)的RSV启动子的约600bp的Nsil-Nhel片段如实施例6 中所述插入到PUC19的Pstl-Xbal位点中，以构建pUCRSV。单独地，以pBK-RSV(STRATAGENE， l〇〇ng)为模板，如实施例2中所述使用引物 13(CGGGAGCTCT AATTGTTTGT G;SEQ ID N0:19) 和引物 14(CGGGAATTCG CTTACAATTT;SEQ ID N0:20)(各50pmol)进行PCR，以获得具有包含 在pBK-RSV中的SV40启动子的pA添加信号的片段。将PCR扩增的片段用SacI和EcoRI双消化， 并如实施例6中所述插入到pUCRSV的SacI-EcoRI位点中，以构建pUCRSV-pA。
[0138] (2)pNZ98 的构建
[0139] 使用了含有NDV的F基因和HN基因的质粒XLIII-10H(Virus Research，7:214-255 (1987))〇
[0140] 将4yg质粒XLIII-10H用Xbal消化，并且在将得到的粘性末端用DNA聚合酶平端化 后，将其用苯酸:氯仿（1:1)进行提取，并通过乙醇沉淀来收集。将收集到的DNA用BamHI消 化，进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，以收集含有约2. lkb的完整F基因的片段。
[0141] 另一方面，将如上产生的pNZ76用BamHI和Smal双消化，以收集缺少lacZ基因部分 的约3.0kb BamHI-Smal片段。将收集的片段与含有约2.1kb完整F基因的片段通过连接酶进 行连接，转化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞。
[0142] 通过与上述相似的步骤，从在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上生长的菌 落制备质粒。将质粒用限制性酶(BamHI和Smal)切开，所需克隆得到验证，并命名为pNZ98'。 该PNZ98 '含有全长F基因和NH基因的约300bp 5 ' -末端。为了移除这一部分，将pNZ98 '用 SmaI和ΚρηI双消化，并通过0.8 %琼脂糖凝胶电泳收集约4，150bp SmaI-ΚρηI片段。也将 ρΝΖ98'用Smal和Avail双消化，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳收集约650bp Smal-Avall片 段。
[0143] 将这两种片段混合，并使用DNA聚合酶将得到的粘性末端平端化。然后使用产物转 化大肠杆菌TG1以获得转化子。转化子生长在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。 从形成的菌落如上所述获得质粒。将质粒再次用Smal消化，并选择切开的质粒以获得 pNZ98。
[0144] (3)从上述(2)中构建的pNZ98切下含有NDV的F基因的约1.8kb BamHI-SacI片段， 然后如实施例6中所述将其插入到pUCRSV-pA的BamHI-SacI位点中，以构建pNZ98RSV3。还将 PNZ98用PstI切开并用BamHI部分消化以获得125bp片段。用收集到的片段代替pNZ98RSV3' 中包含的75bp Pstl-BamHI片段，以构建pNZ98RSVpA。将在实施例5中构建的pRSV的2,892bp MluI-SacI切割片段与pNZ98RSvpA的NDV的F基因的2,262bp MluI-SacI切割片段连接，以构 建pRSV-F。
[0145] 实施例12:pCMV_VP2S的构建
[0146] (l)pCMV/MCS 的构建
[0147] 在实施例 10中构建的pCMV_HN(BglI-)的BamHI-Kpnl位点中，插入pBluescript SK +的62bp的BamHI-Kpnl片段，以构建pCMV/MCS。
[0148] (2)pCMV/MCSpA 的构建
[0149] 独立地，以pBK-RSV(STRATAGENE)为模板，使用引物15(CCGGGGCCCT AATTGTTTGT G;SEQIDN0:21)和引物16(CGGGGTACCGCTTACAATTT ;SEQIDN0:22)，如实施例6中所述进 行PCR，以获得具有SV40的pA添加信号的片段。
[0150] 将PCR扩增的片段用Apal和ΚρηΙ进行双消化，并如实施例6中所述插入到pCMV/MCS 的Apal-Kpnl位点中，以构建pCMV/MCSpA。
[0151] (3)pCMV_VP2S 的构建
[0152] 此外，按照常规方法从IBDV野外分离的Okayama毒株提取RNA。使用反转录酶和 cDNA合成试剂盒（由Takara Shuzo制造），使用RNA产生cDNA。
[0153] 以该cDNA为模板，根据与日本未经审查的专利出版物(Kokai)No.62-503006中提 出的基因序列的VP2对应的区域，设计了引物17(GCAAGCTTGC GATGACGAAC CTGC;SEQ ID N0:23)和引物 18(GCGTCGACTC ACCTCCTTAG GGCCC;SEQ ID N0:24)。
[0154] 使用这两种引物，按照实施例6中所述进行PCR，以获得对应于IBDV的VP2的区域。 独立地，将pCMV/MCSpA用Hindlll部分消化，然后用Sail部分消化，以获得3,687bp片段。将 通过上述PCR获得的IBDV片段用Hindlll和Sail双消化，然后如实施例6中所述插入到3， 687bp片段中，以构建pCMV-VP2S。
[0155] 实施例13:pUC18Xlac的构建
[0156] 如实施例6中所述，将lacZ的BamHI-SacI片段（Yanagida等，J.Virol · ,66:1402-1408(1992))插入到在实施例8中构建的?1]18乂6的8&111!11-311^1位点中，以构建?1](：18乂13(3。
[0157] 实施例 14:pNZ45/46RSVlac 和 pNZ44/45RSVlac 的构建
[0158] (l)pNZ45/46RSVlac 的构建
[0159] 在实施例6中构建的pNZ45/46Sf i的Sf iI位点中，插入在实施例9中构建的含有RSV 启动子的pRSV的Bgll片段中，以构建pNZ45/46RSV。在pNZ45/46RSV的Sfi位点中，插入在实 施例13中构建的含有lacZ的pUC18Xlac的Bgll片段，以构建pNZ45/46RSVlac。
[0160] (2)pNZ44/45RSVlac 的构建
[0161] 类似地，在实施例7中构建的pNZ44/45Sfi的Sfil位点中，插入在实施例9中构建的 含有RSV启动子的pRSV的Bgll片段，以构建pNZ45/46RSV。在pNZ44/45RSV的Sfil位点中，插 入在实施例13中构建的含有lacZ的pUC18Xlac的Bgll片段，以构建pNZ44/45RSVlac。
[0162] 实施例 15: pNZ45/46VP2S 和 pNZ44/45VP2S 的构建
[0163] (l)pNZ45/46VP2S 的构建
[0164] 在实施例14中构建的pNZ45/46RSVlac的Sfil位点中，如实施例6中所述插入在实 施例12中构建的含有IBDV的VP2基因的pCMV-VP2S(0kayama)的Bgll片段，以构建pNZ45/ 46VP2S。
[0165] (2)pNZ44/45VP2S 的构建
[0166] 类似地，在实施例14中构建的pNZ44/45RSVlac的Sfil位点中，如实施例6中所述插 入在实施例12中构建的含有IBDV的VP2基因的pCMV-VP2S(0kayama)的Bgll片段，以构建 PNZ44/45VP2S。
[0167] 实施例 16:pNZ45/46HNF 和 pNZ44/45HNF 的构建
[0168] (l)pNZ45/46HNF 的构建
[0169] 在实施例14中构建的pNZ45/46RSVlac的Sfil位点中，如实施例6中所述插入在实 施例10中构建的含有NDV的HN基因的pCMV-HN(Bgir)的Bgll片段，以构建PNZ45/46HN。此 外，在PNZ45/46HN的Sf Π 位点中，插入在实施例11中构建的含有NDV的F基因的pRSV-F的 Bgll片段，以构建PNZ45/46HNF。
[0170] (2)pNZ44/45HNF 的构建
[0171] 类似地，在实施例14中构建的pNZ45/45RSVlac的Sf iI位点中，插入在实施例10中 构建的含有NDV的HN基因的pCMV-SN(BglI - )的Bgll片段，以构建pNZ44/45HN。此外，在 PNZ44/45HN的Sf iI位点中，插入在实施例11中构建的含有NDV的F基因的pRSV-F的BglI片 段，以构建PNZ44/45HNF。
[0172] 实施例 17:pNZ45/46HNF-VP25 和 pNZ44/45VP2S-HNF 的构建
[0173] (l)pNZ45/46HNF_VP2S 的构建
[0174] 在实施例16中构建的pNZ45/4